木質(zhì)素生物合成途徑相關基因調(diào)控琯溪蜜柚汁胞?；难芯?/h1>
2023-09-10 09:49:58劉鹿寧趙秋月葛聰田志嬌周曉俐阮翥龍莊木來李延王平
果樹學報 2023年3期 關鍵詞：酶活性
劉鹿寧 趙秋月 葛聰 田志嬌 周曉俐 阮翥龍 莊木來 李延 王平
摘要：【目的】探究琯溪蜜柚果實汁胞粒化過程中木質(zhì)素生物合成途徑相關基因在果實發(fā)育過程中的表達特征，以揭示汁胞?；^程中木質(zhì)素合成的分子調(diào)控機制?！痉椒ā窟x取2018 年花后135、165、195、215 d 4 個時期的琯溪蜜柚果實，測定汁胞?；始澳举|(zhì)素含量以及分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選到的木質(zhì)素生物合成途徑關鍵基因的差異表達和相關酶活性變化，并進行汁胞細胞壁木質(zhì)素沉積的顯微觀察?！窘Y(jié)果】在琯溪蜜柚花后195 至215 d 果實發(fā)育成熟期，木質(zhì)素生物合成途徑中CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrCCR3、CrCAD3、CrPOD2 和CrPOD7 等9 個基因的表達量都顯著增強，qRT-PCR驗證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。這期間果實汁胞?；黠@加速，木質(zhì)素合成相關酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、肉桂醇脫氫酶（CAD）、過氧化物酶（POD）的活性明顯上升，木質(zhì)素含量顯著積累，番紅染色顯示木質(zhì)素在蜜柚汁胞細胞壁中明顯沉積?！窘Y(jié)論】琯溪蜜柚木質(zhì)素生物合成途徑相關基因參與調(diào)控汁胞?；^程中細胞壁木質(zhì)素的合成。研究結(jié)果為今后琯溪蜜柚的品種改良和分子育種提供了理論基礎。
關鍵詞：琯溪蜜柚；汁胞?；换蛘{(diào)控；酶活性；木質(zhì)素合成
中圖分類號：S666.3 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）03-0432-10
琯溪蜜柚[Citrus grandis（L.）Osbeck. Guanxipomelo]為亞熱帶蕓香科常綠果樹，是福建省平和縣乃至全國具有代表性的亞熱帶水果之一，已有500多年的栽培歷史，是當?shù)剞r(nóng)民脫貧致富的主要經(jīng)濟來源[1]。然而，琯溪蜜柚的汁胞粒化嚴重影響到了果實的生產(chǎn)和銷售，對琯溪蜜柚的口碑和相關產(chǎn)業(yè)造成了沖擊，給當?shù)剞r(nóng)民帶來一定的經(jīng)濟損失。
琯溪蜜柚成熟過程中的汁胞?；且环N生理病害，將?；c正常汁胞比較，發(fā)現(xiàn)?；兏伞⒆冇?，呈現(xiàn)渾濁的絮狀物。汁胞粒化對果實汁胞的外觀、質(zhì)地和風味都有不利影響[2]。Shomer 等[3]通過觀察琯溪蜜柚汁胞細胞壁的超微結(jié)構(gòu)，認為汁胞粒化是汁胞細胞次生壁木質(zhì)化形成厚壁組織的結(jié)果。潘騰飛等[4]的研究發(fā)現(xiàn)琯溪蜜柚汁胞?；笖?shù)與木質(zhì)素含量呈顯著正相關，表明琯溪蜜柚汁胞?；湍举|(zhì)素合成關系密切。木質(zhì)素是沉積在植物細胞壁中的酚類聚合物，主要有3 種類型[5]，分別是由香豆醇合成的對羥基苯基木質(zhì)素（H型）、由松伯醇合成的愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（G型）、由芥子醇合成的紫丁香基木質(zhì)素（S 型）[6]。琯溪蜜柚?；邪l(fā)現(xiàn)的木質(zhì)素主要為G型木質(zhì)素[7]。研究發(fā)現(xiàn)肉桂酰輔A還原酶（CCR）、肉桂醇脫氫酶（CAD）和過氧化物酶（POD）等和木質(zhì)素合成直接相關[8]。此外，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、CAD、POD等酶活性的變化也與木質(zhì)素含量相關[9]。目前，對琯溪蜜柚汁胞粒化與木質(zhì)素代謝關系的報道多為對木質(zhì)素代謝途徑中個別基因家族的分析或木質(zhì)素相關合成酶活性對木質(zhì)素含量的影響，關于琯溪蜜柚汁胞粒化過程中木質(zhì)素代謝途徑的系列關鍵基因表達變化與汁胞?；P系的相關研究尚未見報道，因此在基因、酶及其代謝物水平上對此展開系統(tǒng)研究是十分必要的。
琯溪蜜柚果實汁胞?；F(xiàn)象通常發(fā)生在果實成熟和采后的貯藏過程中，有關采后貯藏汁胞?；难芯枯^多，但對成熟果實的汁胞?；芯枯^少。筆者在本研究中以不同生長發(fā)育時期的琯溪蜜柚汁胞為材料，通過轉(zhuǎn)錄組篩選差異表達的木質(zhì)素合成關鍵基因分析相關酶活性和木質(zhì)素含量、粒化率的變化，以期揭示琯溪蜜柚汁胞?；^程的生理與分子調(diào)控機制。
1 材料和方法
1.1 試驗材料
琯溪蜜柚果實樣品由福建省漳州市平和縣小溪鎮(zhèn)舊樓村石角壇“平和琯溪蜜柚綜合試驗站科研基地”果園提供，果園海拔420 m，選取25 年以上樹齡、樹勢一致的健壯樹體，正常管理。于2018 年花后135、165、195 和215 d 4 個時期分別隨機采集大小一致、健康、無明顯機械外傷的果實各9 個立即運回實驗室，并進行果實?；实臏y定和果實汁胞石蠟切片。每個時期每個果實各取汁胞10 g，混合后放入液氮中速凍，存于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)木質(zhì)素合成相關酶活性的測定和qRT-PCR驗證試驗。此外，每個果實各取約100 g 置于玻璃瓶內(nèi)于烘箱60 ℃烘干，研缽研磨后裝入15 mL離心管中，用于木質(zhì)素含量測定。以上所有試驗均設3 次生物學重復。
1.2 蜜柚果實粒化率、汁胞木質(zhì)素含量測定
琯溪蜜柚果實?；蕼y定參考代亞蘭等[10]的方法，分別測定花后4個時期的?；|(zhì)量和汁胞總質(zhì)量。果實?；?%=粒化汁胞質(zhì)量/汁胞總質(zhì)量×100?，g溪蜜柚果實汁胞木質(zhì)素含量采用AB 法，即乙酰溴法測定[11]。
1.3 蜜柚汁胞木質(zhì)素顯微鏡觀察
參照秦永亭等[12]的方法，將琯溪蜜柚汁胞用石蠟包埋后，用石蠟切片機切成7 μm厚的切片，干燥后用番紅染液染色2 h、中性樹膠封片后，用LEICADMI 48倒置顯微鏡觀察。木質(zhì)化的細胞壁被番紅染成紅色。
1.4 蜜柚汁胞轉(zhuǎn)錄組木質(zhì)素合成差異基因表達分析
轉(zhuǎn)錄組測序由深圳華大基因研究院完成，統(tǒng)計和評估轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)數(shù)量和質(zhì)量以及組裝效果。
通過轉(zhuǎn)錄組測序，得到基因的表達水平。將log2＞2，并且Q-value ≤ 0.001 的基因定義為差異基因。根據(jù)4 個時期汁胞轉(zhuǎn)錄組測序中的差異基因KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）途徑富集分析，木質(zhì)素合成代謝途徑屬于苯丙烷次生代謝途徑中的一部分，將所有木質(zhì)素代謝途徑關鍵基因進行表達量分析，利用TBtools 軟件繪制熱圖，并從中挑選出差異表達基因。
1.5 蜜柚汁胞木質(zhì)素生物合成差異基因引物設計
從轉(zhuǎn)錄組中篩選出13 個差異表達基因（CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrHCT1、CrCCR3、CrCAD3、CrCOMT4、CrPOD2、CrPOD6、CrPOD7、CrPOD8），利用NCBI 上的引物設計程序（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/ primer- blast/index.cgi）、按照熒光定量引物設計原則設計基因的qRT-PCR引物，以Actin 為內(nèi)參基因（表1）。引物合成由擎科生物公司完成。
1.6 qRT-PCR驗證分析
使用通用RNA提取試劑盒（東盛生物）提取汁胞RNA，參照HiScrip? Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR試劑盒說明書，以琯溪蜜柚果實汁胞RNA為模板合成雙鏈cDNA。使用ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix 試劑盒在羅氏熒光定量PCR 儀上測定基因的表達量。
1.7 蜜柚汁胞木質(zhì)素合成相關酶活性測定
分別參考PAL、C4H、4CL、CAD和POD檢測試劑盒（上海優(yōu)選）說明對琯溪蜜柚果實汁胞進行PAL、C4H、4CL、CAD和POD提取并測定其活性。
1.8 數(shù)據(jù)處理
采用2-△△Ct方法計算基因的相對表達量[13]。利用WPS 表格進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計（2019），SPSS 19.0 進行差異顯著性分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 琯溪蜜柚果實?；始爸举|(zhì)素含量的變化
在琯溪蜜柚果實不同生長發(fā)育期間，花后195 d之前的果實發(fā)育期未見汁胞?；诨ê?95 d 之后的果實成熟期汁胞?；拭黠@增加（圖1）；隨著蜜柚果實的成熟，汁胞木質(zhì)素含量也呈現(xiàn)增加的趨勢，在花后195 和215 d 汁胞中發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量顯著增加（圖1），這些結(jié)果說明在蜜柚果實生長發(fā)育期間，隨著木質(zhì)素的積累，果實汁胞粒化率也隨之增加，果實汁胞?；赡苁悄举|(zhì)素含量過度累積引起的。
2.2 蜜柚汁胞木質(zhì)素顯微觀察
對FAA固定處理后的花后135、165、195和215 d的琯溪蜜柚果實汁胞進行石蠟包埋、切片及番紅染色，圖片由下至上是汁胞內(nèi)部細胞到汁胞外表皮層。用20倍顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，花后135 和165 d 蜜柚果實汁胞顏色相似，無明顯紅色、無明顯顏色變化（圖2-A、B），說明這兩個時期汁胞木質(zhì)素含量較低；花后195 d 汁胞內(nèi)部細胞壁呈現(xiàn)紅色（圖2-C），汁胞外表皮層細胞壁顏色與花后135、165 d 汁胞相比無明顯變化，但此時汁胞已出現(xiàn)木質(zhì)化，木質(zhì)素含量較花后135、165 d 相比略微增加?；ê?15 d 汁胞內(nèi)部細胞和外表皮層的細胞壁均被染成紅色（圖2-D），且顏色較花后195 d 更深，說明在花后195 d 之后的果實成熟期汁胞細胞壁木質(zhì)化程度增加，木質(zhì)素含量顯著上升。
2.3 蜜柚汁胞轉(zhuǎn)錄組木質(zhì)素合成差異基因表達分析
對4 個生長發(fā)育時期琯溪蜜柚果實汁胞轉(zhuǎn)錄組17 個木質(zhì)素生物合成途徑中差異表達基因進行熱圖分析（圖3），結(jié)果表明，其中1 個基因CrCCR1 和另外3 個基因CrPAL、Cr4CL2、Cr4CL7 分別在花后165 和195 d 的表達量與這2 個時期的木質(zhì)素含量的增加趨勢不相一致。但值得注意的是，CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrHCT1、CrCCR3、CrCAD3、CrCOMT4、CrPOD2、CrPOD6、CrPOD7、CrPOD8 等13 個基因的表達量隨著果實的發(fā)育成熟進程，在花后165、195 和215 d 差異表達（log2＞2，Q-value ≤ 0.001）這些基因的表達水平在蜜柚花后215 d 與195 d 相比上調(diào)了2 至9 倍，并且和木質(zhì)素含量的變化趨勢相一致。研究認為這13 個基因可能是蜜柚汁胞木質(zhì)素合成的關鍵基因，因此篩選這13個基因用于后續(xù)的qRT-PCR驗證分析。
2.4 蜜柚汁胞木質(zhì)素合成差異基因qRT-PCR驗證分析
對13 個木質(zhì)素生物合成途徑差異基因進行qRT- PCR 驗證（ 圖4）。隨著果實的生長發(fā)育CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrCCR3、CrCAD3、CrPOD2 和CrPOD7 等9 個基因qRTPCR相對表達量都上調(diào)表達，尤其在花后195 至215 d 的果實成熟期顯著表達，且與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果一致，證明了這9 個基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。說明花后195 至215 d 是蜜柚果實汁胞?；瘯r期。另外4 個基因CrHCT1、CrCOMT4、CrPOD6 和CrPOD8 的qRT-PCR相對表達量變化與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)不一致。
2.5 蜜柚汁胞木質(zhì)素生物合成途徑相關酶活性變化分析
分別對花后135 至215 d 琯溪蜜柚果實汁胞中木質(zhì)素生物合成途徑相關酶PAL、C4H、4CL、CAD和POD的活性進行測定，結(jié)果顯示，酶活性隨著果實的發(fā)育成熟呈現(xiàn)上升趨勢，在花后215 d 達到峰值（圖5），與木質(zhì)素含量及?；实淖兓?guī)律基本一致，表明這些酶可能在蜜柚果實發(fā)育成熟階段的汁胞木質(zhì)素生物合成途徑中起關鍵作用。
3 討論
木質(zhì)素是植物細胞中的苯丙烷代謝途徑的代謝產(chǎn)物。木質(zhì)素在果實汁胞中過量積累可能會導致汁胞?；?，會影響果實的口感和風味，目前在收獲的柑橘果實中普遍存在汁胞?；@一現(xiàn)象[14]。前人有研究表明木質(zhì)素生物合成與汁胞?；g有著密切關聯(lián)，?；闹ǔ０l(fā)生木質(zhì)素過度積累的現(xiàn)象[15]，但總體研究還不夠完整和系統(tǒng)。因此，筆者在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和產(chǎn)物生成3 個水平展開木質(zhì)素代謝與琯溪蜜柚汁胞粒化機制的系統(tǒng)研究。
果實中木質(zhì)素含量的變化與木質(zhì)素生物合成途徑相關基因的表達有關，其中PAL、C4H、4CL、CCR、CAD和POD等基因在木質(zhì)素的合成過程中起著極為重要的調(diào)控作用，且木質(zhì)素合成量與這些基因的表達量呈正相關[16-17]。筆者在本研究中通過琯溪蜜柚汁胞轉(zhuǎn)錄組測序篩選到17 個木質(zhì)素生物合成途徑的差異表達基因，其中13 個基因的表達量與汁胞?；始澳举|(zhì)素含量變化趨勢一致，且在花后195至215 d 顯著表達。qRT- PCR 驗證結(jié)果顯示，CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、CrCCR3、CrCAD3、Cr4CL、CrPOD2、CrPOD7 等9 個基因在蜜柚果實發(fā)育和成熟期的表達量與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果變化趨勢一致，均隨著果實的成熟呈顯著上調(diào)表達趨勢，同時相關酶活性也隨之增強，并與木質(zhì)素生物合成的增加及蜜柚汁胞?；厔菹嘁恢隆＿@一研究結(jié)果表明以上9 個基因是蜜柚汁胞木質(zhì)素的合成調(diào)控的關鍵基因，它們可能參與了琯溪蜜柚汁胞?；倪^程。
PAL是苯丙烷代謝途徑中木質(zhì)素生物合成的第一個關鍵酶，它在木質(zhì)素生物合成中非常重要[18]，PAL催化苯丙氨酸脫氨為反式肉桂酸[19]。前人通過對5 種白梨PAL 基因家族比較分析，結(jié)果顯示Pb-PAL1 和PbPAL2 的表達水平對梨果中石細胞和木質(zhì)素的含量有影響，PbPAL1 和PbPAL2 的轉(zhuǎn)錄水平在木質(zhì)化組織（根和莖）中高于在木質(zhì)化程度較低的組織（葉、芽和花）[20]。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)CrPAL1、CrPAL3 在汁胞木質(zhì)素含量及粒化率較高的成熟期果實中表達量也大幅度增加，PAL酶活性與汁胞木質(zhì)素含量測定結(jié)果及PAL 基因表達量一致，與汁胞?；室泊笾孪喾?。C4H被證明參與了木質(zhì)素生物合成途徑中G 木質(zhì)素單體的產(chǎn)生[21]，小麥中發(fā)現(xiàn)C4H1 基因的表達與木質(zhì)素含量呈顯著相關[22]，竹筍貯藏期間C4H活性增加促進木質(zhì)素的合成，導致竹筍組織木質(zhì)化[23]，在本研究中，蜜柚汁胞CrC4H1、CrC4H2 的表達量在成熟期顯著上調(diào)表達。同時，C4H酶活性也隨著果實的發(fā)育成熟逐漸增強，并與汁胞中木質(zhì)素含量及?；首兓嘁恢?。4CL 是CCR 上游的一個酶，4CL 的產(chǎn)物是CCR 的底物，而CCR被認為是木質(zhì)素合成的關鍵酶[24]。青稞研究中發(fā)現(xiàn)4CL是影響木質(zhì)素合成的一個關鍵酶，4CL活性的提高可以增強莖稈的抗倒伏能力[25]。在本研究中轉(zhuǎn)錄組測序與qRT-PCR 結(jié)果顯示隨著木質(zhì)素含量的增加及汁胞粒化率的上升，Cr4CL 在蜜柚成熟過程中也逐漸上調(diào)表達，4CL 的酶活性也與Cr4CL的表達相一致，這也與芹菜發(fā)育階段的觀察結(jié)果相似[26]。前人在梨果實中木質(zhì)素合成的有關研究中發(fā)現(xiàn)，PbCCR1、PbCCR2 和PbCCR3 的表達趨勢與果核細胞的積累和木質(zhì)素含量相關[27]，筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)CrCCR3 在汁胞中的表達趨勢也與木質(zhì)素含量、?；首兓厔菹嘁恢?。此外，催化肉桂醛轉(zhuǎn)化為肉桂醇[28]，參與單體木質(zhì)素生物合成最后一步的另一個關鍵酶是CAD[29]。SbCAD2 和OsCAD2 基因已被證明參與了莖稈木質(zhì)素的生物合成[30- 31]，PpCAD2 過量表達促進了轉(zhuǎn)基因番茄植株中木質(zhì)素的沉積，木質(zhì)素含量增加，CAD 酶活性更活躍[32]。
筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，蜜柚汁胞中CAD活性在蜜柚成熟后期相應上升，且與木質(zhì)素含量、木質(zhì)素合成酶基因CrCAD3 的表達以及?；氏嘁恢?。POD則通過聚合單體木質(zhì)素催化松柏醇發(fā)生脫氫聚合反應形成G 型木質(zhì)素[33]。有報道對白樺POD 全基因組鑒定，發(fā)現(xiàn)BpPOD6、BpPOD21 和BpPOD37 在木質(zhì)部中高度表達[34]，AgPOD 在芹菜葉柄、葉片中表達水平與木質(zhì)素積累模式一致，說明POD在木質(zhì)素生物合成中起著重要作用[35]。貯藏水果蔬菜時，通常會通過抑制木質(zhì)素合成相關酶POD 活性來減緩木質(zhì)素積累[36]，對貯藏菜薹進行乙烯處理，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量下降的同時BcPOD 的表達也下降[37]。在本研究中CrPOD2 以及CrPOD7 基因表達與POD酶活性以及木質(zhì)素含量和粒化率變化相符，表明CrPOD2 和CrPOD7 參與了蜜柚汁胞?；^程木質(zhì)素的調(diào)控作用。本研究表明，以上琯溪蜜柚汁胞9 個木質(zhì)素合成基因的表達及相關酶活性的動態(tài)變化與汁胞木質(zhì)素含量和粒化率變化相一致，因此認為琯溪蜜柚汁胞?；怯赡举|(zhì)素代謝途徑中的系列關鍵基因共同調(diào)控的結(jié)果。
4 結(jié)論
在琯溪蜜柚果實發(fā)育成熟過程中，汁胞粒化率隨著木質(zhì)素含量的積累而提高，尤其在成熟后期提高迅速。蜜柚汁胞中CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrCCR3、CrCAD3、CrPOD2 和CrPOD7 是木質(zhì)素合成的關鍵調(diào)控基因。這9 個基因的上調(diào)表達，調(diào)控木質(zhì)素合成途徑中重要酶PAL、C4H、4CL、CAD和POD活性的增強，從而促進汁胞木質(zhì)素含量積累，引起汁胞?；l(fā)生。筆者在分子和生理水平上系統(tǒng)地研究了琯溪蜜柚果實發(fā)育過程中汁胞木質(zhì)素生物合成途徑關鍵基因表達與汁胞粒化的關系，為今后琯溪蜜柚的品種改良和分子育種提供了理論基礎。
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劉鹿寧 趙秋月 葛聰 田志嬌 周曉俐 阮翥龍 莊木來 李延 王平
摘要：【目的】探究琯溪蜜柚果實汁胞粒化過程中木質(zhì)素生物合成途徑相關基因在果實發(fā)育過程中的表達特征，以揭示汁胞?；^程中木質(zhì)素合成的分子調(diào)控機制?！痉椒ā窟x取2018 年花后135、165、195、215 d 4 個時期的琯溪蜜柚果實，測定汁胞?；始澳举|(zhì)素含量以及分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選到的木質(zhì)素生物合成途徑關鍵基因的差異表達和相關酶活性變化，并進行汁胞細胞壁木質(zhì)素沉積的顯微觀察?！窘Y(jié)果】在琯溪蜜柚花后195 至215 d 果實發(fā)育成熟期，木質(zhì)素生物合成途徑中CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrCCR3、CrCAD3、CrPOD2 和CrPOD7 等9 個基因的表達量都顯著增強，qRT-PCR驗證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。這期間果實汁胞?；黠@加速，木質(zhì)素合成相關酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、肉桂醇脫氫酶（CAD）、過氧化物酶（POD）的活性明顯上升，木質(zhì)素含量顯著積累，番紅染色顯示木質(zhì)素在蜜柚汁胞細胞壁中明顯沉積?！窘Y(jié)論】琯溪蜜柚木質(zhì)素生物合成途徑相關基因參與調(diào)控汁胞?；^程中細胞壁木質(zhì)素的合成。研究結(jié)果為今后琯溪蜜柚的品種改良和分子育種提供了理論基礎。
關鍵詞：琯溪蜜柚；汁胞?；换蛘{(diào)控；酶活性；木質(zhì)素合成
中圖分類號：S666.3 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）03-0432-10
琯溪蜜柚[Citrus grandis（L.）Osbeck. Guanxipomelo]為亞熱帶蕓香科常綠果樹，是福建省平和縣乃至全國具有代表性的亞熱帶水果之一，已有500多年的栽培歷史，是當?shù)剞r(nóng)民脫貧致富的主要經(jīng)濟來源[1]。然而，琯溪蜜柚的汁胞粒化嚴重影響到了果實的生產(chǎn)和銷售，對琯溪蜜柚的口碑和相關產(chǎn)業(yè)造成了沖擊，給當?shù)剞r(nóng)民帶來一定的經(jīng)濟損失。
琯溪蜜柚成熟過程中的汁胞?；且环N生理病害，將?；c正常汁胞比較，發(fā)現(xiàn)?；兏伞⒆冇?，呈現(xiàn)渾濁的絮狀物。汁胞粒化對果實汁胞的外觀、質(zhì)地和風味都有不利影響[2]。Shomer 等[3]通過觀察琯溪蜜柚汁胞細胞壁的超微結(jié)構(gòu)，認為汁胞粒化是汁胞細胞次生壁木質(zhì)化形成厚壁組織的結(jié)果。潘騰飛等[4]的研究發(fā)現(xiàn)琯溪蜜柚汁胞?；笖?shù)與木質(zhì)素含量呈顯著正相關，表明琯溪蜜柚汁胞?；湍举|(zhì)素合成關系密切。木質(zhì)素是沉積在植物細胞壁中的酚類聚合物，主要有3 種類型[5]，分別是由香豆醇合成的對羥基苯基木質(zhì)素（H型）、由松伯醇合成的愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（G型）、由芥子醇合成的紫丁香基木質(zhì)素（S 型）[6]。琯溪蜜柚?；邪l(fā)現(xiàn)的木質(zhì)素主要為G型木質(zhì)素[7]。研究發(fā)現(xiàn)肉桂酰輔A還原酶（CCR）、肉桂醇脫氫酶（CAD）和過氧化物酶（POD）等和木質(zhì)素合成直接相關[8]。此外，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、CAD、POD等酶活性的變化也與木質(zhì)素含量相關[9]。目前，對琯溪蜜柚汁胞粒化與木質(zhì)素代謝關系的報道多為對木質(zhì)素代謝途徑中個別基因家族的分析或木質(zhì)素相關合成酶活性對木質(zhì)素含量的影響，關于琯溪蜜柚汁胞粒化過程中木質(zhì)素代謝途徑的系列關鍵基因表達變化與汁胞?；P系的相關研究尚未見報道，因此在基因、酶及其代謝物水平上對此展開系統(tǒng)研究是十分必要的。
琯溪蜜柚果實汁胞?；F(xiàn)象通常發(fā)生在果實成熟和采后的貯藏過程中，有關采后貯藏汁胞?；难芯枯^多，但對成熟果實的汁胞?；芯枯^少。筆者在本研究中以不同生長發(fā)育時期的琯溪蜜柚汁胞為材料，通過轉(zhuǎn)錄組篩選差異表達的木質(zhì)素合成關鍵基因分析相關酶活性和木質(zhì)素含量、粒化率的變化，以期揭示琯溪蜜柚汁胞?；^程的生理與分子調(diào)控機制。
1 材料和方法
1.1 試驗材料
琯溪蜜柚果實樣品由福建省漳州市平和縣小溪鎮(zhèn)舊樓村石角壇“平和琯溪蜜柚綜合試驗站科研基地”果園提供，果園海拔420 m，選取25 年以上樹齡、樹勢一致的健壯樹體，正常管理。于2018 年花后135、165、195 和215 d 4 個時期分別隨機采集大小一致、健康、無明顯機械外傷的果實各9 個立即運回實驗室，并進行果實?；实臏y定和果實汁胞石蠟切片。每個時期每個果實各取汁胞10 g，混合后放入液氮中速凍，存于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)木質(zhì)素合成相關酶活性的測定和qRT-PCR驗證試驗。此外，每個果實各取約100 g 置于玻璃瓶內(nèi)于烘箱60 ℃烘干，研缽研磨后裝入15 mL離心管中，用于木質(zhì)素含量測定。以上所有試驗均設3 次生物學重復。
1.2 蜜柚果實粒化率、汁胞木質(zhì)素含量測定
琯溪蜜柚果實?；蕼y定參考代亞蘭等[10]的方法，分別測定花后4個時期的?；|(zhì)量和汁胞總質(zhì)量。果實?；?%=粒化汁胞質(zhì)量/汁胞總質(zhì)量×100?，g溪蜜柚果實汁胞木質(zhì)素含量采用AB 法，即乙酰溴法測定[11]。
1.3 蜜柚汁胞木質(zhì)素顯微鏡觀察
參照秦永亭等[12]的方法，將琯溪蜜柚汁胞用石蠟包埋后，用石蠟切片機切成7 μm厚的切片，干燥后用番紅染液染色2 h、中性樹膠封片后，用LEICADMI 48倒置顯微鏡觀察。木質(zhì)化的細胞壁被番紅染成紅色。
1.4 蜜柚汁胞轉(zhuǎn)錄組木質(zhì)素合成差異基因表達分析
轉(zhuǎn)錄組測序由深圳華大基因研究院完成，統(tǒng)計和評估轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)數(shù)量和質(zhì)量以及組裝效果。
通過轉(zhuǎn)錄組測序，得到基因的表達水平。將log2＞2，并且Q-value ≤ 0.001 的基因定義為差異基因。根據(jù)4 個時期汁胞轉(zhuǎn)錄組測序中的差異基因KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）途徑富集分析，木質(zhì)素合成代謝途徑屬于苯丙烷次生代謝途徑中的一部分，將所有木質(zhì)素代謝途徑關鍵基因進行表達量分析，利用TBtools 軟件繪制熱圖，并從中挑選出差異表達基因。
1.5 蜜柚汁胞木質(zhì)素生物合成差異基因引物設計
從轉(zhuǎn)錄組中篩選出13 個差異表達基因（CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrHCT1、CrCCR3、CrCAD3、CrCOMT4、CrPOD2、CrPOD6、CrPOD7、CrPOD8），利用NCBI 上的引物設計程序（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/ primer- blast/index.cgi）、按照熒光定量引物設計原則設計基因的qRT-PCR引物，以Actin 為內(nèi)參基因（表1）。引物合成由擎科生物公司完成。
1.6 qRT-PCR驗證分析
使用通用RNA提取試劑盒（東盛生物）提取汁胞RNA，參照HiScrip? Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR試劑盒說明書，以琯溪蜜柚果實汁胞RNA為模板合成雙鏈cDNA。使用ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix 試劑盒在羅氏熒光定量PCR 儀上測定基因的表達量。
1.7 蜜柚汁胞木質(zhì)素合成相關酶活性測定
分別參考PAL、C4H、4CL、CAD和POD檢測試劑盒（上海優(yōu)選）說明對琯溪蜜柚果實汁胞進行PAL、C4H、4CL、CAD和POD提取并測定其活性。
1.8 數(shù)據(jù)處理
采用2-△△Ct方法計算基因的相對表達量[13]。利用WPS 表格進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計（2019），SPSS 19.0 進行差異顯著性分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 琯溪蜜柚果實?；始爸举|(zhì)素含量的變化
在琯溪蜜柚果實不同生長發(fā)育期間，花后195 d之前的果實發(fā)育期未見汁胞?；诨ê?95 d 之后的果實成熟期汁胞?；拭黠@增加（圖1）；隨著蜜柚果實的成熟，汁胞木質(zhì)素含量也呈現(xiàn)增加的趨勢，在花后195 和215 d 汁胞中發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量顯著增加（圖1），這些結(jié)果說明在蜜柚果實生長發(fā)育期間，隨著木質(zhì)素的積累，果實汁胞粒化率也隨之增加，果實汁胞?；赡苁悄举|(zhì)素含量過度累積引起的。
2.2 蜜柚汁胞木質(zhì)素顯微觀察
對FAA固定處理后的花后135、165、195和215 d的琯溪蜜柚果實汁胞進行石蠟包埋、切片及番紅染色，圖片由下至上是汁胞內(nèi)部細胞到汁胞外表皮層。用20倍顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，花后135 和165 d 蜜柚果實汁胞顏色相似，無明顯紅色、無明顯顏色變化（圖2-A、B），說明這兩個時期汁胞木質(zhì)素含量較低；花后195 d 汁胞內(nèi)部細胞壁呈現(xiàn)紅色（圖2-C），汁胞外表皮層細胞壁顏色與花后135、165 d 汁胞相比無明顯變化，但此時汁胞已出現(xiàn)木質(zhì)化，木質(zhì)素含量較花后135、165 d 相比略微增加?；ê?15 d 汁胞內(nèi)部細胞和外表皮層的細胞壁均被染成紅色（圖2-D），且顏色較花后195 d 更深，說明在花后195 d 之后的果實成熟期汁胞細胞壁木質(zhì)化程度增加，木質(zhì)素含量顯著上升。
2.3 蜜柚汁胞轉(zhuǎn)錄組木質(zhì)素合成差異基因表達分析
對4 個生長發(fā)育時期琯溪蜜柚果實汁胞轉(zhuǎn)錄組17 個木質(zhì)素生物合成途徑中差異表達基因進行熱圖分析（圖3），結(jié)果表明，其中1 個基因CrCCR1 和另外3 個基因CrPAL、Cr4CL2、Cr4CL7 分別在花后165 和195 d 的表達量與這2 個時期的木質(zhì)素含量的增加趨勢不相一致。但值得注意的是，CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrHCT1、CrCCR3、CrCAD3、CrCOMT4、CrPOD2、CrPOD6、CrPOD7、CrPOD8 等13 個基因的表達量隨著果實的發(fā)育成熟進程，在花后165、195 和215 d 差異表達（log2＞2，Q-value ≤ 0.001）這些基因的表達水平在蜜柚花后215 d 與195 d 相比上調(diào)了2 至9 倍，并且和木質(zhì)素含量的變化趨勢相一致。研究認為這13 個基因可能是蜜柚汁胞木質(zhì)素合成的關鍵基因，因此篩選這13個基因用于后續(xù)的qRT-PCR驗證分析。
2.4 蜜柚汁胞木質(zhì)素合成差異基因qRT-PCR驗證分析
對13 個木質(zhì)素生物合成途徑差異基因進行qRT- PCR 驗證（ 圖4）。隨著果實的生長發(fā)育CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrCCR3、CrCAD3、CrPOD2 和CrPOD7 等9 個基因qRTPCR相對表達量都上調(diào)表達，尤其在花后195 至215 d 的果實成熟期顯著表達，且與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果一致，證明了這9 個基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。說明花后195 至215 d 是蜜柚果實汁胞?；瘯r期。另外4 個基因CrHCT1、CrCOMT4、CrPOD6 和CrPOD8 的qRT-PCR相對表達量變化與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)不一致。
2.5 蜜柚汁胞木質(zhì)素生物合成途徑相關酶活性變化分析
分別對花后135 至215 d 琯溪蜜柚果實汁胞中木質(zhì)素生物合成途徑相關酶PAL、C4H、4CL、CAD和POD的活性進行測定，結(jié)果顯示，酶活性隨著果實的發(fā)育成熟呈現(xiàn)上升趨勢，在花后215 d 達到峰值（圖5），與木質(zhì)素含量及?；实淖兓?guī)律基本一致，表明這些酶可能在蜜柚果實發(fā)育成熟階段的汁胞木質(zhì)素生物合成途徑中起關鍵作用。
3 討論
木質(zhì)素是植物細胞中的苯丙烷代謝途徑的代謝產(chǎn)物。木質(zhì)素在果實汁胞中過量積累可能會導致汁胞?；?，會影響果實的口感和風味，目前在收獲的柑橘果實中普遍存在汁胞?；@一現(xiàn)象[14]。前人有研究表明木質(zhì)素生物合成與汁胞?；g有著密切關聯(lián)，?；闹ǔ０l(fā)生木質(zhì)素過度積累的現(xiàn)象[15]，但總體研究還不夠完整和系統(tǒng)。因此，筆者在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和產(chǎn)物生成3 個水平展開木質(zhì)素代謝與琯溪蜜柚汁胞粒化機制的系統(tǒng)研究。
果實中木質(zhì)素含量的變化與木質(zhì)素生物合成途徑相關基因的表達有關，其中PAL、C4H、4CL、CCR、CAD和POD等基因在木質(zhì)素的合成過程中起著極為重要的調(diào)控作用，且木質(zhì)素合成量與這些基因的表達量呈正相關[16-17]。筆者在本研究中通過琯溪蜜柚汁胞轉(zhuǎn)錄組測序篩選到17 個木質(zhì)素生物合成途徑的差異表達基因，其中13 個基因的表達量與汁胞?；始澳举|(zhì)素含量變化趨勢一致，且在花后195至215 d 顯著表達。qRT- PCR 驗證結(jié)果顯示，CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、CrCCR3、CrCAD3、Cr4CL、CrPOD2、CrPOD7 等9 個基因在蜜柚果實發(fā)育和成熟期的表達量與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果變化趨勢一致，均隨著果實的成熟呈顯著上調(diào)表達趨勢，同時相關酶活性也隨之增強，并與木質(zhì)素生物合成的增加及蜜柚汁胞?；厔菹嘁恢隆＿@一研究結(jié)果表明以上9 個基因是蜜柚汁胞木質(zhì)素的合成調(diào)控的關鍵基因，它們可能參與了琯溪蜜柚汁胞?；倪^程。
PAL是苯丙烷代謝途徑中木質(zhì)素生物合成的第一個關鍵酶，它在木質(zhì)素生物合成中非常重要[18]，PAL催化苯丙氨酸脫氨為反式肉桂酸[19]。前人通過對5 種白梨PAL 基因家族比較分析，結(jié)果顯示Pb-PAL1 和PbPAL2 的表達水平對梨果中石細胞和木質(zhì)素的含量有影響，PbPAL1 和PbPAL2 的轉(zhuǎn)錄水平在木質(zhì)化組織（根和莖）中高于在木質(zhì)化程度較低的組織（葉、芽和花）[20]。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)CrPAL1、CrPAL3 在汁胞木質(zhì)素含量及粒化率較高的成熟期果實中表達量也大幅度增加，PAL酶活性與汁胞木質(zhì)素含量測定結(jié)果及PAL 基因表達量一致，與汁胞?；室泊笾孪喾?。C4H被證明參與了木質(zhì)素生物合成途徑中G 木質(zhì)素單體的產(chǎn)生[21]，小麥中發(fā)現(xiàn)C4H1 基因的表達與木質(zhì)素含量呈顯著相關[22]，竹筍貯藏期間C4H活性增加促進木質(zhì)素的合成，導致竹筍組織木質(zhì)化[23]，在本研究中，蜜柚汁胞CrC4H1、CrC4H2 的表達量在成熟期顯著上調(diào)表達。同時，C4H酶活性也隨著果實的發(fā)育成熟逐漸增強，并與汁胞中木質(zhì)素含量及?；首兓嘁恢?。4CL 是CCR 上游的一個酶，4CL 的產(chǎn)物是CCR 的底物，而CCR被認為是木質(zhì)素合成的關鍵酶[24]。青稞研究中發(fā)現(xiàn)4CL是影響木質(zhì)素合成的一個關鍵酶，4CL活性的提高可以增強莖稈的抗倒伏能力[25]。在本研究中轉(zhuǎn)錄組測序與qRT-PCR 結(jié)果顯示隨著木質(zhì)素含量的增加及汁胞粒化率的上升，Cr4CL 在蜜柚成熟過程中也逐漸上調(diào)表達，4CL 的酶活性也與Cr4CL的表達相一致，這也與芹菜發(fā)育階段的觀察結(jié)果相似[26]。前人在梨果實中木質(zhì)素合成的有關研究中發(fā)現(xiàn)，PbCCR1、PbCCR2 和PbCCR3 的表達趨勢與果核細胞的積累和木質(zhì)素含量相關[27]，筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)CrCCR3 在汁胞中的表達趨勢也與木質(zhì)素含量、?；首兓厔菹嘁恢?。此外，催化肉桂醛轉(zhuǎn)化為肉桂醇[28]，參與單體木質(zhì)素生物合成最后一步的另一個關鍵酶是CAD[29]。SbCAD2 和OsCAD2 基因已被證明參與了莖稈木質(zhì)素的生物合成[30- 31]，PpCAD2 過量表達促進了轉(zhuǎn)基因番茄植株中木質(zhì)素的沉積，木質(zhì)素含量增加，CAD 酶活性更活躍[32]。
筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，蜜柚汁胞中CAD活性在蜜柚成熟后期相應上升，且與木質(zhì)素含量、木質(zhì)素合成酶基因CrCAD3 的表達以及?；氏嘁恢?。POD則通過聚合單體木質(zhì)素催化松柏醇發(fā)生脫氫聚合反應形成G 型木質(zhì)素[33]。有報道對白樺POD 全基因組鑒定，發(fā)現(xiàn)BpPOD6、BpPOD21 和BpPOD37 在木質(zhì)部中高度表達[34]，AgPOD 在芹菜葉柄、葉片中表達水平與木質(zhì)素積累模式一致，說明POD在木質(zhì)素生物合成中起著重要作用[35]。貯藏水果蔬菜時，通常會通過抑制木質(zhì)素合成相關酶POD 活性來減緩木質(zhì)素積累[36]，對貯藏菜薹進行乙烯處理，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量下降的同時BcPOD 的表達也下降[37]。在本研究中CrPOD2 以及CrPOD7 基因表達與POD酶活性以及木質(zhì)素含量和粒化率變化相符，表明CrPOD2 和CrPOD7 參與了蜜柚汁胞?；^程木質(zhì)素的調(diào)控作用。本研究表明，以上琯溪蜜柚汁胞9 個木質(zhì)素合成基因的表達及相關酶活性的動態(tài)變化與汁胞木質(zhì)素含量和粒化率變化相一致，因此認為琯溪蜜柚汁胞?；怯赡举|(zhì)素代謝途徑中的系列關鍵基因共同調(diào)控的結(jié)果。
4 結(jié)論
在琯溪蜜柚果實發(fā)育成熟過程中，汁胞粒化率隨著木質(zhì)素含量的積累而提高，尤其在成熟后期提高迅速。蜜柚汁胞中CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrCCR3、CrCAD3、CrPOD2 和CrPOD7 是木質(zhì)素合成的關鍵調(diào)控基因。這9 個基因的上調(diào)表達，調(diào)控木質(zhì)素合成途徑中重要酶PAL、C4H、4CL、CAD和POD活性的增強，從而促進汁胞木質(zhì)素含量積累，引起汁胞?；l(fā)生。筆者在分子和生理水平上系統(tǒng)地研究了琯溪蜜柚果實發(fā)育過程中汁胞木質(zhì)素生物合成途徑關鍵基因表達與汁胞粒化的關系，為今后琯溪蜜柚的品種改良和分子育種提供了理論基礎。
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