熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC對利福平、異煙肼耐藥性的價值分析

溫曉萍

【摘要】? 目的? ? 探討熒光PCR探針熔解曲線法檢測結核分枝桿菌復合菌群（MTBC）對利福平、異煙肼耐藥性的價值。方法? ? 回顧性分析2018年6月—2021年4月惠州市職業(yè)病防治院收治的528例肺結核與耐多藥結核病患者的臨床資料。所有患者均進行痰液標本采集，采集后進行送檢，之后進行分離培養(yǎng)和藥敏試驗，采用熒光PCR探針熔解曲線法對MTBC對利福平、異煙肼的耐藥性進行測定分析，最終獲得211份陽性菌株，再經鑒定為MTBC 208份，3份為非結核分枝桿菌。對熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC耐藥性的效能進行分析。結果? ? 經比例法進行的藥敏試驗結果顯示，208份MTBC菌種標本中，120份對利福平具有耐藥性，146例對異煙肼具有耐藥性；經熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，135份對利福平耐藥，敏感73份，其中僅有114份確定對利福平具有耐藥性；經熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，134份對異煙肼耐藥，敏感74份，其中有131份確定對異煙肼具有耐藥性。熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC對利福平、異煙肼耐藥性的特異度分別為76.14%，95.16%，對異煙肼耐藥性的檢測特異度高于利福平，差異具備統(tǒng)計學意義（P<0.05）；對異煙肼耐藥性的檢測靈敏度低于利福平，準確度高于利福平，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論? ? 熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC耐藥性的效能較高，可應用于快速發(fā)現耐藥基因位點突變，篩查耐多藥肺結核，并在治療中進行動態(tài)監(jiān)測，進而可指導臨床調整治療方案。

【關鍵詞】? 結核分枝桿菌復合菌群； 熒光聚合酶鏈式反應； 探針熔解曲線法； 利福平； 異煙肼； 耐藥性

中圖分類號：R446? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：1672-1721（2023）16-0101-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.16.034

臨床中結核病屬于一種多發(fā)疾病，其主要是因為感染結核分枝桿菌導致，為嚴重威脅人類健康的傳染性疾病。結核病的主要傳播途徑為飛沫傳染，在人口密集大、人口流動大的公共場所中極易傳播，所以積防治結核病具有十分重要的意義。臨床呼吸內科中，重癥結核病屬于一種常見疾病，具有較高的發(fā)生率和病死率，需及時采取有效的治療措施，從而降低患者的病死率。結核病主要經呼吸道飛沫傳播所致，主要癥狀包括咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、呼吸困難、長期午后潮熱等，部分患者會有倦怠乏力、盜汗、食欲減退和體重減輕等癥狀[1]。結核分枝桿菌包括麻風分枝桿菌、非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌復合菌群（MTBC），其中MTBC又包含人型結核分枝桿菌、鼠型分枝桿菌、牛型分枝桿菌等，MTBC可侵犯整個身體的各個器官，以肺部最為多見[2]。由于目前我國的結核病感染者數量較多，且發(fā)病率、病死率及耐藥率均處于較高水平。因此，探究MTBC對各類結核病的常用藥，如利福平、異煙肼的耐藥性，對于結核病的防治具有深遠意義[3]。熒光聚合酶鏈式反應（PCR）探針熔解曲線法可快速檢測出MTBC的藥敏結果，具有較高的操作靈活性[4]。本研究旨在探討熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC對利福平、異煙肼耐藥性的價值，報道如下。

1? ? 資料與方法

1.1? ? 一般資料? ? 回顧性分析2018年6月—2021年4月惠州市職業(yè)病防治院收治的528例肺結核與耐多藥結核病患者的臨床資料，男289例，女239例，年齡31～67歲，平均年齡（44.67±5.91）歲。診斷標準：以《臨床診療指南·結核病分冊》[5]中的相關診斷標準作為參照。納入標準：滿足上述診斷標準者；非精神疾病，可進行正常溝通；無嚴重心、肝等功能異常等。排除標準：合并腦腫瘤者；依從性差者；存在免疫功能障礙者；存在造血系統(tǒng)功能異常者；對研究所用藥物過敏者等。

1.2? ? 方法? ? 所有患者均進行痰液標本采集，采集后進行送檢，嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[6]進行分離培養(yǎng)。使用至善全自動細菌鑒定及藥敏分析儀進行菌種鑒定及藥敏試驗。使用比例法檢測MTBC對利福平、異煙肼的耐藥性，并按照2004年美國臨床和實驗室標準化委員會藥敏試驗判斷標準進行藥敏試驗；參照抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準推薦的篩選試驗和確證試驗進行超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）檢測，所用質控菌株均采購自原衛(wèi)生部臨床檢驗中心。之后采用熒光PCR探針溶解曲線法MTBC對利福平、異煙肼的耐藥性進行測定分析，最終獲得211份陽性菌株，再經鑒定為MTBC 208份，3份為非結核分枝桿菌。

1.3? ? 觀察指標? ? （1）熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC對利福平、異煙肼的耐藥性結果。（2）熒光PCR探針熔解曲線法與金標準的檢出結果比較，其中金標準為比例法藥敏試驗。（3）熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC耐藥性的效能，包括特異度=真敏感例數/（假耐藥+真敏感）例數×100%，靈敏度=真耐藥例數/（真耐藥+假敏感）例數×100%，準確度=（真耐藥+真敏感）例數/總例數×100%。

1.4? ? 統(tǒng)計學方法? ? 使用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計數資料以百分比表示，采用χ²檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? ? 結果

2.1? ? 熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC對利福平、異煙肼的耐藥性結果? ? 經比例法進行的藥敏試驗結果顯示，208份MTBC菌種標本中，120份對利福平具有耐藥性，146份對異煙肼具有耐藥性。經熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，135份對利福平耐藥，敏感73份，其中僅有114份確定對利福平具有耐藥性；經熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，134份對異煙肼耐藥，敏感74份，其中有131份確定對異煙肼具有耐藥性，見表1。

2.2? ? 熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC耐藥性的效能? ? 熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC對利福平、異煙肼耐藥性的特異度分別為76.14%，95.16%，對異煙肼耐藥性的檢測特異度高于利福平，差異具備統(tǒng)計學意義（P<0.05）；對異煙肼耐藥性的檢測靈敏度低于利福平，準確度高于利福平，但差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

3? ? 討論

結核病是由于結核桿菌感染人體所導致，根據感染部位的不同，可分為肺結核、淋巴結核、骨骼結核，且腎臟等其他部位也有可能感染結核[7]。具體而言，結核桿菌會入侵人體多個臟器官，其中肺部為主要累及部位，所以通常將其稱之為肺結核。肺結核以青年人為主要高發(fā)人群，具有慢性和緩發(fā)傳染病的特點，四季均可能發(fā)病，潛伏期在4～8周之間，除了感染肺部外，還可能感染骨骼、皮膚、腸、腹膜、腦膜以及頸淋巴等[7]。人和人之間的傳播方式主要為呼吸道傳染，傳染源是接觸到已經被感染的肺結核患者。近幾年來，隨著環(huán)境污染問題的日益嚴重和艾滋病傳播率上升等多種因素的影響，結核病的發(fā)生率呈現出逐年上升趨勢。結核病的臨床表現以呼吸系統(tǒng)癥狀為主，如咳嗽、咯血等，同時伴隨全身癥狀，如乏力、低熱等?？菇Y核藥物包括異煙肼、利福平、吡嗪酰胺及乙胺丁醇等[8-9]，但隨著抗結核藥物的使用，有耐藥性的結核病患者數量逐漸增加。當患者同時至少對兩種一線抗結核藥物——利福平和異煙肼均出現耐藥性，即被稱為耐多藥結核病[10]。傳統(tǒng)MTBC耐藥性的檢測方法為絕對濃度法，不僅操作繁瑣、耗時較長，同時對菌株分離培養(yǎng)的速度慢，進而影響對MTBC耐藥性的診斷結果[11]。

熒光PCR探針熔解曲線法是目前廣泛應用于食源性致病菌檢測的方法，是一種體外核酸擴增技術，以DNA為模板，在體外合適條件下和耐熱DNA聚合酶作用下，對人工合成的寡核苷酸為引物進行特異性擴增目的DNA片段。傳統(tǒng)方法檢測致病菌檢出限僅為104 cfu/mL，而大多數PCR體系的檢出限可達到10～104 cfu/mL，具有較高的靈敏度[12]。本研究結果顯示，經比例法進行的藥敏試驗結果顯示，208份MTBC菌種標本中，120份對利福平具有耐藥性，146例對異煙肼具有耐藥性。經熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，135份對利福平耐藥，敏感73份，其中有114份確定對利福平具有耐藥性；經熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，134份對異煙肼耐藥，敏感74份，其中有131份確定對異煙肼具有耐藥性。熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC對利福平、異煙肼耐藥性的特異度分別為76.14%，95.16%，對異煙肼耐藥性的檢測特異度高于利福平，差異具備統(tǒng)計學意義（P<0.05）；對異煙肼耐藥性的檢測靈敏度低于利福平，準確度高于利福平，但差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。分析原因可能為：在MTBC對異煙肼的耐藥性檢測中，可覆蓋接近90%的異煙肼耐藥性菌株，要多于利福平，與郭紅革等[13]研究結論相符。

綜上所述，經熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC耐藥性的效能較高，可應用于快速發(fā)現耐藥基因位點突變，篩查耐多藥肺結核，并在治療中進行動態(tài)監(jiān)測，進而可指導臨床調整治療方案。但本研究未對敏感結核分枝桿菌菌株進行檢測，且未明確有無外源性再感染情況發(fā)生，還需進行多中心的深入研究。

參考文獻

[1]? ? 劉宇，吳利先.Xpert MTB/RIF在結核病診斷中的研究進展[J].中國病原生物學雜志，2017，12（8）：800-802.

[2]? ? 李君蓮.RNA恒溫擴增技術快速檢測痰標本中結核分枝桿菌的研究[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2017，14（1）：68-70.

[3]? ? 賈慶軍，謝立，吳亦斐，等.杭州市結核病患者耐藥檢測結果分析[J].預防醫(yī)學，2019，31（3）：289-292.

[4]? ? CHEN DANNI，HAN YINGYING，LI JIE，et al.Rapid detection of Salmonella in human and animal feces using real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction[J].Disease Surveillance，2020，35（2）：64-68.

[5]? ? 中華醫(yī)學會.臨床診療指南·結核病分冊[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：66.

[6]? ? 尚紅，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，2015： 125-128.

[7]? ? ZHENG ZHEN，HUANG HAI，ZOU YI，et al.Application of anti-tuberculosis antibody and tuberculosis infection T cell spot test in the diagnosis of tuberculosis[J].Chinese Journal of Nosocomiology，2016，26（10）：2232-2234.

[8]? ? 林礪，李海波，夏凡，等.血漿外泌體來源的miRNA-323a-3p作為結核病潛在生物標志物的評估[J].上海交通大學學報（醫(yī)學版），2020，40（2）：34-42.

[9]? ? 周云泵，陳嬋，林珍.結核病患者發(fā)生耐藥性危險因素分析及對策研究[J].實用預防醫(yī)學，2016，23（5）：601-602.

[10]? ? 呂德良，楊應周，譚衛(wèi)國，等.深圳市耐多藥結核病治療轉歸分析[J].中國熱帶醫(yī)學，2016，16（7）：649-652.

[11]? ? LIU YINPING，WANG JIE，ZHANG JUNXIAN，et al.Detection of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis resistant to isoniazid and propylthioamide and study on related gene mutations[J].Chinese Journal of Tuberculosis，2016，10（9）：718-721.

[12]? ? WU HUINA，SUN FUSHENG，LIU QINGWEN，et al.The value of fluorescence PCR probe melting curve method in detecting the resistance of Mycobacterium tuberculosis complex to rifampicin and isoniazid[J].Chinese Journal of Tuberculosis，2019，41（1）：74-79.

[13]? ? 郭紅革，李佩珠.熒光PCR探針熔解曲線法評價結核分枝桿菌復合群對利福平和異煙肼耐藥性的價值[J].深圳中西醫(yī)結合雜志，2021，31（10）：46-48.

（收稿日期：2023-03-11）