lncRNA NKILA對(duì)鼻咽癌細(xì)胞放射抵抗和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及其機(jī)制

張永濤，唐雪娣，徐楓鈔

自貢市第一人民醫(yī)院放射科，四川自貢643000

鼻咽癌是我國(guó)高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率不斷上升，已成為嚴(yán)重危害居民身心健康和生活質(zhì)量的重大疾病之一。目前，放療仍然是鼻咽癌最重要的治療手段，但部分患者存在原發(fā)性或繼發(fā)性放療不敏感，同時(shí)放療還可介導(dǎo)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），使得放療效果不佳［1］。研究發(fā)現(xiàn)，放療可誘導(dǎo)下咽癌細(xì)胞產(chǎn)生放射抵抗，并且放射抵抗細(xì)胞易發(fā)生EMT，導(dǎo)致其侵襲和遷移能力增強(qiáng)［2］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可通過(guò)調(diào)控基因的表達(dá)參與惡性腫瘤的生物學(xué)行為［3-4］。NKILA為lncRNA家族成員之一。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NKILA可通過(guò)調(diào)控NF-κB表達(dá)促進(jìn)喉癌細(xì)胞的增殖和侵襲；lncRNA NKILA還可通過(guò)下調(diào)miR-889-3p表達(dá)抑制肝癌的發(fā)生、發(fā)展。這些研究表明，lncRNA NKILA能夠通過(guò)調(diào)控miRNA表達(dá)對(duì)腫瘤產(chǎn)生一定影響。微小RNA-21（miR-21）是人類常見(jiàn)的原癌基因，與多種腫瘤的關(guān)系密切。miR-21在肺癌、胰腺癌、大腸癌等細(xì)胞中高表達(dá)，其高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲并抑制其凋亡［5-7］。生物信息學(xué)分析顯示，miR-21與lncRNA NKILA可能存在靶向調(diào)控關(guān)系，為lncRNA NKILA潛在的靶基因。但二者在鼻咽癌中的靶向調(diào)控關(guān)系尚不清楚。2022年2月—12月，本研究探討了lncRNA NKILA對(duì)鼻咽癌細(xì)胞放射抵抗和EMT的影響及其機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1.料與方法

1.1.料 人鼻咽癌細(xì)胞CNE2，購(gòu)自北京伊塔生物科技有限公司。SPF級(jí)SD裸鼠10只，雌雄各半，鼠齡5～6周，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自上?？祈樕锟萍加邢薰?，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）20190241。ProFlexTMPCR儀，購(gòu)自上海土森視覺(jué)科技有限公司。lncRNA NKILA、miR-21引物序列由廣州威佳科技有限公司設(shè)計(jì)合成；NKILA-mimic、NKILA-NC質(zhì)粒，購(gòu)自上海數(shù)譜生物科技有限公司。MTT，購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。E-cadherin、N-cadherin一抗，購(gòu)自北京義翹神州科技股份有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，購(gòu)自南京全隆生物技術(shù)有限公司。本研究經(jīng)自貢市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：Y2021-05-102）。

1.2.射抵抗細(xì)胞模型構(gòu)建 將CNE2細(xì)胞接種于含10% FBS和1%青鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)，按1∶3傳代。取傳4代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CNE2細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h，收集細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度至1 × 103/mL，分別予2、4、6、8、10 Gy X射線照射，每劑量照射2次，總劑量60 Gy。每次照射后，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%以上融合時(shí)，胰蛋白酶消化并傳代。穩(wěn)定傳代2次后，進(jìn)行下一次X射線照射。總劑量達(dá)到60 Gy后，檢測(cè)放射線抵抗能力，篩選放射抵抗的CNE2細(xì)胞（其SF2值為CNE2細(xì)胞的2倍）。1.3 分組轉(zhuǎn)染 收集上述細(xì)胞，接種于6孔板，隨機(jī)分為空白組、NC組、轉(zhuǎn)染組，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至75%融合時(shí)，參照文獻(xiàn)［8］按LipofectamineTM2000說(shuō)明，轉(zhuǎn)染組和NC組分別轉(zhuǎn)染NKILA-mimic、NKILA-NC質(zhì)粒?？瞻捉M不予轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染12 h，更換為無(wú)血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4.ncRNA NKILA、miR-21表達(dá)檢測(cè) 采用RT-qPCR法。取上述各組細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，然后將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：lncRNA NKILA上游引物5'-GGTAGGGCGATTGGCGAGAC-3'、下游引物5'-TTGCGAGGGCTGAAAATGGGGA-3'，miR-21上游引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'、下游引物5'-GCCGCTAGCTTATCAGACTGATGT-3'；U6上游引物5'-TTGAGGGATGCCCGATTGAG-3'、下游引物5'-TTGGAGGGCTGGAGGCGGGA-3'。按PCR擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明配制反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 45 s共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 8 min。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算lncRNA NKILA、miR-21相對(duì)表達(dá)量。

1.5.胞增殖能力檢測(cè) 采用MTT法。取上述各組細(xì)胞，接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)1、2、3、4、5天，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后加入DMSO 150 μL，輕輕振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度（OD）值。以O(shè)D570值代表細(xì)胞增殖能力。

1.6.胞侵襲和遷移能力檢測(cè) 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。①細(xì)胞侵襲能力：用Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室上室，靜置1 h；取上述各組細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，Transwell小室上室加入細(xì)胞懸液，下室加入完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；培養(yǎng)2天，甲醇固定20 min，結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)目。②細(xì)胞遷移能力：取上述各組細(xì)胞饑餓處理12 h，以無(wú)血清的培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至5 × 105/mL，Transwell小室上室加入細(xì)胞懸液，下室加入完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；培養(yǎng)16 h，甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)目。

1.7.-cadherin、N-cadherin表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取上述各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量合格。加入5 ×上樣緩沖液，100 ℃水浴變性。取變性蛋白，SDS-PAGE分離。電泳結(jié)束，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入E-cadherin、N-cadherin一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。次日洗膜后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，37 ℃孵育45 min。ECL發(fā)光，暗室內(nèi)顯影、曝光，凝膠成像儀拍照，Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8.向調(diào)控關(guān)系驗(yàn)證 通過(guò)TargetScan預(yù)測(cè)lncRNA NKILA與miR-21的靶向調(diào)控關(guān)系。取上述各組細(xì)胞，接種于6孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%以上融合時(shí)，按LipofectamineTM2000說(shuō)明將miR-21-3'-UTR-WT、miR-21-3'-UTR-MUT質(zhì)粒分別與NKILA-mimic質(zhì)?；騈KILA-NC質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染2天，收集細(xì)胞，按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)熒光素酶活性。

1.9.鼠移植瘤體積測(cè)量 取SD裸鼠10只，隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組各5只。觀察組與對(duì)照組分別于右前肢腋下注射轉(zhuǎn)染lncRNA NKILA的放射抵抗CNE2細(xì)胞、單純放射抵抗CNE2細(xì)胞各1 × 106個(gè)。常規(guī)飼養(yǎng)4周，處死裸鼠，分離移植瘤組織，測(cè)量瘤體短徑（W）和長(zhǎng)徑（L），按公式計(jì)算腫瘤體積（V）。V=L × W2/2。

1.10.計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.果

2.1.組lncRNA NKILA、miR-21表達(dá)比較 見(jiàn)表1。

表1.組lncRNA NKILA、miR-21相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表1.組lncRNA NKILA、miR-21相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與NC組比較，#P＜0.05。

組別空白組NC組轉(zhuǎn)染組F P lncRNA NKILA 1.00 ± 0.00 1.02 ± 0.03 1.62 ± 0.17*#74.980＜0.01 miR-21 1.00 ± 0.00 0.95 ± 0.04 0.49 ± 0.02*#711.300＜0.01

2.2.組細(xì)胞增殖能力比較 見(jiàn)表2。

表2.組不同時(shí)間細(xì)胞增殖能力比較（±s）

表2.組不同時(shí)間細(xì)胞增殖能力比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與NC組比較，#P＜0.05。

組別空白組NC組轉(zhuǎn)染組F P細(xì)胞增殖能力培養(yǎng)1天0.32 ± 0.03 0.31 ± 0.04 0.29 ± 0.02 1.448＞0.05培養(yǎng)2天0.52 ± 0.06 0.51 ± 0.05 0.38 ± 0.03*#15.690＜0.01培養(yǎng)3天0.74 ± 0.04 0.73 ± 0.06 0.51 ± 0.04*#44.740＜0.01培養(yǎng)4天1.25 ± 0.11 1.23 ± 0.14 0.64 ± 0.05*#63.210＜0.01培養(yǎng)5天1.70 ± 0.14 1.68 ± 0.17 1.02 ± 0.13*#41.210＜0.01

2.3 三組細(xì)胞侵襲和遷移能力比較 見(jiàn)表3。

表3.組細(xì)胞侵襲和遷移能力比較（個(gè)，±s）

表3.組細(xì)胞侵襲和遷移能力比較（個(gè)，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與NC組比較，#P＜0.05。

組別空白組NC組轉(zhuǎn)染組F P細(xì)胞侵襲數(shù)118.22 ± 8.31 115.27 ± 10.24 54.23 ± 4.52*#120.900＜0.01細(xì)胞遷移數(shù)246.21 ± 20.32 241.35 ± 23.41 72.48 ± 6.25*#76.200＜0.01

2.4.組E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表4。

表4.組E-cadherin、N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表4.組E-cadherin、N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與NC組比較，#P＜0.05。

組別空白組NC組轉(zhuǎn)染組F P E-cadherin 1.05 ± 0.08 1.07 ± 0.05 3.45 ± 0.37*#235.100＜0.01 N-cadherin 1.02 ± 0.07 1.04 ± 0.05 0.24 ± 0.03*#451.400＜0.01

2.5.ncRNA NKILA與miR-21的靶向調(diào)控關(guān)系TargetScan預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，lncRNA NKILA與miR-21存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖1。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染NKILA-mimic質(zhì)粒與miR-21-3'-UTR-WT、共轉(zhuǎn)染NKILA-NC質(zhì)粒與miR-21-3'-UTR-WT的CNE2細(xì)胞熒光素酶活性分別為0.84 ± 0.07、1.08 ± 0.07，共轉(zhuǎn)染NKILA-mimic質(zhì)粒與miR-21-3'-UTR-MUT、共轉(zhuǎn)染NKILA-NC質(zhì)粒與miR-21-3'-UTR-MUT的CNE2細(xì)胞熒光素酶活性分別為1.11 ± 0.12、1.14 ± 0.09。共轉(zhuǎn)染NKILA-mimic質(zhì)粒與miR-21-3'-UTR-WT的CNE2細(xì)胞熒光素酶活性低于共轉(zhuǎn)染NKILA-NC質(zhì)粒與miR-21-3'-UTR-WT的CNE2細(xì)胞（t=5.938，P＜0.05），而共轉(zhuǎn)染NKILA-mimic質(zhì)粒與miR-21-3'-UTR-MUT、共轉(zhuǎn)染NKILA-NC質(zhì)粒與miR-21-3'-UTR-MUT的CNE2細(xì)胞熒光素酶活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.745，P＞0.05）。

圖1.ncRNA NKILA與miR-21的靶向結(jié)合位點(diǎn)示意圖

2.6.組移植瘤體積比較 觀察組與對(duì)照組移植瘤體積分別為（0.70 ± 0.05）、（2.41 ± 0.08）cm3。觀察組移植瘤體積低于對(duì)照組（t=40.530，P＜0.05）。

3.論

目前，放療仍然是鼻咽癌最重要的治療手段，但部分患者存在原發(fā)性或繼發(fā)性放療不敏感，使得放療效果不佳，預(yù)后較差。但鼻咽癌細(xì)胞放射抵抗的具體機(jī)制尚不清楚。

lncRNA、miRNA均屬于非編碼RNA，作為重要的調(diào)控分子參與生命活動(dòng)過(guò)程。普遍認(rèn)為，miRNA、lncRNA與腫瘤細(xì)胞放射抵抗有關(guān)，可能是改善放療敏感性的潛在靶標(biāo)。lncRNA是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA。越來(lái)越多證據(jù)表明，lncRNA在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。lncRNA NKILA是lncRNA家族成員之一。有研究證實(shí)，lncRNA NKILA可通過(guò)靶向調(diào)控miR-1236-3p表達(dá)改善脂多糖誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞損傷［9］，提示lncRNA NKILA能夠靶向調(diào)控miRNA。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，也能參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生命活動(dòng)。miR-21是人類常見(jiàn)的原癌基因，與多種腫瘤關(guān)系密切。有研究報(bào)道，miR-21不僅能促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，還能參與調(diào)控食管癌細(xì)胞的放療敏感性［10］。羅軼等［11］研究報(bào)道，沉默miR-21可降低鼻咽癌細(xì)胞活性并抑制其放射抵抗。生物信息學(xué)分析顯示，miR-21與lncRNA NKILA可能存在靶向調(diào)控關(guān)系，為lncRNA NKILA潛在的靶基因。但二者在鼻咽癌中的靶向調(diào)控關(guān)系尚不清楚。

為了探究lncRNA NKILA對(duì)鼻咽癌細(xì)胞放射抵抗的影響及其機(jī)制，本研究構(gòu)建了鼻咽癌放射抵抗細(xì)胞模型并轉(zhuǎn)染NKILA-mimic質(zhì)粒，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NKILA-mimic質(zhì)粒后放射抵抗的CNE2細(xì)胞增殖能力顯著降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在放射抵抗的CNE2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染NKILA-mimic質(zhì)粒后miR-21表達(dá)降低，而轉(zhuǎn)染NKILA-NC質(zhì)粒后miR-21表達(dá)變化不明顯，提示miR-21可能是lncRNA NKILA的靶基因，lncRNA NKILA可能通過(guò)靶向抑制miR-21表達(dá)而抑制鼻咽癌細(xì)胞的放射抵抗。此外，本研究觀察組移植瘤體積顯著低于對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論。

放療敏感性與EMT密切相關(guān)，抑制腫瘤細(xì)胞EMT可能是增強(qiáng)放療敏感性的一種策略。在EMT過(guò)程中，細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變，呈梭形轉(zhuǎn)變，細(xì)胞極性喪失、黏附性降低，并獲得間質(zhì)細(xì)胞的表型特征，從而使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的侵襲和遷移能力。作為EMT的標(biāo)志性蛋白，E-cadherin低表達(dá)是EMT最顯著的特征，也是多種腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良的重要標(biāo)志物；N-cadherin表達(dá)增加，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞脫離原位并粘附基質(zhì)成分，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。有研究證實(shí)，鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)N-cadherin表達(dá)上調(diào)、E-cadherin表達(dá)下調(diào)，腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力顯著增強(qiáng)［12］。有研究報(bào)道，miR-21可上調(diào)腫瘤細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)，抑制EMT發(fā)生，從而降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力［13］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組E-cadherin表達(dá)顯著高于空白組和NC組，N-cadherin表達(dá)及細(xì)胞侵襲和遷移能力顯著低于空白組和NC組，提示lncRNA NKILA能夠阻滯鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而抑制其侵襲和遷移。李歡慶等［14］研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-21能夠上調(diào)E-cadherin表達(dá)、下調(diào)Vimentin表達(dá)，阻滯鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生EMT，抑制其侵襲和遷移。張印松等［15］研究報(bào)道，lncRNA NKILA通過(guò)靶向抑制NF-κB表達(dá)，抑制喉癌細(xì)胞的侵襲能力。LIU等［16］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NKILA可通過(guò)調(diào)控IL-11/STAT3信號(hào)通路，抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移。本研究經(jīng)TargetScan預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，lncRNA NKILA能夠靶向抑制miR-21表達(dá)，抑制鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生EMT，從而抑制其侵襲和遷移。

綜上所述，lncRNA NKILA可能通過(guò)靶向抑制miR-21表達(dá)而抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，繼而抑制鼻咽癌細(xì)胞的放射抵抗和EMT。