健肝散體外對拉米夫定耐藥株病毒表達(dá)抑制及增敏作用的研究

李 堃,葛 飛,孫茂秋,嚴(yán)展鵬,仲 婕,季 瑜,朱方石

(1.海安市中醫(yī)院脾胃病科,江蘇 海安 226600;2.江蘇省中醫(yī)藥研究院中西醫(yī)結(jié)合臨床研究室,江蘇 南京 210046)

慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)是感染乙肝病毒(Hepatitis B,HBV)后形成的慢性肝炎,是嚴(yán)重影響人類健康的慢性傳染性疾病,遷延不愈會導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化[1],抗病毒是治療CHB最有效的治療方法,而核苷(酸)類似物[Nucleos(t)ide analogues,NAs]被認(rèn)為是首選抗病毒藥物,然而在長期臨床實(shí)踐中NAs耐藥是一直存在且難以避免的棘手問題。健肝散(Jiangan powder,JGP)為海安市中醫(yī)院院內(nèi)制劑,臨床用于肝郁脾虛型慢性肝病尤其是CHB的治療,收效顯著,臨床實(shí)踐中我們觀察到JGP在緩解肝功能、降低抗病毒藥物耐藥方面具有一定優(yōu)勢。課題組前期相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)健肝散對拉米夫定(Lamivudine,LMV)誘發(fā)的乙型肝炎病毒酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)變異起到顯著抑制作用[2]。本研究以JGP含藥血清干預(yù)穩(wěn)定表達(dá)HBV病毒的人肝癌細(xì)胞——HepG2.2.15細(xì)胞構(gòu)建的LMV耐藥株細(xì)胞模型,觀察其對耐藥株對LMV作用敏感性及病毒表達(dá)水平的影響,驗(yàn)證JGP體外對LMV耐藥的抑制、增敏作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動物及細(xì)胞株:雄性SD大鼠,體重200 g左右,空調(diào)下架式籠養(yǎng),環(huán)境適宜,正常飼養(yǎng)1周;HepG2.2.15細(xì)胞株(賽百慷)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑:引物(擎科生物),氯仿(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司),無RNase水(Biteke Gorporation),DEPC(美國AMRESCO公司),TRIzol Reagent(Ambion),SweScript-First-strand-cDNA-Synthesis-kit(Servicebio,MPC2210019),2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix(Servicebio,MPC2208017),胎牛血清(Gibco公司),100×青霉素-鏈霉素溶液(上海生工生物工程有限公司),PBS(Solarbio公司),胰酶(Invitrogen公司),MEM培養(yǎng)基(美倫生物),DMSO(Solarbio),人乙型肝炎E抗原(HBeAg)ELISA檢測試劑盒(上海酶研生物科技有限公司,EK-H12435),人乙型肝炎S抗原(HBsAg)ELISA檢測試劑盒(上海酶研生物科技有限公司,EK-H12030),血球計(jì)數(shù)板(美國Hausser Scientific公司),0.2 ml/1.5 ml EP管(Axygen公司),拉米夫定(IL0020)(Solarbio)。

1.1.3 主要儀器:高速低溫離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司),電子分析天平(天津精科天平廠),高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司),2720 Thermal Cycler 普通PCR儀(Applied Biosystems),CFX96實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀(Bio-Rad),冷凍高速離心機(jī)(Thermo公司),掌上瞬時(shí)離心機(jī)(大龍DragonLab),渦旋振蕩器(大龍DragonLab),微量加樣器(德國eppendorf公司),酶標(biāo)檢測儀(BioTeK),96孔板離心機(jī)(LABGIC),CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司),低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司),倒置顯微鏡(Motic公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HepG2.2.15細(xì)胞的培養(yǎng):細(xì)胞用含有胎牛血清的MEM完全培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3天換液,約鋪滿T-25培養(yǎng)瓶底70%～80%以1∶3傳代。

1.2.2 健肝散含藥血清制備:健肝散含藥血清制備根據(jù)“人和動物間體表面積折算等效劑量比值表”:70 kg人與200 g大鼠的等效計(jì)量比為56.0,正常成年人服用中藥復(fù)方JGP每日生藥量120 g,計(jì)算后大鼠生藥用量為10.71 g/(kg·d),設(shè)置JGP煎藥劑量組按照10.71 g/(kg·d)灌胃SD大鼠,每天2次,連續(xù)灌胃7 d后于胸左側(cè)第3～4肋間,心搏最強(qiáng)處穿刺取血,離心收集血清并滅活,用0.22 μm微孔濾器獲得含藥血清-20 ℃保存。

1.2.3 CCK8檢測JGP含藥血清對HepG2.2.15細(xì)胞增殖的影響:細(xì)胞復(fù)蘇及傳代同1.2.1。取對數(shù)生長期HepG2.2.15細(xì)胞的敏感株進(jìn)行胰蛋白酶消化計(jì)數(shù),分別用0%、5%、10%、20%、30%、50%、70%、80%、100% JGP含藥血清的完全培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋并做好標(biāo)記,并轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液到96孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)目相同,設(shè)置時(shí)間梯度24、48 h。細(xì)胞貼壁后24 h及48 h隨機(jī)取板(0%、5%、10%、20%、30%、50%、70%、80%、100%各1塊),向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加10 μl CCK-8試劑并進(jìn)行孵育2.5 h后,測定細(xì)胞培養(yǎng)液450 nm處的OD讀數(shù),并記錄數(shù)據(jù),每組重復(fù)5次,用Graph Pad Prism軟件繪制圖表。

1.2.4 LMV耐藥細(xì)胞株構(gòu)建:采用藥物濃度遞增法,取對數(shù)生長期HepG2.2.15細(xì)胞(匯合度60%～80%),加入起始濃度為5 μg/ml的LMV作用24 h,棄去培養(yǎng)液,PBS清洗2遍,更換不含LMV的培養(yǎng)液,待細(xì)胞生長后,消化細(xì)胞傳代,再以5 μg/ml的藥物濃度培養(yǎng),如此重復(fù)3次藥物沖擊;待細(xì)胞穩(wěn)定生長后,逐漸增加藥物濃度,每個(gè)濃度重復(fù)3次沖擊培養(yǎng),如此持續(xù)耐藥大約2個(gè)月,直到細(xì)胞能夠穩(wěn)定生長。最終得到可在高濃度的含藥培養(yǎng)基中正常生長的HepG2.2.15細(xì)胞,即HepG2.2.15/LMV細(xì)胞。

1.2.6 JGP含藥血清對HepG2.2.15耐藥株耐藥的影響:取對數(shù)生長期HepG2.2.15細(xì)胞耐藥株進(jìn)行胰蛋白酶消化計(jì)數(shù),實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)組:正常大鼠血清組用含有30%正常大鼠血清以及0、5、10、20、30、50、80、100 μg/ml LMV完全培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋,JGP含藥血清組用含有30% JGP含藥血清及0、5、10、20、30、50、80、100 μg/ml LMV完全培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋,分別轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液到96孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)目相同,每組3個(gè)復(fù)孔。同1.2.5 CCK8法檢測并計(jì)算IC50值,統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.7 熒光定量PCR檢測HBV-pgRNA表達(dá)水平:分別為HepG2.2.15耐藥株+正常大鼠血清組和HepG2.2.15耐藥株+JGP含藥血清組兩組。取對數(shù)生長的細(xì)胞,待細(xì)胞培養(yǎng)至80%以上融合后接種于6孔板中,每組3個(gè)復(fù)孔。用TRIzol提取總RNA,檢測RNA濃度,應(yīng)用RT-PCR方法測定HBV-pgRNA表達(dá)水平,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配制體系,使RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應(yīng)參數(shù)分別為:25 ℃,5 min;50 ℃,15 min;85 ℃,5 s;4 ℃,hold;再按下列條件在CFX96實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的反應(yīng):預(yù)變性95℃,1 min;變性95 ℃,20 s;退火55 ℃,20 s;延伸72 ℃,30 s。采集記錄熒光,制作擴(kuò)增曲線和溶解曲線,讀取Ct值。獲得RNA產(chǎn)物后檢測RNA濃度,設(shè)置如表1。引物信息見表2。

表1 RNA檢測濃度設(shè)置

表2 引物信息

1.2.8 ELISA檢測上清HBsAg和HBeAg的表達(dá)水平:分組同1.2.7。取對數(shù)生長細(xì)胞,按5×105個(gè)/ml濃度分別接種于6孔板細(xì)胞培養(yǎng)板中(1 ml/孔)。分組給藥,每組6個(gè)復(fù)孔,24 h后取上清液,采用ELISA法測定HBsAg和HBeAg含量,于450 nm處測定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線在回歸方程上計(jì)算出對應(yīng)的樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間兩兩比較采用t檢驗(yàn),兩組以上的差異比較采用單因素方差分析;P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HepG2.2.15的培養(yǎng) 通過細(xì)胞培養(yǎng),倒置顯微鏡觀察到細(xì)胞于接種后24 h貼壁,呈島壯聚集生長,狀態(tài)良好,可繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖1)。

圖1 HepG2.2.15細(xì)胞圖片(×100)

2.2 CCK8檢測JGP含藥血清對HepG2.2.15細(xì)胞增殖的影響 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測JGP含藥血清作用24 h和48 h對HepG2.2.15細(xì)胞活力的影響,24 h/48 h時(shí),與空白組相比,隨著含藥血清濃度的增加,HepG2.2.15細(xì)胞活力逐漸下降。當(dāng)JGP含藥血清的濃度增加到30%時(shí),HepG2.2.15細(xì)胞的存活率下降50%左右,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)JGP含藥血清選擇30%的濃度(圖2)。

圖2 CCK8檢測含藥血清對HepG2.2.15細(xì)胞增殖的影響

2.3 LMV耐藥細(xì)胞株構(gòu)建 從HepG2.2.15細(xì)胞與HepG2.2.15 LMV耐藥細(xì)胞株的細(xì)胞培養(yǎng)圖片可以看出,細(xì)胞生長狀態(tài)良好?？梢灾苯舆M(jìn)行下一步檢測(圖3)。

圖3 HepG2.2.15 LMV耐藥細(xì)胞株構(gòu)建(×100)

2.4 檢測HepG2.2.15耐藥前后IC50值變化驗(yàn)證耐藥株的構(gòu)建情況 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測HepG2.2.15細(xì)胞敏感株和耐藥株對LMV的IC50值,結(jié)果如圖4所示,敏感株IC50值為12.35,耐藥株的IC50值為67.66,RI值(67.66/12.35)>5,表明耐藥株構(gòu)建成功。

圖4 CCK8檢測HepG2.2.15細(xì)胞敏感株和耐藥株對LMV的IC50值

2.5 JGP含藥血清對HepG2.2.15耐藥株IC50值的影響 HepG2.2.15細(xì)胞耐藥株添加JGP含藥血清的IC50值為19.31,而HepG2.2.15細(xì)胞耐藥株添加正常大鼠血清的IC50值為67.50,表明JGP含藥血清可增加HepG2.2.15細(xì)胞耐藥株對LMV的敏感性(圖5)。

圖5 JGP含藥血清對HepG2.2.15耐藥株IC50值的影響

2.6 RT-PCR檢測HBV-pgRNA的表達(dá)水平 與HepG2.2.15/LMV耐藥細(xì)胞株添加正常血清組相比,HepG2.2.15/LMV耐藥細(xì)胞株添加JGP含藥血清組的HBV-pgRNA的表達(dá)水平顯著降低,表明JGP含藥血清可抑制HepG2.2.15/LMV耐藥細(xì)胞株HBV-pgRNA的表達(dá)(圖6)。

圖6 RT-PCR檢測HBV-pgRNA的表達(dá)水平

2.7 ELISA檢測血清HBsAg和HBeAg 與HepG2.2.15/LMV耐藥細(xì)胞株添加正常血清組相比,HepG2.2.15/LMV耐藥細(xì)胞株添加JGP含藥血清組培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg的蛋白水平均極顯著降低,表明JGP含藥血清可抑制HepG2.2.15/LMV耐藥細(xì)胞株HBsAg和HBeAg的蛋白表達(dá)。見表3。

表3 兩組細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg的表達(dá)水平(ng/ml)

3 討 論

NAs的耐藥貫穿用藥的整個(gè)過程,從開始使用NA就產(chǎn)生了變異毒株及相應(yīng)變異的cccDNA,隨著治療的進(jìn)行,野生毒株逐漸被耐藥變異株取代,變?yōu)榱觿葜?而這其中通常經(jīng)歷了基因型耐藥(即變異株復(fù)制低于野生株,血清病毒復(fù)制正常)、表現(xiàn)型耐藥(另一位點(diǎn)發(fā)生了補(bǔ)償變異而恢復(fù)其復(fù)制活性,變異株數(shù)量迅速復(fù)增多而發(fā)生病毒突變、甚至反彈)、臨床耐藥(病毒數(shù)量增高到一定程度,肝炎復(fù)發(fā))[3]。目前直接作用于HBV和作用于宿主的治愈性藥物仍沒有進(jìn)入Ⅲ期臨床研究[3]。

NAs的耐藥現(xiàn)象一直存在,目前難以完全抑制。同樣作為L-核苷類的ETV有很高的耐藥屏障,但對LMVr交叉耐藥,甚至ETVr也依賴YMDD的變異;有學(xué)者[4-6]研究發(fā)現(xiàn)包括ETV、TDF在內(nèi)的NAs仍存在聯(lián)合耐藥位點(diǎn)變異情況,且認(rèn)為NAs并不能完全清除cccDNA和整合的HBV-DNA,隨著慢性乙型肝炎NAs治療的日益普及,抗病毒藥物不斷更迭、用藥方案組合多元化,耐藥位點(diǎn)將呈現(xiàn)更加復(fù)雜的變化,多位點(diǎn)變異和多藥耐藥的情況有增加趨勢,HBV耐藥變異株概率也將逐漸增加,治療獲益需被重新評估。

LMV的耐藥株(LMVr)主要是YMDD基序變異,rtC區(qū)YMDD基序204位點(diǎn)的甲硫氨酸被纈氨酸或異亮氨酸所替代(rtM204V/I),LMV的基因耐藥率每年以14%～32%遞增[3];針對CHB對NAs耐藥情況,指南也提出建議更換為強(qiáng)效低耐藥藥物如恩替卡韋(ETV)、替諾福韋酯(TDF)、富馬酸丙酚替諾福韋(TAF),但仍需密切監(jiān)測,代價(jià)高昂,長期服用可能存在腎臟和骨密度損害等風(fēng)險(xiǎn)。相較其他抗病毒藥物而言,患者遠(yuǎn)期臨床結(jié)局差異、療效及安全性仍待觀察。

針對NA耐藥,指南推薦了挽救措施,需定期監(jiān)測,仍然存在多重、交叉耐藥可能,一定程度上可降低耐藥的幾率,但仍難從根本上解決NAs耐藥問題。目前尚未有藥物可以提高對NA耐藥株的敏感性,以抑制變異株。新近有研究嘗試對NAs進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,在抗HBV活性研究中,化合物3-29似乎表現(xiàn)出一定抑制HBV-DNA復(fù)制、保護(hù)肝功能、改善肝臟炎癥等效用,但缺乏藥物代謝動力學(xué)等研究,尚未成藥[7]。曾有報(bào)道認(rèn)為HAP類化合物單獨(dú)或者與ADV聯(lián)用,可一定程度上解決耐藥問題[8],卻僅停留于實(shí)驗(yàn),未有抗LMV耐藥的專用藥物面世。中醫(yī)藥在乙肝的治療上具有抑制病毒復(fù)制、免疫調(diào)節(jié)等獨(dú)特優(yōu)勢[9-10],而對于中醫(yī)藥干預(yù)NA耐藥的相關(guān)研究相對較少。

健肝散組方藥物有效成分大多被證實(shí)具有抗病毒效應(yīng)。氧化苦參堿 (Oxymatrine,OMT)聯(lián)合胸腺肽可以通過促進(jìn)IFN-α表達(dá)而抑制HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg及HBV-DNA復(fù)制[11],此外,作為生物堿代表,其抗病毒機(jī)制有學(xué)者認(rèn)為與激活先天免疫,并誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+T細(xì)胞中γ干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)相關(guān)[12]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)從茵陳提取液中得到的柚皮苷A和丹參活性成分丹參素、紫草酸也可以顯著抑制HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg及HBV-DNA的復(fù)制[13-16]。柴胡皂苷C能顯著抑制轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞HBV-DNA的復(fù)制和RNA水平[17],其對HBeAg的分泌和HBV-DNA表達(dá)的抑制作用也較為顯著[18]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)健肝散可對LMV誘發(fā)的乙型肝炎病毒YMDD變異現(xiàn)象起到明顯的抑制作用。在所有患者治療前血清標(biāo)本中,均未發(fā)現(xiàn)YMDD變異。治療組HBV-DNA轉(zhuǎn)陰率為86.54%,對照組為73.08%,治療組優(yōu)于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究采用CCK8作用后檢測IC50值的方法衡量細(xì)胞株對藥物的敏感性。IC50是指被測量的藥物的半抑制濃度。它能指示該藥物在抑制某些生物程序的半量。IC50值可以用來衡量HepG2.2.15細(xì)胞對LMV的耐受程度,即對LMV的敏感性。

HBV-pgRNA是3.5 kb大小的乙肝病毒前基因組RNA,作為新型HBV感染血清標(biāo)志物,是病毒DNA及蛋白質(zhì)合成模板[19],能夠反映感染肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA的存在和轉(zhuǎn)錄活性,與檢測HBV DNA一樣,檢測上清中HBV-pgRNA表達(dá)水平能夠反映HBV病毒的感染情況,是較好的臨床診斷、預(yù)后標(biāo)志物[20]。