油茶葉黃酮超聲輔助提取工藝優(yōu)化

張寧蕓，鄧愛(ài)華，王 云，危 婷，譚萬(wàn)紅，劉大宏

（1. 湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 常德 415000；2. 湖南泥頭山油茶開(kāi)發(fā)有限公司，湖南 常德 415700）

據(jù)《中華本草》記載，山茶科植物油茶（Camellia oleiferaAbel） 的葉片具有治療瘡疽，鼻衄和皮膚瘙癢等多種功效[1]。現(xiàn)代研究也表明，油茶葉含有多種活性成分，如多糖、多酚、蛋白及茶皂素和黃酮類(lèi)等[2]，具有抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、降血糖、抗血栓及治療雄性激素依賴(lài)性疾病[3]等功效。植物中黃酮的分離工藝主要有低共融溶劑萃取法、離子液體萃取法[8]及超臨界流體萃取法[4]等，這些方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、溶劑昂貴或設(shè)備投資大，不利于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用?；跓嵝?yīng)及空化效應(yīng)的超聲輔助提取技術(shù)可以有效彌補(bǔ)這些缺陷，已廣泛應(yīng)用于植物黃酮的提取生產(chǎn)[5]。采用木瓜蛋白酶結(jié)合超聲波輔助提取油茶葉黃酮，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化油茶葉黃酮提取工藝參數(shù)，以期為油茶葉黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮油茶葉，湖南泥頭山油茶開(kāi)發(fā)有限公司提供；蘆丁（>99%），生工生物工程（上海） 股份有限公司提供；木瓜蛋白酶（活性80 萬(wàn)U/g），合肥巴斯夫生物科技公司提供；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，均為分析純，湖南匯虹試劑有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)儀器

Q5200E 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；UV-1600 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，翱藝儀器（上海） 有限公司產(chǎn)品；LGJ-10 型冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠(chǎng)產(chǎn)品；EX225D 型分析天平，美國(guó)奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)品；YB-700A 型高速多功能粉碎機(jī)，永康市速鋒工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限公司產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

參考文獻(xiàn)[6]報(bào)道方法，進(jìn)行適當(dāng)修改。稱(chēng)取100.0 mg 蘆丁溶于60%的乙醇中，用250 mL 容量瓶定容，得到0.4 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)液分別裝入25 mL 容量瓶中，用30%乙醇補(bǔ)充到10 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉溶液1.0 mL 搖勻，5 min 后加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硝酸鋁溶液1.0 mL 搖勻，5 min 后再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的氫氧化鈉溶液10.0 mL 搖勻，用30%乙醇定容，放置15 min。于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定其吸光度，試劑空白為參比液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及回歸方程。

2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取5 份凍干油茶葉粉各5.0 g，加入設(shè)定參數(shù)的木瓜蛋白酶乙醇水溶液，固定超聲功率240 W，頻率40 kHz，考查乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%，50%，60%，70%，80%）、超聲時(shí)間（30，45，60，75，90 min）、超聲溫度（30，40，50，60，70 ℃）、料液比（1∶10，1∶14，1∶18，1∶22，1∶26）、木瓜蛋白酶添加量（0.8%，1.6%，2.4%，3.4%，4.0%） 和提取次數(shù)（1，2，3，4，5 次） 等因素對(duì)黃酮得率的影響?？疾閱蝹€(gè)因素影響時(shí)，其他參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶14（g∶mL），超聲時(shí)間30 min，超聲溫度40 ℃，木瓜蛋白酶添加量0.8%下提取1 次。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定超聲溫度50 ℃，料液比1∶22（g∶mL），以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲時(shí)間（B） 和木瓜蛋白酶添加量（C） 作為自變量，油茶葉黃酮得率（Y） 為因變量，根據(jù)Box-behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)響應(yīng)面法試驗(yàn)方案。

試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

2.4 油茶葉黃酮得率計(jì)算

移取油茶葉黃酮提取待測(cè)液1 mL 于具塞試管中，加入體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液4 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL。搖勻放置5 min，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，放置6 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的氫氧化鈉溶液4 mL，搖勻，用體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液補(bǔ)充至10 mL。用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算油茶葉提取物中黃酮的質(zhì)量濃度，根據(jù)式（1） 計(jì)算黃酮得率（Y）。

式中：M1——提取的油茶葉中黃酮的質(zhì)量，g；

M——干燥油茶葉粉質(zhì)量，g。

3 結(jié)果與分析

3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果得出了不同質(zhì)量濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液吸光度，以吸光度（Y） 為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X） 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖1。回歸方程為Y=0.010 0X+0.007 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。說(shuō)明在16~80 μg/mL 的質(zhì)量濃度范圍里蘆丁質(zhì)量濃度同吸光度的線(xiàn)性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

3.2 單因素試驗(yàn)

3.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)油茶葉黃酮得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)油茶葉黃酮得率的影響

由圖2 可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%~70%時(shí)，黃酮得率呈上升趨勢(shì)；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，得率不斷降低。乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)低，水溶性雜質(zhì)易溶出，而乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高，極性降低不利于黃酮的提取，選擇合適的乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%左右。

3.2.2 超聲時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

超聲時(shí)間對(duì)油茶葉黃酮得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)油茶葉黃酮得率的影響

由圖3 可知，超聲時(shí)間在30~60 min 時(shí)，油茶葉黃酮得率呈上升趨勢(shì)；當(dāng)超聲時(shí)間繼續(xù)增加，得率不斷降低；超聲波的空化作用導(dǎo)致細(xì)胞壁的破裂，有助于黃酮的溶出，也會(huì)導(dǎo)致其他可溶性雜質(zhì)（如蛋白、膠質(zhì)等） 的溶出，不利于后續(xù)分離純化，合適的超聲時(shí)間為60 min 左右。

3.2.3 料液比對(duì)黃酮得率的影響

料液比對(duì)油茶葉黃酮得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)油茶葉黃酮得率的影響

由圖4 可知，當(dāng)料液比低于1∶18（g∶mL）時(shí)，油茶葉黃酮得率隨料液比的增加而增加；繼續(xù)增大料液比，黃酮得率增加趨勢(shì)不顯著；可能是溶劑體積增大，單位體積的超聲效果降低，不利于黃酮的溶出，合適的料液比為1∶18（g∶mL） 左右。

3.2.4 超聲溫度對(duì)黃酮得率的影響

超聲溫度對(duì)油茶葉黃酮得率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 超聲溫度對(duì)油茶葉黃酮得率的影響

由圖5 可知，適當(dāng)提高超聲溫度，油茶葉黃酮呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，在超聲溫度為50 ℃時(shí)，油茶葉黃酮得率達(dá)到最大值；提高超聲溫度，有利于黃酮及其他雜質(zhì)的溶出，也可能導(dǎo)致黃酮結(jié)構(gòu)的破壞，合適的超聲溫度為50 ℃左右。

3.2.5 木瓜蛋白酶添加量對(duì)黃酮得率的影響

木瓜蛋白酶添加量對(duì)油茶葉黃酮得率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 木瓜蛋白酶添加量對(duì)油茶葉黃酮得率的影響

由圖6 可知，適當(dāng)添加木瓜蛋白酶的量，油茶葉黃酮得率呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，在木瓜蛋白酶添加量為1.6%時(shí)，油茶葉黃酮得率達(dá)到最大值；木瓜蛋白酶穩(wěn)定性好，有助于黃酮的溶出，量太大也可能導(dǎo)致吸附在物料表面，合適的木瓜蛋白酶添加量為1.6%左右。

3.2.6 提取次數(shù)對(duì)黃酮得率的影響

提取次數(shù)對(duì)油茶葉黃酮得率的影響見(jiàn)圖7。

圖7 提取次數(shù)對(duì)油茶葉黃酮得率的影響

由圖7 可知，油茶葉黃酮從細(xì)胞壁中擴(kuò)散至溶液中需要一定的時(shí)間，當(dāng)提取達(dá)到3 次時(shí)，油茶葉黃酮得率增加趨勢(shì)不明顯，綜合考慮操作和經(jīng)濟(jì)成本，提取次數(shù)為3 次較為合適。

3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

3.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

3.3.2 回歸模型的建立與分析

將表2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)代入Design Expert 8.0 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，油茶葉黃酮得率與各變量的響應(yīng)面回歸數(shù)學(xué)模型：

響應(yīng)面回歸模型方差分析見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析

表3 方差分析結(jié)果表明，該回歸模型非常顯著（p<0.01），失擬項(xiàng)不顯著（p>0.05），說(shuō)明模型可靠；R2=0.940 1，R2Adj=0.863 1，說(shuō)明模型與試驗(yàn)值擬合較好；由F值可知，各因素對(duì)油茶葉黃酮得率影響大小依次為超聲時(shí)間（B） >乙醇體積分?jǐn)?shù)（A） >木瓜蛋白酶添加量（C）；交互項(xiàng)AC和二次項(xiàng)A2對(duì)黃酮得率的影響非常顯著（p<0.001）；一次項(xiàng)B、交互項(xiàng)AB和二次項(xiàng)B2對(duì)黃酮得率的影響顯著（p<0.05），說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)和酶添加量?jī)蓛山换プ饔脤?duì)黃酮得率影響非常顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間兩兩交互作用對(duì)黃酮得率影響顯著。

3.3.3 交互作用分析

乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間交互作用的響應(yīng)面與等高線(xiàn)見(jiàn)圖8，乙醇體積分?jǐn)?shù)與木瓜蛋白酶添加量交互作用的響應(yīng)面和等高線(xiàn)見(jiàn)圖9，超聲時(shí)間與木瓜蛋白酶添加量交互作用的響應(yīng)面和等高線(xiàn)見(jiàn)圖10。

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間交互作用的響應(yīng)面與等高線(xiàn)

圖9 乙醇體積分?jǐn)?shù)與木瓜蛋白酶添加量交互作用的響應(yīng)面和等高線(xiàn)

圖10 超聲時(shí)間與木瓜蛋白酶添加量交互作用的響應(yīng)面和等高線(xiàn)

對(duì)比曲面陡峭程度，發(fā)現(xiàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)（A） 與超聲時(shí)間（B） 之間存在顯著的交互作用（p<0.05），乙醇體積分?jǐn)?shù)（A） 與木瓜蛋白酶添加量（C） 之間存在非常顯著的交互作用（p<0.001），超聲時(shí)間（B）與酶添加量（C） 之間交互作用不顯著（p>0.05），與方差分析結(jié)果一致。

3.3.4 最佳提取工藝條件確定

利用Design Expert 8.0 軟件由所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)分析，得出最佳萃取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)75.1%，超聲時(shí)間55.69 min，木瓜蛋白酶添加量0.8%，油茶葉黃酮得率為2.840%。考慮到實(shí)際操作的方便，選取調(diào)整后的最優(yōu)參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，超聲時(shí)間55 min，木瓜蛋白酶添加量0.8%，預(yù)測(cè)油茶葉黃酮得率為2.839%。在此條件下進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，平均得率為（2.837±0.371） %，與預(yù)測(cè)值無(wú)顯著性差異（p>0.05），說(shuō)明模型可靠。

4 結(jié)論

超聲輔助溶劑法提取油茶葉中黃酮最佳工藝參數(shù)為超聲功率240 W，頻率40 kHz，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，木瓜蛋白酶添加量0.8%，料液比1∶22（g∶mL），超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間55 min，油茶葉黃酮平均得率為（2.837±0.371） %。為了進(jìn)一步拓展油茶葉黃酮在提高免疫力、抗腫瘤等功能食品及保健產(chǎn)品方面的應(yīng)用，可繼續(xù)開(kāi)展油茶葉黃酮純化工藝及藥理學(xué)等方面的研究。