靈芝產(chǎn)漆酶工藝優(yōu)化

馬亞萍，文 武，暴霆杰，劉民昌，劉 洋，張榮亞，李 力，何玲英，曾正蓉，楊小琴，張 艇

（1.四川中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心，四川 成都 610066；2.卷煙減害降焦四川省重點實驗室，四川 成都 610066）

木質(zhì)素廣泛分布于植物的細胞壁中，是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的有機高分子化合物[1]，在木本植物細胞壁中，木質(zhì)素含量為20%~35%，在草本植物細胞壁中，木質(zhì)素含量為15%~25%[2]。其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不易降解，極大地限制了生物質(zhì)資源的生產(chǎn)[3]，并且燃燒時產(chǎn)生刺激性、木質(zhì)氣，每年有5 億~ 6 億t 未得到充分利用[4]，有數(shù)十萬噸的煙梗被廢棄，對環(huán)境造成了嚴重的污染，對生物質(zhì)資源產(chǎn)生了極大浪費。漆酶是一種分布廣泛的多酚氧化酶，以分子氧作為最終電子受體，是重要的木質(zhì)纖維降解酶之一，在生物質(zhì)能源、染料脫色、生物漂白、食品加工、污水處理等領(lǐng)域有深遠的應(yīng)用前景[5]。

與細菌、植物產(chǎn)的漆酶相比，真菌產(chǎn)的漆酶具有更高的金屬離子耐受性、熱穩(wěn)定性和底物催化氧化性[6]。靈芝屬于白腐真菌，能產(chǎn)生包括漆酶在內(nèi)的多種木質(zhì)纖維素降解酶，具有真菌產(chǎn)漆酶良好的酶學(xué)特性，在工農(nóng)業(yè)、環(huán)境領(lǐng)域和科研工作中受到了廣泛的關(guān)注。柴新義等人[7]從11 株野生大型真菌中篩選出有柄樹舌靈芝具有較高的產(chǎn)漆酶活性。謝玉清等人[8]優(yōu)化無柄靈芝菌培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)配方為干酪素質(zhì)量濃度25 g/L、麥麩質(zhì)量濃度15 g/L、葡萄糖質(zhì)量濃度10 g/L 和酒石酸銨質(zhì)量濃度6 g/L，相應(yīng)的菌漆酶活性達到15 800 U/L。李彩聯(lián)等人[9]開展白腐菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化，以麩皮為發(fā)酵基質(zhì)，接種量5%，發(fā)酵120 h 時漆酶活性最大。于建軍等人[10]采用響應(yīng)面法優(yōu)化漆酶降解梗絲木質(zhì)素工藝，顯著改善香氣質(zhì)、香氣量、余味和刺激性。但前人研究一般試驗設(shè)計較為簡單或者試驗酶活較低，通過單因素試驗設(shè)計選出最佳碳氮源，通過Plackett-burman 試驗篩選出影響顯著的因素，結(jié)合最陡爬坡試驗，最后采用Box-behnken 中心組合試驗得到最優(yōu)發(fā)酵工藝條件，在此條件下獲得的漆酶酶活顯著提高，大大提高煙梗處理水平，減少煙梗廢棄化處理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

1.1.1 菌種

靈芝菌（Ganoderma lucidum） 本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖水（生物試劑），海博生物公司提供；葡萄糖、MgSO4·7H2O、KH2PO4、維B1、NaOH、檸檬酸、K2HPO4（分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供；酵母浸粉、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨、玉米漿（生物試劑），國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供；麩皮（食品級），山東省青島市面粉加工廠提供。

PDB 培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖水質(zhì)量濃度26.1 g/L，pH 值自然，于121 ℃下滅菌15 min；

原始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖質(zhì)量濃度20 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度5 g/L，蛋白胨質(zhì)量濃度10 g/L，MgSO4·7H2O 質(zhì)量濃度1 g/L，KH2PO4質(zhì)量濃度1 g/L，維B1質(zhì)量濃度0.1 g/L，pH 值自然，于121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 儀器與設(shè)備

FD100A 型高壓滅菌鍋，致微儀器有限公司產(chǎn)品；BCM-1000A 型潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；ZQWY-200V 型臥式全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司產(chǎn)品；1810 型紫外分光光度計，上海普析產(chǎn)品；JE3002GE 型電子天平，梅特勒產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)方法

（1） 菌液制備。將250 mL 三角瓶中裝入50 mL PDB 培養(yǎng)基，從平板上挑取3~4 個菌餅接種于50 mL PDB 培養(yǎng)基中，于30 ℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min 培養(yǎng)5 d，用玻璃珠打散菌絲體備用。

（2） 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。配制50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基盛放于250 mL 錐形瓶中，加入3 mL 培養(yǎng)好的菌液至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃下以轉(zhuǎn)速180 r/min 培養(yǎng)5 d，測定發(fā)酵液漆酶酶活力。

1.2.2 漆酶酶活力測定方法

酶活測定方法為：3 mL 反應(yīng)體系里含有濃度為2 mmoL/L 的ABTS 溶液0.5 mL、濃度為0.05 moL/L且pH 值為3 的磷酸氫二鈉- 檸檬酸緩沖液2 mL 和粗酶液（發(fā)酵液過0.22 μm 微孔濾膜） 0.5 mL，于45 ℃下反應(yīng)5 min，測定OD420。

式中：ε——系數(shù)，值為3.6×104，L/（mol·cm）；

V總——漆酶酶活測定反應(yīng)體系總體積，mL；

V酶——添加酶液體積，mL；

Δt——反應(yīng)時間，min。

每組試驗平行培養(yǎng)3 瓶，每瓶發(fā)酵液平行測量3 次漆酶酶活力，取平均值。

1.2.3 單因素試驗篩選氮源、碳源、煙梗粉末

（1） 培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化。以原始培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以玉米漿、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨為氮源，添加質(zhì)量濃度為10，15，20，25 g/L，按菌液體積的6%接種量接種同一瓶菌液，搖瓶培養(yǎng)120 h，測定發(fā)酵液漆酶酶活力。

（2） 培養(yǎng)基碳源的優(yōu)化。以原始培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以葡萄糖、麩皮、蔗糖、淀粉為碳源，添加質(zhì)量濃度為5，10，15，20 g/L，按6%的菌液接種量接種同一瓶菌液，搖瓶培養(yǎng)120 h，測定發(fā)酵液漆酶酶活力。

（3） 煙梗粉末的優(yōu)化。以原始培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，產(chǎn)酶誘導(dǎo)因子煙梗粉末添加質(zhì)量濃度分別設(shè)置為0，5，10，15 g/L，按6%的菌液接種量接種同一瓶菌液，搖瓶培養(yǎng)120 h，測定發(fā)酵液漆酶酶活力。

1.2.4 Plackett- burman 試驗

根據(jù)前期單因素預(yù)試驗結(jié)果，選取玉米漿為氮源、麩皮為碳源，考查酵母浸粉（2 g/L 和3 g/L）、玉米漿（20 g/L和30 g/L）、煙梗粉末（10 g/L和15 g/L）、KH2PO4（1 g/L 和1.5 g/L）、MgSO4·7H2O（1 g/L 和1.5 g/L）、麩皮（30 g/L 和45 g/L）、維B1（0.1 g/L 和0.15 g/L）、接種量（6%和9%）、轉(zhuǎn)速（140 r/min 和200 r/min）、pH 值（3.8 和5.7） 共10 個因素，設(shè)1 個虛擬變量。

Plackett-burman 試驗的因素和水平見表1。

表1 Plackett-burman 試驗的因素和水平

1.2.5 最陡爬坡試驗設(shè)計

按照一定梯度設(shè)置KH2PO4、轉(zhuǎn)速、pH 值，通過測定漆酶酶活，進而確定最優(yōu)量。

1.2.6 Box- behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化

在1.2.5 節(jié)試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以KH2PO4、轉(zhuǎn)速、pH 值為自變量，設(shè)計三因素三水平試驗。

1.2.7 發(fā)酵時間的優(yōu)化

在上述發(fā)酵條件下，測定不同發(fā)酵時間下的發(fā)酵液漆酶酶活，確定較優(yōu)發(fā)酵時間。

1.2.8 靈芝發(fā)酵液處理煙梗

采用上述優(yōu)化好的靈芝發(fā)酵液，按煙梗質(zhì)量分數(shù)的5%，10%，15%，20%，25%均勻噴灑到煙梗中，另外均勻噴灑水，使得煙梗最終含水率達到35%，密封好放入50 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，處理6 h，80 ℃烘2 h，按照國標YC/T 347-2010 測定樣品的木質(zhì)素含量。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 12 開展試驗設(shè)計和結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗篩選氮源、碳源、煙梗粉末

2.1.1 碳源篩選

培養(yǎng)基氮源篩選見圖1。

圖1 培養(yǎng)基氮源篩選

原始發(fā)酵培養(yǎng)基分別添加了玉米漿、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨之后的發(fā)酵液酶活，由圖1 可知，氮源∶玉米漿>大豆蛋白胨>牛肉膏蛋白胨，且玉米漿質(zhì)量濃度20 g/L 時，酶活最高。因此，選用玉米漿作為碳源，質(zhì)量濃度20 g/L。因為玉米漿中香草酸和阿魏酸是有效的產(chǎn)漆酶促進劑[11-12]。

2.1.2 碳源的優(yōu)化

培養(yǎng)基碳源篩選見圖2。

圖2 培養(yǎng)基碳源篩選

原始發(fā)酵培養(yǎng)基分別添加了葡萄糖、麩皮、蔗糖、淀粉之后的發(fā)酵液酶活，由圖2 可知，碳源∶蔗糖、淀粉>麩皮>葡萄糖，但是以蔗糖、淀粉為碳源時，靈芝菌絲體固形物含量高，接近糊狀。因此，優(yōu)選麩皮作為培養(yǎng)基的碳源。

2.1.3 產(chǎn)酶誘導(dǎo)因子的優(yōu)化

煙梗中含有豐富的纖維素，并且成本低、易獲取，因此采用煙梗粉末作為靈芝產(chǎn)漆酶誘導(dǎo)因子。

靈芝產(chǎn)漆酶隨煙梗粉末質(zhì)量濃度的變化見圖3。

圖3 靈芝產(chǎn)漆酶隨煙梗粉末質(zhì)量濃度的變化

由圖3 可知，0~5 g/L，漆酶酶活快速增加，5~10 g/L，增加放緩，10~15 g/L，趨于平穩(wěn)。當添加10 g/L的煙梗粉末時，漆酶酶活增加到對照組的1.59 倍。

2.2 Plackett-burman 試驗設(shè)計結(jié)果

通過Plackett-burman 試驗，篩選出對靈芝產(chǎn)酶的關(guān)鍵因素。

Plackett-burman 試驗結(jié)果見表2，Plackett-burman 試驗方差分析結(jié)果見表3。

表2 Plackett-burman 試驗結(jié)果

由表2 ~表3 可知，結(jié)果顯著（p<0.05），確定系數(shù)0.98，說明模型有較高的擬合度和可靠性。其中，KH2PO4（p<0.05）、轉(zhuǎn)速（p<0.05）、pH 值（p<0.01） 這3 個因素對漆酶酶活存在顯著影響。試驗發(fā)現(xiàn)，所有pH 值5.7 的發(fā)酵液均染菌，酶活較低，可能是因為pH 值5.7 的發(fā)酵液不適合靈芝菌的生長，導(dǎo)致培養(yǎng)過程中雜菌生長，與陳建軍等人[13]的研究結(jié)果一致。

選取KH2PO4、轉(zhuǎn)速、pH 值為主要影響因素，繼續(xù)優(yōu)化其水平。對其余因素，因其影響不顯著，根據(jù)正負效應(yīng)，確定各組分的質(zhì)量濃度為酵母浸粉3 g/L，玉米漿20 g/L，煙梗粉末10 g/L，MgSO4·7H2O 1.04 g/L，麩皮31.6 g/L，維B10.1 g/L，接種量6%。

2.3 最陡爬坡試驗

選取KH2PO41 g/L，轉(zhuǎn)速150 r/min，pH 值3.8，依次按一定的步長向下試驗。

最陡爬坡試驗結(jié)果見表4。

由表4 可知，隨著KH2PO4、轉(zhuǎn)速、pH 值的減小，酶活力依次降低。因此，以試驗組1 為下一步試驗中心點。

2.4 Box-behnken 響應(yīng)面試驗結(jié)果

在Plackett-burman 試驗和最陡爬坡試驗的基礎(chǔ)上，選取A：KH2PO4、B：轉(zhuǎn)速、C：pH 值進一步做Box-behnken 響應(yīng)面優(yōu)化，A（-1：0.85 g/L，1：1.15 g/L）、B（-1：130 r/min，1：170 r/min）、C（-1：3.2，1：4.4）。

Box-behnken 試驗的因素與水平設(shè)計見表5，Box-behnken 響應(yīng)面試驗結(jié)果見表6。

表5 Box-behnken 試驗的因素與水平設(shè)計

表6 Box-behnken 響應(yīng)面試驗結(jié)果

通過Design Expert 11 軟件進行響應(yīng)面分析，得到各因素對漆酶酶活影響的二次多項式回歸方程：

Box-behnken 方差分析見表7。

表7 Box-behnken 方差分析

由表7 可知，p<0.05，且失擬項不顯著（p>0.05），表明模型顯著且具有較好的擬合度，響應(yīng)面模型的信噪比大于4，說明模型設(shè)計合理，可信度高[14]，可用模型對靈芝產(chǎn)漆酶進行分析和預(yù)判。KH2PO4和轉(zhuǎn)速一次項極顯著，pH 值顯著，依據(jù)p值顯著性各因素影響排序為KH2PO4>轉(zhuǎn)速> pH 值。

2.5 各因素相互作用和響應(yīng)面分析

KH2PO4和轉(zhuǎn)速對漆酶酶活的等高線圖和響應(yīng)面圖見圖4，KH2PO4和pH 值對漆酶酶活的等高線圖和響應(yīng)面圖見圖5，轉(zhuǎn)速和pH 值對漆酶酶活的等高線圖和響應(yīng)面圖見圖6。

圖4 KH2PO4 和轉(zhuǎn)速對漆酶酶活的等高線圖和響應(yīng)面圖

圖5 KH2PO4 和pH 值對漆酶酶活的等高線圖和響應(yīng)面圖

圖6 轉(zhuǎn)速和pH 值對漆酶酶活的等高線圖和響應(yīng)面圖

通過軟件Design Expert 11 分析，確定最佳培養(yǎng)基為KH2PO41.1 g/L，轉(zhuǎn)速165 r/min，pH 值3.8，相應(yīng)響應(yīng)面二次模型預(yù)測漆酶酶活最大值為63 824 U/L。

按照優(yōu)化后的條件培養(yǎng)120 h，平行測定3 次取平均值，得到漆酶酶活為65 387 U/L，與理論預(yù)測值誤差2.4%，證明響應(yīng)面法模型較準確地擬合了實際情況，證明了模型的可靠性。

2.6 發(fā)酵時間優(yōu)化結(jié)果

靈芝產(chǎn)漆酶隨發(fā)酵時間的變化見圖7。

圖7 靈芝產(chǎn)漆酶隨發(fā)酵時間的變化

由圖7 可知，前48 h 漆酶酶活很低，48 h 后開始增長，在112~125 h 漆酶酶活達到最大，之后開始降低。因此，優(yōu)選發(fā)酵時間112~125 h 作為發(fā)酵最佳時間。

2.7 靈芝發(fā)酵液降解木質(zhì)素試驗

煙梗木質(zhì)素降解率隨靈芝發(fā)酵液添加量的變化見圖8。

圖8 煙梗木質(zhì)素降解率隨靈芝發(fā)酵液添加量的變化

由圖8 可知，添加量為5%~10%時，煙梗木質(zhì)素降解率隨添加量的增大而快速增大，發(fā)酵液添加量為10%，煙梗木質(zhì)素降解率達到38%，之后增加發(fā)酵液添加量，木質(zhì)素降解率緩慢增大至趨于平衡，最大可降解42%左右。靈芝發(fā)酵液富含漆酶，漆酶可降解木質(zhì)素，說明靈芝發(fā)酵液在降解廢棄生物質(zhì)方面可發(fā)揮極大的作用。

3 結(jié)論

通過Plackett-burman、最陡爬坡、Box-behnken對靈芝產(chǎn)漆酶發(fā)酵條件進行先“定性”、后“定量”的研究方式[15]。首先，通過Plackett-burman 設(shè)計從酵母浸粉、玉米漿、煙梗粉末、KH2PO4、MgSO4·7H2O、麩皮、維B1、接種量、轉(zhuǎn)速、pH 值共10 個因素中篩選出KH2PO4、轉(zhuǎn)速、pH 值這3 個對靈芝產(chǎn)漆酶有顯著影響的因素；其次，最陡爬坡試驗確定最優(yōu)發(fā)酵條件大致范圍；最后，通過Box-behnken 響應(yīng)面試驗建立這3 個因素與漆酶產(chǎn)量的回歸模型，確定發(fā)酵最優(yōu)條件是酵母浸粉3 g/L，玉米漿20 g/L，煙梗粉末10 g/L，KH2PO41.1 g/L，MgSO4·7H2O 1.04 g/L，麩皮31.6 g/L，維B10.1 g/L，接種量6%，轉(zhuǎn)速165 r/min，pH值3.8，此時發(fā)酵液酶活活可達65 387 U/L，以此發(fā)酵液添加量10%，木質(zhì)素降解率可達38%。這種研究方式適合因素多的試驗，先找出影響顯著的因素，進而逼近最優(yōu)區(qū)域。