液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜法測(cè)定水中硝基酚類化合物

王建軍

（甘肅省中心實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050）

硝基酚類化合物對(duì)生態(tài)環(huán)境有較大的破壞，對(duì)人體健康也會(huì)造成較嚴(yán)重的傷害，它會(huì)與生物體中蛋白質(zhì)發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞變異，嚴(yán)重時(shí)會(huì)使體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，導(dǎo)致昏迷或者死亡[1]。硝基酚類化合物一般呈現(xiàn)為黃色的晶體狀，在工業(yè)、醫(yī)學(xué)、材料領(lǐng)域發(fā)揮著不可或缺的作用[2-4]，酚類化合物所釋放出的毒性在自然環(huán)境中降解緩慢[5]，早年國外已將酚類化合物作為環(huán)境污染重點(diǎn)監(jiān)測(cè)因子，中國在20世紀(jì)90年代也將部分酚類化合物作為主要監(jiān)測(cè)對(duì)象[6]。到目前為止對(duì)硝基酚類化合物的監(jiān)測(cè)分析較為重要，主要的分析方法有分光度光度法[7]、液相色譜法[8-9]、液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法[10]、氣相色譜法[11]、氣相色譜-質(zhì)譜法[12-13]等。文章前處理采用超聲萃取凈化、離心及過濾，用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀測(cè)定水中4種硝基酚類化合物，該方法操作簡便，精密度和準(zhǔn)確度良好。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器和試劑

超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，型號(hào)TQD，配備ESI和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，Waters公司；色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（1.5 μm，2.1×100 mm）；KH-500 DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)）；離心機(jī)（博科）。

4種硝基酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)貯備液（Reagecon公司，Ireland，100 μg/mL）；內(nèi)標(biāo)貯備液（2，4-二硝基苯酚-d3，Reagecon公司，Ireland，50 μg/mL）；甲醇、正己烷、二氯甲烷、甲酸、甲酸銨均為液相色譜純；氨水（優(yōu)級(jí)純）；濾膜（0.22 μm，聚氟乙烯）。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 液相條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（1.5 μm，2.1×100 mm）；進(jìn)樣量：2.0 μL；流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：甲醇（相A）和甲酸銨-甲酸溶液（相B，0.01 mol/L，pH=4），梯度洗脫程序見表1。

表1 液相洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，負(fù)離子電離模式；MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；離子源溫度：150 ℃；毛細(xì)管電壓：2.95 kV；干燥氣溫度：450 ℃；干燥氣流量：60 L/hr，駐留時(shí)間：0.028 s。其他參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)使用液

取4種硝基酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)貯備液（100 μg/mL）100 μL用甲醇定容到10.0 mL作為中間液（1.0 μg/mL），取中間液100 μL用甲醇定容到1.0 mL作為標(biāo)準(zhǔn)使用液（100 μg/L）。

取內(nèi)標(biāo)貯備液（2，4-二硝基苯酚-d3，50 μg/mL）40 μL用甲醇定容到10.0 mL作為標(biāo)準(zhǔn)使用液（200 μg/L）。

1.3.2 工作曲線繪制

分別用純水稀釋4種硝基酚類化合物的混合準(zhǔn)使用液（10 μg/L）至1.0 mL，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度點(diǎn)為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L，加入內(nèi)標(biāo)使用液（200 μg/L）10 μL，內(nèi)標(biāo)物的濃度為2.0 μg/L。以酚類化合物濃度為橫坐標(biāo)（x），以相應(yīng)化合物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)（y），制作工作曲線。

1.3.3 樣品的采集、保存及前處理

采集水樣時(shí)需要將250 mL帶蓋的棕色玻璃瓶采集滿，不能留有空隙，將水樣的pH用甲酸或者氨水調(diào)節(jié)到7～9。樣品于4 ℃以下冷藏避光保存，且不能超過7 d。選用玻璃注射器移去取5.0 mL樣品于10.0 mL的具塞玻璃管中，加入1.0 mL二氯甲烷和正己烷混合溶液（體積比2∶1），于常溫下超聲萃取凈化10 min，轉(zhuǎn)移至離心機(jī)，在4 500 r/min的速度下離心10 min，靜置5 min后，取1.0 mL經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后的水相層，加入1.0 mL內(nèi)標(biāo)使用液，搖勻后上機(jī)測(cè)定。以保留時(shí)間和特征離子定性，內(nèi)標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 4種硝酚類化合物的定性分析

配制好的標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)Waters-TQD超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀分離檢測(cè)，其響應(yīng)高，分離度好，如圖1所示。

圖1 4種硝基酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

2.2 4種硝基酚類化合物的線性范圍和檢出限

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)條件，4種酚類化合物在0.5～50.0 μg/L的線性范圍內(nèi)，線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995，能夠滿足定量檢測(cè)要求。當(dāng)取1.0 mL空白樣品（加標(biāo)量為2.0 μg/L），依據(jù)上述方法重復(fù)測(cè)定7次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差S，依據(jù)公式MDL=S×t（n-1，0.99）計(jì)算檢出限，得到檢出限和測(cè)定下限見表3。能夠滿足生活污水、工業(yè)廢水、地表水和地下水的檢測(cè)要求。

表3 線性回歸方程

2.3 精密度和準(zhǔn)確度

取地下水樣品，加標(biāo)濃度為5.0 μg/L、10.0 μg/L和20.0 μg/L的低、中、高3個(gè)濃度點(diǎn)，依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)條件，每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和加標(biāo)回收率。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表4。

表4 精確度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

由表4可知，加標(biāo)量在5～20 μg/L范圍內(nèi)，回收率為71.5%～128%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～4.6%，其準(zhǔn)確度高，精密度良好。

2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.4.1 pH對(duì)目標(biāo)化合物的影響

實(shí)驗(yàn)分析了不同pH條件下，對(duì)目標(biāo)化合物加標(biāo)回收率的影響程度。調(diào)節(jié)水樣的pH分別為3.5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)過程，進(jìn)行超聲萃取凈化、離心，上機(jī)分析得到加標(biāo)回收率。發(fā)現(xiàn)4種硝基酚類化合物的回收率伴隨水樣pH的升高而增加，當(dāng)pH升高至7時(shí)，4種酚類化合物的回收率呈現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)，并且回收率基本大于90%。結(jié)果如圖2所示。

圖2 pH對(duì)目標(biāo)化合物的影響

2.4.2 超聲萃取凈化與振蕩萃取凈化的對(duì)比

實(shí)驗(yàn)中對(duì)比了超聲萃取凈化和振蕩萃取凈化2種方法，對(duì)4種酚類化合物的加標(biāo)回收率和凈化效果的影響。取廢水樣品5.0 mL，加標(biāo)量分別為1.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L，每個(gè)濃度點(diǎn)準(zhǔn)備2個(gè)樣品，分別進(jìn)行超聲萃取凈化和振蕩萃取凈化。結(jié)果如圖3所示。

分別取5.0 mL地下水、廢水、地表水各2份，進(jìn)行超聲萃取凈化和振蕩萃取凈化，比對(duì)2種凈化方法的凈化效率，結(jié)果如圖4所示。

圖3 超聲萃取與振蕩萃取加標(biāo)回收率的對(duì)比

圖4 超聲萃取與振蕩萃取的凈化效率對(duì)比

由圖3和圖4可知，在實(shí)驗(yàn)條件下，相同的加標(biāo)濃度，超聲萃取凈化和振蕩萃取凈化的加標(biāo)回收率均在80%以上，但超聲萃取凈化的加標(biāo)回收率普遍高于振蕩萃取凈化，而且超聲萃取凈化的效率優(yōu)于振蕩萃取凈化的效率，說明在樣品量較少的情況下，應(yīng)用超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，使得分子運(yùn)動(dòng)速度增大，從而加強(qiáng)其擴(kuò)散和傳播過程，大大提高了萃取效率。振蕩萃取在樣品量較少的情況下，受振蕩幅度的限制，物質(zhì)反應(yīng)相比超聲萃取不完全，從而影響其萃取效率。

3 結(jié)論

通過超聲萃取凈化-超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜法測(cè)定水中4種酚類化合物的實(shí)驗(yàn)表明：水樣pH在7～9時(shí)，4種硝基酚類化合物的響應(yīng)高、分離度和回收率較好。采用超聲萃取凈化，提高了目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率，降低了雜質(zhì)的響應(yīng)，提高了凈化效率。在實(shí)驗(yàn)條件下，4種硝基酚類化合物加標(biāo)濃度范圍為5～20 μg/L時(shí)，平均回收率為71.5%～128%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～4.6%。該實(shí)驗(yàn)精密度和準(zhǔn)確度良好，并且操作較為簡便，檢出限較低，可以滿足地下水、地表水、污水、工業(yè)廢水中4種硝基酚類化合物的檢測(cè)要求。