抗生素耐藥機(jī)制與新抗感染措施研發(fā)

謝建平, 黃 煜, 宋 潔

(西南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究所/三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境與生物資源省部共建國家重點實驗室培育基地, 重慶 400715)

抗生素指由生物(多指微生物,包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬等)在生活過程中產(chǎn)生的、具有抗病原體活性的一類化學(xué)物質(zhì)或者全化學(xué)合成的物質(zhì).抗生素的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用是20世紀(jì)最偉大的醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)之一.但隨著時間的推移,微生物對抗生素產(chǎn)生了耐藥性.2022年,全球約130萬人的死亡與抗生素耐藥性有關(guān),如果抗生素耐藥問題仍無法得到有效解決,預(yù)計2050年,全球每年將有1 000萬人死于抗生素耐藥菌感染,造成的直接經(jīng)濟(jì)損失將超10萬億美元.為解決抗生素危機(jī)需深入理解抗生素耐藥機(jī)制并提出新的抗感染措施.本文將概述抗生素的使用現(xiàn)狀、抗生素耐藥機(jī)制、噬菌體以及抗毒力因子治療作為新抗感染措施的應(yīng)用現(xiàn)狀.

1 抗生素的分類

自1929年青霉素發(fā)現(xiàn)以來,人們又發(fā)現(xiàn)了鏈霉素、紅霉素、卡那霉素等抗生素,抗生素發(fā)展進(jìn)入了黃金時期.近年來,受抗生素研發(fā)領(lǐng)域發(fā)展、全球傳染病及慢性病發(fā)病率增加等多個因素影響,抗生素市場保持上升趨勢.Market Research調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,2021年全球抗生素市場規(guī)模為425億美元,2029年預(yù)計達(dá)605億美元,年平均復(fù)合增長率4.5%.目前臨床使用的抗生素根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)可大致分為β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類等.抗生素主要通過靶向細(xì)菌的基本生理過程,如DNA、RNA、細(xì)胞壁或蛋白合成等發(fā)揮作用.根據(jù)抗生素的作用靶點,對目前臨床上使用的抗生素進(jìn)行分類,見表1.

1.1 抑制DNA復(fù)制DNA的復(fù)制需要拓?fù)洚悩?gòu)酶催化DNA雙鏈的斷裂和連接,從而解決DNA拓?fù)洚悩?gòu)問題,因此,拓?fù)洚悩?gòu)酶也是抗生素的關(guān)鍵靶點之一.氟喹諾酮類抗生素的靶點就是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II和IV.DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶發(fā)揮作用時會和DNA分子結(jié)合形成拓?fù)洚悩?gòu)酶-DNA二元復(fù)合物.而氟喹諾酮會與其形成復(fù)合體.氟喹諾酮與拓?fù)洚悩?gòu)酶結(jié)合后,拓?fù)洚悩?gòu)酶無法重新連接DNA底物;此時已經(jīng)與拓?fù)洚悩?gòu)酶結(jié)合的DNA片段被稱為裂解復(fù)合物.裂解復(fù)合物的形成是氟喹諾酮?dú)⒕年P(guān)鍵點,后續(xù)的殺菌機(jī)制根據(jù)作用途徑可以分為2種.一種是依賴蛋白合成的殺菌途徑,一種是不依賴蛋白合成的殺菌途徑[1].第一代喹諾酮藥物比如萘啶酸通過第一種途徑發(fā)揮作用,新一代的氟喹諾酮如莫西沙星通過后一種途徑行使功能.這2種途徑最后都會造成染色體DNA碎片化并最終使細(xì)胞死亡.此外,裂解復(fù)合物會阻止DNA復(fù)制叉的移動并誘導(dǎo)SOS壓力反應(yīng),會導(dǎo)致DNA修復(fù)相關(guān)基因的上調(diào)并抑制細(xì)胞分裂.低濃度的氟喹諾酮會抑制細(xì)菌DNA的合成,高濃度的氟喹諾酮會造成細(xì)菌死亡[2].

表 1 抗生素分類

1.2 抑制RNA合成RNA合成也是抗生素重要靶點.利福平是臨床上具有代表性的RNA合成抑制類抗生素.利福平與RNA聚合酶的β-亞基(由rpoB編碼)的親和性高,與RNA聚合酶結(jié)合時會阻止合成新RNA[3].利福平只會阻止合成新RNA,不會阻止已合成RNA的延伸.其他RNA聚合酶抑制劑可以抑制RNA的延伸[4].利福平可以殺死革蘭氏陽性菌和陰性菌,包括結(jié)核分枝桿菌,是一線抗結(jié)核藥物.

1.3 抑制蛋白質(zhì)的合成細(xì)菌mRNA的翻譯過程主要涉及3個階段(起始、延伸和終止),且翻譯需要核糖體和一系列細(xì)胞質(zhì)輔助因子的參與.細(xì)菌的核糖體通常由30S和50S核糖體核蛋白亞基組成,而抗生素通常也通過靶向這2個亞基而抑制蛋白質(zhì)的合成.大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類、氯霉素類和惡唑烷酮類抗生素通過靶向50S核糖體亞基發(fā)揮作用[5-6];氨基糖苷類和四環(huán)素類抗生素則通過靶向30S核糖體亞基發(fā)揮作用.靶向50S核糖體亞基的抗生素可以阻止肽基tRNA進(jìn)入核糖體,隨后通過空間位阻作用抑制肽基轉(zhuǎn)移酶的延伸反應(yīng),并最終引發(fā)tRNA的解離.四環(huán)素類抗生素也可阻止tRNA進(jìn)入核糖體[7].氨基糖苷類抗生素通過與30S核糖體亞基的16S rRNA結(jié)合,從而引起核糖體處的mRNA和tRNA的復(fù)合物的錯配,導(dǎo)致蛋白質(zhì)的錯誤翻譯[8].大部分核糖體抑制型的抗生素都是抑菌類抗生素,但在特定物種或特殊處理條件下也能殺菌.如氯霉素可以殺死肺炎鏈球菌[9],大環(huán)內(nèi)酯類的阿奇霉素也被證實可以殺死流感嗜血桿菌[10].

1.4 抑制細(xì)胞壁的合成肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分之一,它是由N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰胞壁酸與短肽聚合而成的多層網(wǎng)狀聚合物.細(xì)胞壁可維持細(xì)菌體內(nèi)的滲透壓穩(wěn)定,因此,對細(xì)菌在各種壓力條件下的生存起著至關(guān)重要的作用.轉(zhuǎn)糖苷酶和青霉素結(jié)合蛋白(PBPs,也稱作轉(zhuǎn)肽酶)是肽聚糖合成過程中的2個關(guān)鍵蛋白,前者添加二糖五肽從而延長肽聚糖的聚糖鏈,而后者是交聯(lián)未成熟肽聚糖單元的相鄰肽鏈[11].β-內(nèi)酰胺類抗生素和糖肽類抗生素是常見的干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成的抗生素.β-內(nèi)酰胺類抗生素通過抑制PBPs催化的肽鍵形成反應(yīng),從而阻斷肽聚糖層的交聯(lián)[12];而糖肽類抗生素(萬古霉素)通過與肽鏈中的D-丙氨酰-D-丙氨酸結(jié)合來抑制交聯(lián),從而阻止肽聚糖的合成[13].臨床上使用的環(huán)肽(多粘菌素B和粘菌素)和脂肽(達(dá)托霉素)也可通過誘發(fā)離子泄露而引起細(xì)胞膜去極化進(jìn)行殺傷[14].由于萬古霉素和達(dá)托霉素都能抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成,臨床上也常將這2種抗生素和β-內(nèi)酰胺類混合使用以治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)引發(fā)的感染[15].除了靶向肽聚糖以外,抗生素也可通過靶向細(xì)胞壁的其他成分而發(fā)揮作用.如異煙肼和乙硫異煙胺抑制分枝桿菌枝菌酸的合成,阻斷細(xì)胞壁的合成;陽離子肽與細(xì)胞壁脂多糖中的脂質(zhì)A結(jié)合,提高外膜通透性,導(dǎo)致細(xì)菌死亡[16].

1.5 抑制細(xì)菌代謝細(xì)菌代謝也是抗生素的重要靶點.抗生素可通過靶向細(xì)菌能量代謝、脂質(zhì)代謝和碳代謝等發(fā)揮作用.參與能量代謝的F1Fo-ATP合酶、II型NADH脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶和甲基萘醌生物合成途徑等,都有望成為新一代藥物靶點[17-18].

貝達(dá)喹啉(Bedaquiline,BDQ)是靶向分枝桿菌能量代謝的藥物,抑制分枝桿菌F1Fo-ATP合酶,造成細(xì)菌能量耗竭而達(dá)到殺菌目的[19-20].BDQ可結(jié)合于分枝桿菌ATP合酶的a亞基(基因atpB編碼)和c亞基(基因atpE編碼)接觸區(qū)域[21],并通過多種相互作用與c環(huán)特異性結(jié)合.BDQ與c亞基的Glu65殘基結(jié)合破壞了a、c亞基之間的聯(lián)系,導(dǎo)致了質(zhì)子泄漏,最終造成質(zhì)子流與ATP合酶的解耦[22],使細(xì)菌ATP合成受阻.咪唑吡啶(Telacebec,Q203)是一種通過與細(xì)胞色素bc1(電子傳遞鏈ETC復(fù)合物III)的QcrB亞基結(jié)合而產(chǎn)生抑制作用的藥物,它迫使細(xì)菌使用產(chǎn)能效率更低的細(xì)胞色素bd末端氧化酶[23].Q203和BDQ分別抑制呼吸鏈上的兩大組分,當(dāng)呼吸鏈出現(xiàn)一處突變時,多個呼吸鏈抑制劑可以共同阻止耐藥的出現(xiàn).氯法齊明(Clofazimine,Cfz)是分枝桿菌的另一種呼吸抑制劑,它作為II型NADH脫氫酶的競爭性底物可以導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生,對缺氧、非復(fù)制狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌具有強(qiáng)殺菌效果[24].

葉酸是細(xì)菌中介導(dǎo)一碳單元轉(zhuǎn)移的重要輔因子,它可以參與細(xì)菌的蛋白質(zhì)、核苷酸的合成.外源的葉酸不能透過細(xì)菌細(xì)胞壁,因此細(xì)菌必須從頭合成葉酸.甲氧芐啶就是通過靶向細(xì)菌的二氫葉酸還原酶而干擾細(xì)菌的葉酸合成[25].此外,磺胺甲惡唑通過靶向細(xì)菌的二氫葉酸合成酶影響細(xì)菌的葉酸合成,臨床上磺胺甲噁唑經(jīng)常和甲氧芐啶聯(lián)用以治療細(xì)菌感染.

2 抗生素耐藥機(jī)制

抗生素使因細(xì)菌性感染導(dǎo)致的死亡人數(shù)下降了約70%[26],但隨著抗生素長期的不合理使用,細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)化出多種機(jī)制對抗抗生素(圖1).目前,在細(xì)菌的個體層面,抗生素的耐藥機(jī)制大致可以分為4個方面.(I)減少細(xì)胞內(nèi)抗生素的濃度(降低滲透性和提升抗生素的外排);(II)抗生素靶點的修飾或改變;(III)抗生素的修飾或破壞;(IV)避開抗生素靶向的代謝途徑.此外,細(xì)菌也可以在群體層面通過形成生物膜對抗抗生素.

圖1 抗生素耐藥機(jī)制[27]

2.1 降低抗生素的滲透性抗生素需要進(jìn)入細(xì)菌與靶點接觸才能發(fā)揮作用.革蘭氏陰性菌的雙層膜結(jié)構(gòu),使其對大多數(shù)抗生素具有耐藥性.而革蘭氏陽性菌缺乏細(xì)胞外膜,因此其對更多抗生素更具滲透性.分枝桿菌還具有外部脂質(zhì)層和多糖包膜,因此可以阻止親水類抗生素的滲透[28].革蘭氏陰性菌的外膜是一個復(fù)雜的復(fù)合體,它既能提供保護(hù),又能幫助細(xì)菌攝取環(huán)境中的營養(yǎng).結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)腸桿菌的外膜滲透率在細(xì)菌生長的過程中動態(tài)變化,并會影響抗生素進(jìn)入細(xì)菌的能力[29].外膜包含孔蛋白,不同的抗生素可以識別不同的孔蛋白而進(jìn)入細(xì)菌.過去認(rèn)為孔蛋白對抗生素的透過有選擇性,但最近的研究表明,底物的擴(kuò)散以自發(fā)、被動的方式發(fā)生[30].鑒于孔蛋白的重要性,因此孔蛋白結(jié)構(gòu)的改變是導(dǎo)致抗生素耐藥的重要因素之一.比如,臨床分離的耐藥大腸桿菌在OmpC處存在多個突變,這些突變會改變孔蛋白的電荷,進(jìn)而影響抗生素的進(jìn)入[31].銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌也具備多種特定的通道蛋白,這些蛋白限制了大于200 Da的分子進(jìn)入[32].

在細(xì)菌中,為了應(yīng)對各種環(huán)境刺激,孔蛋白是受到嚴(yán)格調(diào)控的.其中最具代表性的研究就是大腸桿菌的OmpC和OmpF,這2個孔蛋白會受到EnvZ-OmpR雙組份系統(tǒng)的調(diào)控.EnvZ是一個細(xì)胞周質(zhì)的感應(yīng)蛋白,它可以感應(yīng)環(huán)境壓力從而改變OmpR的磷酸化狀態(tài).高度磷酸化的OmpR可以刺激OmpC的轉(zhuǎn)錄從而改變細(xì)菌的耐藥能力[33].因此,孔蛋白的調(diào)控蛋白也是未來抗生素開發(fā)的靶點之一.結(jié)核分枝桿菌雖然不具典型的孔蛋白結(jié)構(gòu),但其編碼的PPE51蛋白也具有相似的功能.目前篩選出的小分子3bMP1(圖2)通過靶向PPE51蛋白,在體外具有良好的抗結(jié)核作用[34].

2.2 抗生素外排除了阻止抗生素進(jìn)入體內(nèi),細(xì)菌也可通過外排泵主動外排各種有毒化合物.在革蘭氏陰性菌中,外排泵與雙層細(xì)胞膜協(xié)同作用,使其對多種抗生素耐藥.不同的外排泵對抗生素的影響并不相同,一些提供高水平的耐藥性,另一些則提供低水平的耐藥性,且外排泵對底物存在一定的選擇性[35].外排泵可以分為6個蛋白家族,其中ATP結(jié)合盒蛋白家族(ATP-binding cassette,ABC)是以ATP作為能量來驅(qū)動運(yùn)輸,而主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族(major facilitator superfamily,MFS)、多藥及毒素外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(multidrug and toxin extrusion,MATE)家族、小多藥耐受蛋白(small multidrug resistance,SMR)家族、耐藥-結(jié)瘤-分裂(resistance-nodulation-cell division,RND)蛋白家族和動桿菌抗菌化合物外排家族(proteobacterial antimicrobial compound efflux,PACE)由跨膜離子梯度中捕獲的電化學(xué)能量提供動力[36].革蘭氏陰性菌中,RND外排泵可運(yùn)輸各種結(jié)構(gòu)不同的抗生素,因此RND蛋白家族和菌株耐藥水平密切相關(guān)[36].在結(jié)核分枝桿菌中,也報道了多個與耐藥相關(guān)的外排泵基因.如MFS蛋白家族分子EfpA與異煙肼、氟喹諾酮、利福平、氯法齊明的耐藥水平相關(guān)[37];SMR蛋白家族分子Mmr與氧氟沙星、利福平的耐藥相關(guān)[38];RND蛋白家族分子MmpS5-MmpL5與貝達(dá)喹啉的耐藥水平相關(guān)[39].

2.3 抗生素靶點的改變、修飾和保護(hù)抗生素與靶點的高親和力是抗生素發(fā)揮作用的基礎(chǔ).如果抗生素靶點發(fā)生突變或被其他分子修飾或保護(hù),那么抗生素與靶點的結(jié)合能力會降低,從而對抗生素產(chǎn)生耐藥性.比如氟喹諾酮靶向的DNA促旋酶AB亞基各有一段氟喹諾酮抗性決定區(qū),該區(qū)域的氨基酸突變會降低DNA促旋酶和氟喹諾酮的結(jié)合能力,從而改變細(xì)菌對氟喹諾酮的耐受能力.臨床分離的大腸桿菌中的PBP3基因突變也會降低對β-內(nèi)酰胺抗生素的敏感性[40].

此外,對藥物靶點的修飾也能提高細(xì)菌對抗生素的耐藥性.細(xì)菌可以通過核糖體甲基轉(zhuǎn)移酶將16S rRNA甲基化,從而降低其與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的結(jié)合能力[41].16S rRNA的甲基化也與氨基糖苷類抗生素的高耐藥性相關(guān)[42].細(xì)菌也能編碼蛋白對抗生素的靶點進(jìn)行保護(hù),最常見的例子就是在革蘭氏陰性菌中由質(zhì)粒攜帶的Qnr家族蛋白.由于Qnr存在于質(zhì)粒上,因此該蛋白對于環(huán)境中氟喹諾酮耐藥性的傳播起著重要作用.Qnr蛋白是一種五肽重復(fù)蛋白,其通過與DNA促旋酶結(jié)合而抑制氟喹諾酮-DNA促旋酶復(fù)合物的形成[43],也有研究認(rèn)為Qnr蛋白可以增加細(xì)菌的突變率從而提升細(xì)菌的耐藥性[44].目前已發(fā)現(xiàn)上百種Qnr蛋白,分枝桿菌中也存在Qnr的同源蛋白MfpA.分枝桿菌的MfpA并不是由質(zhì)粒攜帶,而是存在于基因組上.MfpA也是通過與DNA促旋酶結(jié)合而誘發(fā)構(gòu)象的改變從而抑制氟喹諾酮-DNA促旋酶復(fù)合物的形成[45].即使是抗生素已經(jīng)結(jié)合在靶蛋白上,細(xì)菌也可以編碼蛋白恢復(fù)靶蛋白的功能.比如夫西地酸耐受的金黃色葡萄球菌蛋白通常會表達(dá)一個FusB型蛋白.夫西地酸通過與延長因子G(EF-G)穩(wěn)定結(jié)合而抑制細(xì)菌的翻譯.Fusb通過鋅指結(jié)構(gòu)域促進(jìn)夫西地酸(圖3)的分離而恢復(fù)核糖體的翻譯功能[46].

圖3 夫西地酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2.4 抗生素的滅活和修飾對抗生素滅活或修飾是細(xì)菌中廣泛存在的一種耐藥機(jī)制.相對于其他耐藥機(jī)制,此機(jī)制最大的優(yōu)勢是不涉及細(xì)菌細(xì)胞功能的改變,因此一般不會產(chǎn)生適合度代價(fitness cost).抗生素的修飾可以分為2種機(jī)制,一種是直接降解抗生素,另一種是將抗生素的化學(xué)基團(tuán)轉(zhuǎn)移.

細(xì)菌通過編碼蛋白破壞或降解抗生素的結(jié)構(gòu)是抗生素失活的主要機(jī)制[47].抗生素失活的代表性例子就是β-內(nèi)酰胺酶對β-內(nèi)酰胺類抗生素的水解.β-內(nèi)酰胺酶是一種由細(xì)菌編碼的酶,它通過水解β-內(nèi)酰胺環(huán)的酰胺鍵,從而降解抗生素.自20世紀(jì)40年代以來,β-內(nèi)酰胺酶的數(shù)量在不斷增加,目前在NCBI的蛋白數(shù)據(jù)庫上已經(jīng)記錄了超過7 000種不同的β-內(nèi)酰胺酶[48].另一個重要例子是由四環(huán)素失活酶催化四環(huán)類抗生素的氧化,其中最著名的是Tet(X)蛋白家族.Tet(X)蛋白家族常見于來自不同環(huán)境中的耐多藥細(xì)菌,這表明它可以在不同種類的細(xì)菌中廣泛傳播.此外,臨床分離株中Tet(X)的比例與四環(huán)素的使用呈正相關(guān)[49].

細(xì)菌也可通過抗生素修飾酶將抗生素的化學(xué)基團(tuán)轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致抗生素失效.比如利福平可以被ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶和單加氧酶修飾.膿腫分枝桿菌中的ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶是造成其對利福平耐藥的原因之一[50].ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶催化ADP核糖與利福平C23的羥基相連,從而阻斷其與RNA聚合酶的相互作用[51].糖基轉(zhuǎn)移酶與ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶的功能類似,也是將利福平C23的羥基糖基化而發(fā)揮作用[52].磷酸轉(zhuǎn)移酶通過作用于利福平的C21將其轉(zhuǎn)化為無活性的磷酸利福平[53],利福平的萘基也會被單加氧酶氧合而失去與RpoB結(jié)合的能力[54].

2.5 避開抗生素靶向的代謝途徑避開抗生素靶向的代謝途徑也是細(xì)菌對抗抗生素的一個重要策略.細(xì)菌可以通過獲得新基因來替代抗生素靶向的途徑.甲氧西林是一種通過與PBP結(jié)合并抑制轉(zhuǎn)肽酶活性,最終導(dǎo)致細(xì)胞壁合成中斷的抗生素[55].MRSA中存在與PBP同源但甲氧西林親和力較低的PBP2a.當(dāng)甲氧西林與PBP2a結(jié)合時,由于PBP2a仍具有轉(zhuǎn)肽酶活性,因此細(xì)胞壁的合成并不受到抑制.由于PBP2a并不具有轉(zhuǎn)糖苷酶結(jié)構(gòu)域,因此還需要原生的PBP發(fā)揮作用[56].通過這種靶點旁路機(jī)制,金黃色葡萄球菌可以避開甲氧西林的作用,以確保細(xì)胞存活.此外,大腸桿菌還編碼一種L,D-轉(zhuǎn)肽酶YcbB,可以繞過D,D-轉(zhuǎn)肽酶PBPs的作用而導(dǎo)致細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺抗生素耐受[57].但是,YcbB還需要(p)ppGpp、PBP5和PBP1b的協(xié)同才能發(fā)揮作用,因此這一現(xiàn)象在耐藥菌株中并不常見[58].甲氧芐啶和磺胺甲噁唑是一種常見的抗生素組合,在臨床上常被用于治療細(xì)菌引起的泌尿系統(tǒng)感染.這2種化合物都抑制細(xì)菌葉酸的生物合成,而葉酸是細(xì)菌合成核酸和蛋白質(zhì)所必需的前物質(zhì).甲氧芐啶是二氫葉酸還原酶(DHFR)的抑制劑,而磺胺甲噁唑通過抑制二氫葉酸合成酶(DHPS).一般來說,抗生素的聯(lián)合使用會降低耐藥性的產(chǎn)生速度,但是當(dāng)細(xì)菌獲得額外的DHFR和DHPS等位基因時,就會產(chǎn)生耐藥性[59].

2.6 形成生物膜生物膜是一種細(xì)菌形成的肉眼可見的異質(zhì)細(xì)胞聚集體,細(xì)菌分泌的多糖蛋白、脂蛋白、多糖基質(zhì)、纖維蛋白等多糖蛋白復(fù)合物是生物膜的主要成分.在臨床上,尤其是在由細(xì)菌引起的慢性疾病中,生物膜是導(dǎo)致這些疾病難以根治的主要原因之一.生物膜的形成一般由群體感應(yīng)調(diào)控.群體感應(yīng)系統(tǒng)是一種細(xì)菌間的通信系統(tǒng),當(dāng)細(xì)菌生長的密度超過某個閾值時,群體感應(yīng)系統(tǒng)能感應(yīng)信號分子的濃度變化而影響特定基因的表達(dá).它可以調(diào)控細(xì)菌代謝,促進(jìn)生物膜形成以及影響細(xì)菌毒力等[60].生物膜的耐藥機(jī)制相對復(fù)雜,目前一般有4種解釋:生物膜形成后可以阻礙抗生素滲透;生物膜內(nèi)的細(xì)菌密度高,有利于抗性基因的傳遞;生物膜形成后會上調(diào)耐藥基因的表達(dá);生物膜內(nèi)的細(xì)菌生長幾乎停滯,因此對抗生素極不敏感[61].

為了應(yīng)對生物膜引起的抗生素耐藥,目前在臨床上也有應(yīng)對生物膜的治療手段,使用吲哚類化合物作為佐劑輔助抗生素治療是一種應(yīng)對生物膜的常規(guī)手段.吲哚(圖4)作為一種信號分子,可以調(diào)節(jié)細(xì)菌的細(xì)胞分裂、生物膜形成、孢子形成和抗生素耐受性等多種生物學(xué)功能[62].比如,吲哚類化合物GW5074(圖4)通過抑制c-di-AMP的合成下調(diào)金黃色葡萄球菌的Agr群感系統(tǒng),最終導(dǎo)致萬古霉素能有效殺死生物膜內(nèi)的細(xì)菌[63].此外,研究發(fā)現(xiàn)分離自Notopterygiumincisum的鐮葉芹二醇(圖4)可以通過靶向銅綠假單胞菌的群感系統(tǒng)抑制生物膜的形成[64].除了靶向群體抑制生物膜形成以外,部分抗生素佐劑也能通過靶向c-di-GMP破壞已經(jīng)形成的生物膜發(fā)揮作用.作為一種信號分子,c-di-GMP含量對細(xì)菌生物膜的形成起著至關(guān)重要的作用[65].肉桂醛(圖4)是一種最常見的通過影響細(xì)菌c-di-GMP的含量破壞生物膜形成的化合物.肉桂醛通過影響LasB、RhlA和PqsA的活性而破壞銅綠假單胞菌的生物膜[66].肉桂醛也能通過改變c-di-GMP的水平破壞泌尿道致病性大腸桿菌、MRSA、糞腸球菌的生物膜[67-69].

圖4 靶向生物膜的常見化合物結(jié)構(gòu)式

3 新抗感染措施

抗生素耐藥性是目前全球面臨的最大健康威脅之一.據(jù)WHO統(tǒng)計,每年因耐藥菌感染導(dǎo)致的死亡人數(shù)已經(jīng)超過130萬,預(yù)計到2050年每年有超過1 000萬人死于抗生素耐藥菌感染,直接經(jīng)濟(jì)損失將達(dá)10萬億美元[70].因此,亟需開發(fā)新的抗感染措施來緩解抗生素危機(jī).噬菌體是能感染和殺死細(xì)菌的病毒,在20世紀(jì)前噬菌體已被用于治療細(xì)菌感染,但是隨著抗生素的成功使用,噬菌體的臨床應(yīng)用已經(jīng)陷入停滯.抗生素耐藥使噬菌體療法重受關(guān)注(圖5).

圖5 1999年后噬菌體臨床試驗數(shù)目[71]

3.1 噬菌體噬菌體是細(xì)菌病毒.噬菌體感染的發(fā)生是由尾部末端附著在細(xì)菌細(xì)胞壁上,并將基因組從衣殼通過細(xì)胞膜注入細(xì)胞質(zhì)起始,蛋白質(zhì)衣殼和尾部留于細(xì)胞外[71].噬菌體可分為裂解性噬菌體和溶源性噬菌體.在感染后,裂解性噬菌體遵循一個單一的發(fā)育進(jìn)程,包括早期噬菌體基因表達(dá)、基因組復(fù)制,晚期裂解病毒粒子結(jié)構(gòu)和組裝基因的表達(dá)、組裝完整包裝的顆粒,最后裂解細(xì)菌.溶源性噬菌體也可以遵循這種裂解生長模式,但在感染早期就會做出“決定”,即進(jìn)行裂解生長或建立溶原[72].

3.2 噬菌體療法概述在20世紀(jì)早期,噬菌體療法提供了治療細(xì)菌感染的第一個可行的解決方案[73].然而,抗生素的發(fā)現(xiàn)及其在20世紀(jì)40年代及以后的廣泛使用證明其是一種更強(qiáng)大、更有效的抗菌解決方案,此時的噬菌體療法的探索陷入低迷期.由于d’Herrelle在格魯吉亞第比利斯率先開展的工作,噬菌體治療在20世紀(jì)中期在蘇聯(lián)繼續(xù)進(jìn)行.進(jìn)入21世紀(jì)后,隨著抗生素的不合理使用導(dǎo)致耐藥細(xì)菌不斷增加,新型抗生素開發(fā)成本昂貴、周期長、利潤低,使得噬菌體治療又引起關(guān)注[74].

目前有多個噬菌體成功治療多重耐藥細(xì)菌感染的案例[75].比如,2019年Hatfull團(tuán)隊使用噬菌體成功治療了耐藥膿腫分枝桿菌引起的皮膚感染[76],2022使用噬菌體成功治療了耐藥膿腫分枝桿菌引發(fā)的肺部感染[77].噬菌體固有的理化性質(zhì)使得噬菌體能夠到達(dá)抗生素不能到達(dá)的感染部位.噬菌體的其他特性,如強(qiáng)殺菌活性和低固有毒性,也使噬菌體療法優(yōu)于傳統(tǒng)抗生素[78].噬菌體具有高度的特異性和選擇性,通常只感染有限范圍的細(xì)菌.噬菌體的這種靶向性使患者正常的微生物群保持完整,這是作為治療藥物的主要優(yōu)勢之一,對于免疫功能低下的患者以及有基礎(chǔ)疾病或?qū)瘜W(xué)療法過敏的患者尤其重要[79].

早期的病例系列研究描述了在多種解剖部位使用噬菌體單獨(dú)或聯(lián)合抗生素治療感染[80].雖然在一部分患者中取得了治療的成功,但是與最近的噬菌體療法對比有2個特點.首先,在這一早期階段,噬菌體產(chǎn)生技術(shù)要求大多數(shù)療程通過口服、局部、膀胱內(nèi)、直腸內(nèi)或吸入途徑給藥.其次,噬菌體通常作為未完全確定特征的噬菌體混合物使用,這些噬菌體對所治療的特定微生物的活性未進(jìn)行體外評估.盡管近年來噬菌體敏感性檢測領(lǐng)域取得了實質(zhì)性進(jìn)展,但檢測方法尚未完全系統(tǒng)化,而且它們對臨床活性的預(yù)測價值還需要大量額外的評估.此外,噬菌體制劑在顯著減少農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖、畜牧業(yè)和獸醫(yī)學(xué)中的抗生素使用方面也有巨大潛力,但也需要更多的數(shù)據(jù)來標(biāo)準(zhǔn)化其使用方法[81].

3.3 抗毒力治療策略除了通過抗生素、噬菌體等直接殺死耐藥細(xì)菌外,通過靶向細(xì)菌毒力因子的治療策略也正在引起人們的關(guān)注.與傳統(tǒng)的治療手段不同的是,抗毒力因子并不會直接殺死細(xì)菌,而是通過靶向細(xì)菌的毒力因子以達(dá)到減弱或剝奪細(xì)菌毒力的作用.以金黃色葡萄球菌為例,只要與細(xì)菌毒力相關(guān)的基因,都能成為抗毒力治療的開發(fā)靶點.比如,金葡菌分泌α-毒素,該毒素通過與真核細(xì)胞的ADAM10結(jié)合后,在細(xì)胞上形成孔洞而裂解細(xì)胞.黃芩苷(baicalin)是一種從中國草藥中分離的黃酮類化合物,可以通過抑制α-毒素的活性而治療細(xì)菌感染[82].除了小分子化合物外,特異性的抗體也能抑制細(xì)菌的毒力.LC10是一種α-毒素的特異性抗體,當(dāng)其與抗生素聯(lián)用時可以增加金黃色葡萄球菌感染后小鼠的存活率[83].此外,調(diào)控細(xì)菌毒力分泌的基因也可以作為藥物治療的靶點.比如,金黃色葡萄球菌的SaeR是調(diào)控細(xì)菌毒力因子分泌的轉(zhuǎn)錄因子,分泌自甘草的天然產(chǎn)物甘草次酸(Glycyrrhize glabra,GRA)通過抑制SaeR的功能而減弱細(xì)菌的毒性[84].同樣地,金黃色葡萄球菌的II型脂肪酸合成酶抑制劑AFN-1252也被證明可通過降低SaeR的表達(dá)量而減弱細(xì)菌毒性[85].綜上所述,通過靶向細(xì)菌毒力因子的策略也能成為替代抗生素治療的有效手段之一.

3.4 機(jī)器學(xué)習(xí)與新抗生素的發(fā)現(xiàn)圍繞中心法則的基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組等經(jīng)典的高通量組學(xué)數(shù)據(jù),以及新興的代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)、糖組學(xué)等,提供了生物體復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯過程中的寶貴信息[86],也為新抗生素的發(fā)現(xiàn)帶來了可能.目前大多數(shù)的抗生素是微生物的次級代謝產(chǎn)物或是對已有抗生素進(jìn)行改良以優(yōu)化殺菌效果[87],但前者發(fā)現(xiàn)的抗生素多為重復(fù)的,而后者只是對已有抗生素的修飾,因此細(xì)菌針對靶點的耐藥機(jī)制依舊有效.此外,隨著越來越多的微生物被測序,基于生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters,BGC)的序列同源性推測蛋白產(chǎn)物以發(fā)現(xiàn)新抗生素也是一種可行的手段.但傳統(tǒng)的預(yù)測工具無法推測新的基因序列以及發(fā)現(xiàn)新的具有抗菌活性的天然產(chǎn)物.因此,為了克服同源性模型的固有局限性,機(jī)器學(xué)習(xí)和深度學(xué)習(xí)模型也被用于推測新的BGC.比如,Hannigan等[88]利用遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)開發(fā)了DeepBGC,它可以從細(xì)菌基因組中預(yù)測BGC.在經(jīng)歷了約600個陽性訓(xùn)練和數(shù)千個陰性訓(xùn)練后,DeepBGC推測的能編碼抗生素活性分子的BGC都是傳統(tǒng)規(guī)則無法鑒定的.Walker等[89]開發(fā)了一種二元分類器.該分類器通過輸入BGC序列,根據(jù)BGC元素的存在與否將每個BCC轉(zhuǎn)換為專家定義的向量,并使用常見的機(jī)器學(xué)習(xí)模型(隨機(jī)森林、支持向量機(jī)和邏輯回歸)確定給定的BGC是否與感興趣的天然產(chǎn)物生物活性有關(guān).除了根據(jù)基因預(yù)測抗生素產(chǎn)物外,機(jī)器學(xué)習(xí)也被用于預(yù)測小分子是否具有抗菌活性.Stokes等[90]開發(fā)了Halicin,該工具通過機(jī)器學(xué)習(xí),成功地從ZINC15數(shù)據(jù)庫中1.07億個小分子中鑒定了8個具有抗菌活性的分子.

綜上所述,基于現(xiàn)代機(jī)器學(xué)習(xí)發(fā)現(xiàn)抗生素的手段已日漸成熟.機(jī)器學(xué)習(xí)的方法可以提高發(fā)現(xiàn)新抗菌活性分子的速度并降低相關(guān)成本,也是解決抗生素危機(jī)的有效手段之一.

4 總結(jié)與展望

抗生素耐藥日益威脅人類健康.深入研究抗生素耐藥機(jī)制可以幫助合理用藥,減少耐藥性的出現(xiàn),加速新抗生素的開發(fā).噬菌體和抗毒力因子化合物是克服抗生素耐藥的重要方向.