骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體中l(wèi)ncRNA SNHG12對(duì)心肌細(xì)胞的影響及其機(jī)制

王德霞，趙勇，李榮，辛輝

1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，山東青島266000；2 棗莊市山亭區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科

心肌梗死是臨床常見的心血管疾病，近年來(lái)其發(fā)病率和死亡率居高不下，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量甚至危及生命［1］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是一種來(lái)源于骨髓的多能干細(xì)胞，具有體外擴(kuò)增能力強(qiáng)、免疫原性低和多向分化潛能等特點(diǎn)，是組織工程和細(xì)胞治療的常用種子細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后移植BMSCs能夠顯著促進(jìn)梗死區(qū)域新生血管形成和受損心肌修復(fù)［2］。而BMSCs來(lái)源的外泌體被證實(shí)可提供與BMSCs相似的心臟保護(hù)作用［3］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的RNA分子，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA機(jī)制參與多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展［4-5］。小核仁RNA宿主基因12（SNHG12）是一種具有低編碼概率的lncRNA，在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并扮演致癌基因的角色［6］。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SNHG12可通過(guò)miR-218-5p/胰島素樣生長(zhǎng)因子2軸調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化中氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷［7］，提示lncRNA SNHG12能夠抑制心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。但lncRNA SNHG12對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)的作用機(jī)制尚未闡明。2022年2月—2023年3月，本研究探討了BMSCs來(lái)源外泌體中l(wèi)ncRNA SNHG12對(duì)心肌細(xì)胞的影響及其機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1.料與方法

1.1.料 大鼠BMSCs及心肌細(xì)胞H9c2，購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。SNHG12、SH-沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）、miR-138-5p抑制劑及其相應(yīng)的陰性對(duì)照，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。IX51倒置顯微鏡，購(gòu)自日本Olympus公司；凝膠成像儀，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。CD9、CD63一抗，購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；腫瘤易感基因101（TSG101）、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（NLRP3）、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）、剪切的半胱氨酸蛋白酶1（Cleaved-Caspase-1）、剪切的焦孔素D（Cleaved-GSDMD）一抗，購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。IgG二抗，購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司。外泌體提取試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒，購(gòu)自美國(guó)R&D公司；CCK-8試劑盒，購(gòu)自美國(guó)GLPBIO公司。

1.2.MSCs轉(zhuǎn)染與外泌體提取 采用貼壁法分離培養(yǎng)BMSCs并傳代。取傳3代BMSCs細(xì)胞3 × 105個(gè)，接種至6孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待BMSCs生長(zhǎng)至40%～60%融合時(shí)，按Lipofectamine?3000說(shuō)明分別轉(zhuǎn)染SNHG12。轉(zhuǎn)染48 h，收獲細(xì)胞并分離外泌體。當(dāng)BMSCs生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，用無(wú)外泌體的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，收集上清液。上清液以2 000 × g離心20 min，再以10 000 × g離心40 min，然后用0.22 μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾。將上清液以100 000 × g超速離心70 min，重懸于PBS中，再以100 000 × g離心70 min除去任何剩余的RNA，并用含PBS和RNAse Ⅰ的混合物稀釋，最終獲得外泌體懸浮液。

1.3.MSCs來(lái)源外泌體鑒定 取部分外泌體懸浮液，加入適量RIPA裂解液充分裂解，提取外泌體總蛋白。加入蛋白上樣緩沖液，煮沸變性。取變性蛋白，SDS-PAGE分離。電泳結(jié)束，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上。TBST洗膜，5%脫脂牛奶室溫封閉，然后分別加入CD9、CD63、TSG101一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，TBST洗膜后滴加IgG二抗，室溫孵育1 h。TBST洗膜，ECL發(fā)光，凝膠成像儀曝光并采集圖像。

1.4.氧模型建立 取H9c2細(xì)胞，隨機(jī)分為陰性對(duì)照（NC）外泌體組與SNHG12外泌體組，分別加入等體積NC外泌體、SNHG12外泌體轉(zhuǎn)染；SNHG12外泌體 + miR138-5p抑制劑組與SNHG12外泌體 + NC抑制劑組，分別加入等體積SNHG12外泌體 +miR138-5p抑制劑及SNHG12外泌體 + NC抑制劑轉(zhuǎn)染；SNHG12外泌體 + SH-NC組與SNHG12外泌體 +SH-SIRT1組，分別加入等體積SNHG12外泌體 +SH-NC及SNHG12外泌體 + SH-SIRT1轉(zhuǎn)染。然后根據(jù)KOYAMA等［8］的方法制備缺氧溶液，將各組細(xì)胞與缺氧溶液共孵育6 h，建立體外缺氧細(xì)胞模型。

1.5.癥因子檢測(cè) 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，離心留取上清液。采用ELISA法檢測(cè)上清液IL-1β、IL-18。

1.6.泌體特異性生物標(biāo)志物及細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液充分裂解，提取細(xì)胞總蛋白。加入蛋白上樣緩沖液，煮沸變性。取變性蛋白，SDS-PAGE分離。電泳結(jié)束，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上。TBST洗膜，5%脫脂牛奶室溫封閉，然后分別加入NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，TBST洗膜后滴加IgG二抗，室溫孵育1 h。TBST洗膜，ECL發(fā)光，凝膠成像儀曝光并采集圖像。采用Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。

1.7.胞活力檢測(cè) 采用CCK-8法。收集各組細(xì)胞，接種至96孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育2 h。酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度（OD）值。

1.8.胞凋亡率檢測(cè) 采用TUNEL法。收集各組細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，PBS潤(rùn)洗，置于冰上并使用0.1%Triton X-100透化處理，然后加入TUNEL反應(yīng)液，室溫黑暗孵育1 h。PBS洗滌，DAPI襯染細(xì)胞核。熒光顯微鏡下采集圖像，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=每視野TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù) × 100%。

1.9.計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad7.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，結(jié)果比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.果

2.1.MSCs來(lái)源外泌體鑒定 經(jīng)鑒定，BMSCs來(lái)源外泌體特異性標(biāo)志物CD9、CD63、TSG101表達(dá)均呈陽(yáng)性，證實(shí)成功獲取BMSCs來(lái)源外泌體。

2.2.MSCs來(lái)源外泌體中SNHG12對(duì)體外缺氧心肌細(xì)胞的影響 NC外泌體組與SNHG12外泌體組細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞活力及上清液IL-1β、IL-18水平比較見表1，NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表達(dá)比較見表2。

表1.C外泌體組與SNHG12外泌體組細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞活力及上清液IL-1β、IL-18水平比較（±s）

表1.C外泌體組與SNHG12外泌體組細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞活力及上清液IL-1β、IL-18水平比較（±s）

注：與NC外泌體組比較，*P＜0.05。

組別NC外泌體組SNHG12外泌體組細(xì)胞凋亡率（%）18.20 ± 3.03 14.00 ± 1.53*細(xì)胞活力（%）1.55 ± 0.32 2.39 ± 0.34*IL-1β（pg/mL）347.26 ± 18.06 99.68 ± 11.95*IL-18（pg/mL）194.59 ± 6.01 72.15 ± 10.34*

表2.C外泌體組與SNHG12外泌體組NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表2.C外泌體組與SNHG12外泌體組NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與NC外泌體組比較，*P＜0.05。

組別NC外泌體組SNHG12外泌體組0.32 ± 0.04 0.15 ± 0.03*0.33 ± 0.07 0.18 ± 0.04*0.34 ± 0.06 0.17 ± 0.05*0.37 ± 0.07 0.21 ± 0.06*NLRP3ASCCleaved-Caspase-1Cleaved-GSDMD

2.3.調(diào)miR-138-5p表達(dá)后BMSCs來(lái)源外泌體中SNHG12對(duì)體外缺氧心肌細(xì)胞的影響 在缺氧心肌細(xì)胞中，下調(diào)miR-138-5p表達(dá)后，BMSCs來(lái)源外泌體中SNHG12可導(dǎo)致NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞活力升高、細(xì)胞凋亡率降低（P均＜0.05），見表3、4。

表3.NHG12外泌體 + NC抑制劑組與SNHG12外泌體 + miR-138-5p抑制劑組NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1和Cleaved-GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3.NHG12外泌體 + NC抑制劑組與SNHG12外泌體 + miR-138-5p抑制劑組NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1和Cleaved-GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與SNHG12外泌體 + NC抑制劑組比較，*P＜0.05。

組別SNHG12外泌體 + NC抑制劑組SNHG12外泌體 + miR-138-5p抑制劑組NLRP3 0.56 ± 0.11 0.37 ± 0.05*ASC 0.29 ± 0.03 0.15 ± 0.03*Cleaved-Caspase-1 0.61 ± 0.03 0.53 ± 0.14*Cleaved-GSDMD 0.42 ± 0.04 0.22 ± 0.04*

表4.NHG12外泌體 + NC抑制劑組與SNHG12外泌體 + miR-138-5p抑制劑組細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

表4.NHG12外泌體 + NC抑制劑組與SNHG12外泌體 + miR-138-5p抑制劑組細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

注：與SNHG12外泌體 + NC抑制劑組比較，*P＜0.05。

組別SNHG12 外泌體 + NC抑制劑組SNHG12 外泌體 + miR-138-5p抑制劑組細(xì)胞活力1.71 ± 0.26 2.06 ± 0.37*細(xì)胞凋亡率27.04 ± 3.52 19.83 ± 2.27*

2.4.調(diào)SIRT1表達(dá)后BMSCs來(lái)源外泌體中SNHG12對(duì)體外缺氧心肌細(xì)胞的影響 在缺氧心肌細(xì)胞中，下調(diào)SIRT1表達(dá)后，BMSCs來(lái)源外泌體中SNHG12可導(dǎo)致NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞活力降低、細(xì)胞凋亡率升高（P均＜0.05），見表5、6。

表5.NHG12外泌體 + SH-NC組與SNHG12外泌體 + SH-SIRT1組NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1和Cleaved-GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表5.NHG12外泌體 + SH-NC組與SNHG12外泌體 + SH-SIRT1組NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1和Cleaved-GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與SNHG12外泌體 + SH-NC組比較，*P＜0.05。

組別SNHG12外泌體 + SH-NC組SNHG12外泌體 + SH-SIRT1組NLRP3 0.20 ± 0.05 0.48 ± 0.04*ASC 0.48 ± 0.08 0.64 ± 0.10*Cleaved-Caspase-1 0.39 ± 0.05 0.50 ± 0.02*Cleaved-GSDMD 0.33 ± 0.02 0.49 ± 0.16*

表6.NHG12外泌體 + SH-NC組與SNHG12外泌體 +SH-SIRT1組細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

表6.NHG12外泌體 + SH-NC組與SNHG12外泌體 +SH-SIRT1組細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

注：與SNHG12外泌體 + SH-NC組比較，*P＜0.05。

組別SNHG12 外泌體 + SH-NC組SNHG12 外泌體 + SH-SIRT1組細(xì)胞活力1.44 ± 0.20 0.99 ± 0.27*細(xì)胞凋亡率18.30 ± 1.55 21.23 ± 2.86*

3.論

心肌梗死是臨床常見的急危重癥之一，典型臨床表現(xiàn)為突然發(fā)作劇烈而持久的胸骨后或心前區(qū)壓榨性疼痛，休息或含服硝酸甘油不能緩解，常伴有煩躁不安、出汗、恐懼或?yàn)l死感。在心肌梗死過(guò)程中，當(dāng)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂或急性血栓形成時(shí)，會(huì)導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧和能量代謝障礙，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡［9］。因此，挽救和修復(fù)受損的心肌細(xì)胞是心肌梗死治療的重要目標(biāo)。

BMSCs是一類起源于中胚層的成體干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能，是當(dāng)前再生醫(yī)學(xué)中最有潛力的種子細(xì)胞。外泌體是一種由活體細(xì)胞通過(guò)胞吐方式釋放的小囊泡，其內(nèi)包含細(xì)胞的DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)，可介導(dǎo)細(xì)胞間的信息傳遞。近年來(lái)，外泌體已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于臨床疾病診治和生物技術(shù)領(lǐng)域，如干細(xì)胞治療、基因遞送、藥物運(yùn)載等。將外泌體注射到心肌梗死早期的心肌組織中，能夠顯著抑制心肌細(xì)胞凋亡［10］。研究表明，BMSCs可通過(guò)釋放外泌體的方式，提供多種生物活性分子來(lái)修復(fù)受損的心肌細(xì)胞、減少梗死周邊區(qū)域的心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)損傷心肌的再生性修復(fù)［11］。lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的RNA分子，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA機(jī)制參與多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展［4-5］。在心血管疾病中，lncRNA已被證實(shí)可通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖、凋亡以及心肌肥厚、纖維化和血管生成等，改善心功能障礙［12］。外泌體來(lái)源lncRNA可抑制心肌細(xì)胞凋亡和焦亡，從而發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用［13］。BMSCs衍生的外泌體lncRNA mir9-3hg可通過(guò)Pum2/PRDX6軸抑制缺血再灌注小鼠心肌細(xì)胞鐵死亡［14］。lncRNA SNHG12是一種具有低編碼概率的lncRNA，定位于人染色體1q25.1區(qū)域。有研究報(bào)道，SNHG12高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、阻遏細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡以及誘導(dǎo)腫瘤新生血管形成等，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［6］。因此，lncRNA SNHG12被認(rèn)為是一種潛在的腫瘤診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。但在心肌梗死中BMSCs來(lái)源外泌體中l(wèi)ncRNA SNHG12對(duì)心肌細(xì)胞的影響及其機(jī)制尚不清楚。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體外缺氧細(xì)胞中，SNHG12外泌體組細(xì)胞凋亡率顯著低于NC外泌體組，細(xì)胞活力顯著高于NC外泌體組。提示BMSCs來(lái)源外泌體中l(wèi)ncRNA SNHG12對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。心肌梗死后會(huì)引起強(qiáng)烈的全身和局部炎癥反應(yīng)，抑制或減弱炎癥反應(yīng)有利于心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞存活［15］。細(xì)胞焦亡是一種炎癥性細(xì)胞程序性死亡方式。Caspase-1在細(xì)胞焦亡中起著至關(guān)重要的作用，Caspase-1激活可觸發(fā)炎癥因子IL-1β、IL-18釋放［16］。靶向細(xì)胞焦亡的抑制劑可減少心肌梗死面積和抑制炎癥反應(yīng)。細(xì)胞焦亡的特征在于GSDMD介導(dǎo)的膜孔形成，細(xì)胞腫脹和快速裂解，隨后大量釋放促炎癥介質(zhì)［17］。NLRP3是啟動(dòng)細(xì)胞焦亡的必要條件，心肌梗死患者血漿NLRP3水平顯著升高［18］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體外缺氧細(xì)胞中，SNHG12外泌體組NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表達(dá)和上清液IL-1β、IL-18水平均顯著低于NC外泌體組，細(xì)胞活力顯著高于NC外泌體組。提示BMSCs來(lái)源外泌體中l(wèi)ncRNA SNHG12能夠抑制心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及心肌細(xì)胞焦亡和凋亡。抑制miR-138-5p表達(dá)和過(guò)表達(dá)SNHG12均可上調(diào)SIRT1表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1在心肌梗死中具有心肌保護(hù)作用，敲除SIRT1基因小鼠心肌梗死面積顯著增大，而過(guò)表達(dá)SIRT1基因小鼠心肌梗死面積顯著縮?。?9］。有研究證實(shí)，miR-138-5p可特異性結(jié)合SIRT1［20］，而lncRNA SNHG12可靶向miR-138-5p［21］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-138-5p表達(dá)后，BMSCs來(lái)源外泌體中SNHG12可導(dǎo)致NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表達(dá)顯著降低，細(xì)胞活力顯著升高、細(xì)胞凋亡率顯著降低；下調(diào)SIRT1表達(dá)后，BMSCs來(lái)源外泌體中SNHG12可導(dǎo)致NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表達(dá)顯著升高，細(xì)胞活力顯著降低、細(xì)胞凋亡率顯著升高。提示BMSCs來(lái)源外泌體中l(wèi)ncRNA SNHG12可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-138-5p/SIRT1軸抑制心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及心肌細(xì)胞焦亡和凋亡。

綜上所述，BMSCs來(lái)源外泌體中l(wèi)ncRNA SNHG12可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-138-5p/SIRT1軸抑制心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及心肌細(xì)胞焦亡和凋亡，從而發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。