長(zhǎng)鏈非編碼RNA GATA3-反義RNA 1調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620增殖、遷移和侵襲的機(jī)制研究

盛華明, 李 森, 鄧立春, 姚 勇

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬江陰醫(yī)院, 1. 腫瘤內(nèi)科, 2. 肛腸外科, 江蘇 江陰, 214400)

結(jié)直腸癌是男性第3大常見(jiàn)癌癥和女性第2大常見(jiàn)癌癥[1], 有約40%患者會(huì)死于結(jié)直腸癌[2], 故亟需探尋基于結(jié)直腸癌進(jìn)展?jié)撛跈C(jī)制的新療法。研究[3]證實(shí),長(zhǎng)鏈非編碼RNA (lncRNA)廣泛參與關(guān)鍵的生理病理過(guò)程,例如細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞生長(zhǎng)和衰老以及免疫激活或失活,并且與腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。lncRNA發(fā)揮作用的明確機(jī)制之一是通過(guò)與競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)競(jìng)爭(zhēng)海綿微小RNA(miRNA), 從而影響其調(diào)節(jié)功能[4]。miRNA是長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的非編碼小RNA, 通過(guò)直接結(jié)合特定靶基因的3′UTR參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié),從而影響細(xì)胞分化、發(fā)育、凋亡、增殖和其他生物學(xué)活性[5]。研究[6]表明, lncRNA GATA3-反義RNA 1(lncRNA GATA3-AS1)是一種新的反義基因,與GATA3共享啟動(dòng)子區(qū)域,是GATA3高效轉(zhuǎn)錄所必需的。lncRNA GATA3-AS1已被證實(shí)是胰腺癌[7]、肝癌[8]的致癌基因,然而lncRNA GATA3-AS1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平和功能尚未明確。微小RNA-574-3p(miR-574-3p)在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào),可作為結(jié)直腸癌的新型候選治療劑[9], 但其與lncRNA GATA3-AS1的關(guān)系尚未明確。本研究觀察結(jié)直腸癌組織中l(wèi)ncRNA GATA3-AS1的表達(dá)情況,并探討lncRNA GATA3-AS1在結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620增殖、遷移和侵襲中的作用與機(jī)制,以期明確lncRNA GATA3-AS1在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)作用及可能涉及的miRNA調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

收集2019年8月—2021年10月在本院進(jìn)行手術(shù)切除的43例結(jié)直腸癌患者(男29例,女14例,均未接受過(guò)任何相關(guān)性治療)的結(jié)直腸癌組織和癌旁組織,所有組織儲(chǔ)存于-80 ℃環(huán)境。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),且所有患者知情同意。

結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620(美國(guó)類(lèi)型培養(yǎng)物保藏中心), Lipofectamine 2000試劑、Super Script第一鏈cDNA試劑盒(美國(guó)Invitrogen), SYBR Premix ExTaq Ⅱ試劑盒(大連寶生物工程), Taq Man microRNA試劑盒(美國(guó)Applied Biosystems),細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8)(日本Dojindo), si-NC、si-GATA3-AS1、miR-NC、miR-574-3p模擬物、anti-miR-NC、anti-miR-574-3p、pcDNA、pcDNA-GATA3-AS1(上海GenePharm), pmirGLO載體、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega), 二辛可寧酸(BCA)蛋白測(cè)定試劑盒(上海碧云天),聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國(guó)GE Health), 抗E-cadherin抗體、抗N-cadherin抗體(美國(guó)Abcam), Matrigel(美國(guó)BD Biosciences)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理

將結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。將SW620細(xì)胞分為si-NC組、si-GATA3-AS1組、miR-NC組、miR-574-3p組、si-GATA3-AS1+anti-miR-NC組、si-GATA3-AS1+anti-miR-574-3p組。根據(jù)Lipofectamine 2000試劑說(shuō)明步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染,在6孔板中接種1×105個(gè)SW620細(xì)胞,待其融合至約70%時(shí),分別用si-NC、si-GATA3-AS1、miR-NC、miR-574-3p模擬物、anti-miR-NC與si-GATA3-AS1、anti-miR-574-3p與si-GATA3-AS1轉(zhuǎn)染48 h, 后續(xù)進(jìn)行細(xì)胞評(píng)價(jià)。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)lncRNA GATA3-AS1和miR-574-3p表達(dá)

根據(jù)制造商Invitrogen的說(shuō)明,使用Trizol試劑從結(jié)直腸癌組織、癌旁組織和結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620中提取總RNA。使用Super Script第一鏈cDNA試劑盒將合格的RNA[260 nm與280 nm處光密度(OD)比值(OD260 nm/280 nm)為1.8～2.0]轉(zhuǎn)化為cDNA。使用SYBR Premix ExTaq Ⅱ試劑盒在Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行qPCR, 以GAPDH量化lncRNA GATA3-AS1的相對(duì)表達(dá)。miR-574-3p水平使用Taq Man microRNA試劑盒按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè),以U6量化miR-574-3p的相對(duì)表達(dá)。使用2-△△Ct方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列: lncRNA GATA3-AS1正向5′-TTGTTCCCTCTTCGCTCCT-3′, 反向5′-TTGTTCCTTCACCGCATG-3′; miR-574-3p正向5′-ATCGGAAGTTGAGTGAGCCGCGTC-3′, 反向5′-GCCGTGAGTCAGGAGTGGT-3′。GAPDH正向5′-AGAACGGGAAGCTTGTCATC-3′, 反向5′-CATCGCCCCACTTGATTTTG-3′。U6正向5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′, 反向5′-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

轉(zhuǎn)染后,在96孔板中接種1×104個(gè)SW620細(xì)胞。孵育48 h后,加入10 μL CCK-8溶液, 37 ℃保持1 h。通過(guò)Synergy H4多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處OD(OD450 nm)。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成數(shù)

轉(zhuǎn)染后,在6孔板中接種200個(gè)SW620細(xì)胞。孵育14 d后,將細(xì)胞用4%甲醛37 ℃固定10 min, 0.5%結(jié)晶紫37 ℃染色15 min, 于顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)劃痕愈合率

通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估SW620細(xì)胞的體外遷移能力。轉(zhuǎn)染后,將1×105個(gè)細(xì)胞接種到6孔板中,待細(xì)胞融合成單層,用移液器吸頭垂直刮擦細(xì)胞單層。用磷酸鹽緩沖液洗滌后,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。使用顯微鏡觀察0 h和24 h的劃痕,通過(guò)ImageJ圖像分析軟件檢測(cè)劃痕愈合率。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

37 ℃條件下,用30 μg Matrigel對(duì)Transwell腔室膜預(yù)處理30 min, 形成重建的基底膜。將1×105個(gè)結(jié)直腸癌細(xì)胞(置于200 μL不含胎牛血清的RPMI-1640中)接種到Transwell腔室的上孔,下孔填充600 μL含有10%胎牛血清作為趨化劑的RPMI-1640。孵育48 h后,將細(xì)胞在4%甲醛中固定30 min, 然后用結(jié)晶紫染色15 min。用濕棉簽小心地從Transwell上表面(內(nèi)部)去除非侵襲細(xì)胞,用顯微鏡(放大倍數(shù)200倍)對(duì)侵襲細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)遷移侵襲相關(guān)蛋白E-cadherin和N-cadherin表達(dá)

轉(zhuǎn)染后,將SW620細(xì)胞在冰上裂解緩沖液中裂解,再將裂解液進(jìn)行離心(10 min, 12 000轉(zhuǎn)/min, 4 ℃), 并進(jìn)行BCA法定量?？偟鞍淄ㄟ^(guò)8%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,樣品在轉(zhuǎn)移緩沖液中電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂牛奶于37 ℃封閉2 h, 4 ℃條件下與抗E-cadherin(1∶1 000)、抗N-cadherin(1∶1 000)和抗GAPDH(1∶2 000)抗體孵育過(guò)夜。然后,將條帶與HRP偶聯(lián)的山羊抗兔IgG于37 ℃孵育2 h,通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行可視化。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)lncRNAGATA3-AS1與miR-574-3p的靶向關(guān)系

運(yùn)用生物信息學(xué)軟件LncBase Predicted v. 2預(yù)測(cè)lncRNA GATA3-AS1與miR-574-3p的靶向結(jié)合關(guān)系。將含有miR-574-3p潛在位點(diǎn)的lncRNA GATA3-AS1野生型(WT)或突變型(MUT)序列插入到pmirGLO載體中,合成WT-GATA3-AS1或MUT-GATA3-AS1。將1×104個(gè)SW620細(xì)胞接種到6孔板中,并使用Lipofectamine 2000將WT-GATA3-AS1或MUT-GATA3-AS1與miR-574-3p模擬物或?qū)φ誱iR-NC共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后,收獲細(xì)胞,使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。另向SW620細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-GATA3-AS1、si-NC、si-GATA3-AS1,分別設(shè)為pcDNA組、pcDNA-GATA3-AS1組、si-NC組、si-GATA3-AS1組, 48 h后通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)miR-574-3p表達(dá)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 lncRNA GATA3-AS1和miR-574-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

結(jié)直腸癌組織中l(wèi)ncRNA GATA3-AS1表達(dá)量高于癌旁組織(增加約3.24倍), miR-574-3p表達(dá)量低于癌旁組織(減少約0.62倍),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)表1。

表1 lncRNA GATA3-AS1、miR-574-3p在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.2 干擾lncRNA GATA3-AS1表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620增殖能力的影響

si-GATA3-AS1組SW620細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GATA3-AS1表達(dá)量、細(xì)胞增殖活性和克隆形成數(shù)均低于si-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)圖1、表2。

表2 干擾lncRNA GATA3-AS1表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620增殖能力的影響

2.3 干擾lncRNA GATA3-AS1表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620遷移和侵襲能力的影響

si-GATA3-AS1組SW620細(xì)胞的劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)和N-cadherin蛋白表達(dá)量均低于si-NC組,而E-cadherin蛋白表達(dá)量高于si-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)圖2、表3。

A: 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)劃痕愈合率; B: Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力; C: Western blot檢測(cè)遷移侵襲相關(guān)蛋白E-cadherin和N-cadherin表達(dá)。圖2 干擾lncRNA GATA3-AS1表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620遷移和侵襲能力的影響

表3 干擾lncRNA GATA3-AS1表達(dá)對(duì)SW620細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

2.4 lncRNA GATA3-AS1靶向調(diào)控miR-574-3p的表達(dá)

LncBase Predicted v.2預(yù)測(cè)結(jié)果顯示, lncRNA GATA3-AS1與miR-574-3p含有互補(bǔ)配對(duì)的堿基序列,見(jiàn)圖3。miR-574-3p模擬物與WT-GATA3-AS1共轉(zhuǎn)染的熒光素酶活性低于miR-NC與WT-GATA3-AS1共轉(zhuǎn)染,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 但miR-574-3p模擬物或miR-NC分別與MUT-GATA3-AS1共轉(zhuǎn)染的熒光素酶活性比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.850), 見(jiàn)表4。pcDNA組、pcDNA-GATA3-AS1組、si-NC組、si-GATA3-AS1組SW620細(xì)胞中miR-574-3p表達(dá)量分別為(1.00±0)、(0.41±0.05)、(0.98±0.06)、(2.84±0.24), pcDNA-GATA3-AS1組miR-574-3p表達(dá)量低于pcDNA組,si-GATA3-AS1組miR-574-3p表達(dá)量高于si-NC組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 lncRNA GATA3-AS1與miR-574-3p的靶向關(guān)系預(yù)測(cè)結(jié)果

表4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)結(jié)果

2.5 miR-574-3p過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620增殖、遷移和侵襲能力的影響

miR-574-3p組SW620細(xì)胞的miR-574-3p表達(dá)量高于miR-NC組,細(xì)胞增殖活性、克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)和N-cadherin蛋白表達(dá)量均低于miR-NC組, E-cadherin蛋白表達(dá)量高于miR-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)圖4、表5。

圖4 miR-574-3p過(guò)表達(dá)對(duì)SW620細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表5 miR-574-3p過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620增殖、遷移和侵襲能力的影響

2.6 抑制miR-574-3p表達(dá)對(duì)干擾lncRNAGATA3-AS1表達(dá)的SW620細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

si-GATA3-AS1+anti-miR-574-3p組SW620細(xì)胞的miR-574-3p表達(dá)量低于si-GATA3-AS1+anti-miR-NC組,細(xì)胞增殖活性、克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)和N-cadherin蛋白表達(dá)量均高于si-GATA3-AS1+anti-miR-NC組, E-cadherin蛋白表達(dá)量低于si-GATA3-AS1+anti-miR-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 表明抑制miR-574-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾lncRNA GATA3-AS1表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用,見(jiàn)圖5、表6。

表6 抑制miR-574-3p表達(dá)對(duì)干擾lncRNA GATA3-AS1表達(dá)的SW620細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖5 抑制miR-574-3p表達(dá)對(duì)干擾lncRNA GATA3-AS1表達(dá)的SW620細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

將合適的lncRNA作為診斷生物標(biāo)志物或干預(yù)靶點(diǎn),或可為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供新的思路。CONTRERAS-ESPINOSA L等[10]利用轉(zhuǎn)錄組分析將lncRNA GATA3-AS1鑒定為與局部晚期乳腺癌患者新輔助化療耐藥相關(guān)的lncRNA。ZHU Y P等[11]發(fā)現(xiàn), lncRNA GATA3-AS1在人膀胱癌組織中顯著上調(diào)。lncRNA GATA3-AS1在胰腺癌[7]、肝癌[8]和三陰性乳腺癌[12]組織和細(xì)胞中過(guò)表達(dá),敲低lncRNA GATA3-AS1可抑制胰腺癌、肝癌和三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖,并減弱胰腺癌細(xì)胞侵襲能力和肝癌細(xì)胞遷移能力。本研究發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸癌組織中l(wèi)ncRNA GATA3-AS1表達(dá)顯著上調(diào),提示其異常表達(dá)可能有助于結(jié)直腸癌的進(jìn)展(類(lèi)似其在胰腺癌、肝癌和三陰性乳腺癌中的致癌作用)。為了更好地了解lncRNA GATA3-AS1在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)作用,本研究進(jìn)一步開(kāi)展體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)干擾結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620中l(wèi)ncRNA GATA3-AS1表達(dá)能明顯抑制細(xì)胞增殖活性和克隆形成、遷移、侵襲能力,下調(diào)N-cadherin表達(dá)和上調(diào)E-cadherin表達(dá),表明干擾lncRNA GATA3-AS1表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620的遷移和侵襲能力。由此證實(shí), lncRNA GATA3-AS1作為致癌基因而加速結(jié)直腸癌的進(jìn)展。

據(jù)報(bào)道, miR-574-3p可在上皮性卵巢癌[13]、食管癌[14]和肝癌[15]中充當(dāng)抗腫瘤因子,抑制癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。miR-574-3p在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá),上調(diào)其表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。miR-574-3p在卵巢癌組織和細(xì)胞中低表達(dá),過(guò)表達(dá)miR-574-3p可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[17]。miR-574-3p過(guò)表達(dá)上調(diào)了胃癌細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá),同時(shí)下調(diào)了波形蛋白的表達(dá)[18]。本研究結(jié)果顯示, miR-574-3p在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)降低,且miR-574-3p過(guò)表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620的增殖、遷移和侵襲能力,表明miR-574-3p在結(jié)直腸癌進(jìn)展中起抑制作用。

lncRNA作為特定miRNA的ceRNA, 可調(diào)節(jié)基因表達(dá)[19]。例如, LINC00997通過(guò)與miR-574-3p相互作用,可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和自噬[20]。lncRNA ZEB2-AS1通過(guò)miR-574-3p/HMGA2軸促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[21]。為了深入了解lncRNA GATA3-AS1的潛在調(diào)控機(jī)制,本研究通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)了miR-574-3p與lncRNA GATA3-AS1的靶向關(guān)系,發(fā)現(xiàn)兩者含有互補(bǔ)配對(duì)的堿基序列,且該結(jié)果得到雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的證實(shí)。本研究中,結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620中l(wèi)ncRNA GATA3-AS1可負(fù)向調(diào)控miR-574-3p的表達(dá),這意味著lncRNA GATA3-AS1可直接結(jié)合miR-574-3p, 并破壞miR-574-3p的穩(wěn)定性。本研究還發(fā)現(xiàn),抑制miR-574-3p表達(dá)后,干擾lncRNA GATA3-AS1表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620增殖、遷移和侵襲的結(jié)果被逆轉(zhuǎn)。由此表明, lncRNA GATA3-AS1在結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620中充當(dāng)miR-574-3p的ceRNA, 從而發(fā)揮對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的調(diào)控作用。

綜上所述, lncRNA GATA3-AS1在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào),可通過(guò)調(diào)控miR-574-3p促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620的增殖、遷移和侵襲,提示lncRNA GATA3-AS1可能作為癌基因在結(jié)直腸癌中發(fā)揮作用,具有作為結(jié)直腸癌診斷生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值。