慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者血清miR-181a和Smad7 mRNA表達(dá)變化及其臨床意義

梁穎雋，張小瑜，李小波

1 中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，成都610021；2 成都市第七人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種以持續(xù)性氣流受限為特征的慢性氣道炎癥性疾病。近年來，隨著人口老齡化進(jìn)程加速和環(huán)境污染加劇，我國(guó)COPD的發(fā)病率逐年上升，COPD已成為影響我國(guó)居民健康的重要公共衛(wèi)生問題之一［1］。慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）是指在疾病過程中，短期內(nèi)咳嗽、咳痰、氣短和（或）喘息加重、痰量增多，呈膿性或黏液膿性，可伴發(fā)熱或其他癥狀，是導(dǎo)致患者住院和死亡的重要原因［2］。因此，準(zhǔn)確評(píng)估AECOPD及其病情嚴(yán)重程度，是COPD患者個(gè)體化評(píng)估與管理策略的關(guān)鍵。慢性氣道炎癥和氣道重塑是COPD發(fā)生、發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)［3］。微小RNA（miRNA）是一類具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼小分子RNA。有研究證實(shí)，miRNA能夠通過對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)在呼吸系統(tǒng)炎癥反應(yīng)中扮演重要角色［4］。miR-181a是一種體內(nèi)組織炎癥應(yīng)激性miRNA，其基因定位于人染色體1q32.1。有研究通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，COPD患者外周血miR-181a異常表達(dá)［5］。Smad同源物7（Smad7）是一種重要的抑制型Smad蛋白，可通過多種途徑抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）信號(hào)通路激活，進(jìn)而抑制氣道炎癥反應(yīng)［6］。雖然miR-181a、Smad7均能參與呼吸系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，但二者與AECOPD病情嚴(yán)重程度和氣道重塑的關(guān)系尚不清楚。鑒于此，本研究觀察了AECOPD患者血清miR-181a、Smad7 mRNA表達(dá)變化，并探討二者表達(dá)變化與病情嚴(yán)重程度和氣道重塑的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1.料與方法

1.1.床資料 選擇2020年5月—2022年5月中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院呼吸科收治的AECOPD患者121例（AECOPD組）、慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期（SCOPD）患者45例（SCOPD組）。AECOPD和SCOPD診斷依據(jù)《慢性阻塞性肺疾病基層診療指南（2018年）》［7］。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合AECOPD、SCOPD診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡≥18歲；③病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肺結(jié)核、支氣管哮喘、間質(zhì)性肺病等其他肺部疾病者；②合并造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、精神或神經(jīng)系統(tǒng)損害者；③合并惡性腫瘤者；④合并心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重功能障礙者；⑤既往有心、肺手術(shù)史者；⑥長(zhǎng)期濫用藥物或有藥物依賴史者。其中，AECOPD組男85例、女36例，年齡36～87（61.85 ± 8.17）歲，BMI 18.54～28.82（22.68 ±2.19）kg/m2，病情嚴(yán)重程度［8］：輕度52例、中度46例、重度23例；SCOPD組男32例、女13例，年齡32～85（60.41 ± 7.26）歲，BMI 17.91～28.11（22.42 ±2.07）kg/m2。另選同期在中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院體檢健康的志愿者42例（對(duì)照組），男31例、女11例，年齡24～78（59.72 ± 7.16）歲，BMI 18.09～27.53（22.81 ± 1.98）kg/m2。三組性別、年齡、BMI具有可比性。本研究經(jīng)中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：2020-02-142），所有研究對(duì)象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2.清miR-181a、Smad7 mRNA表達(dá)檢測(cè) 所有研究對(duì)象入組后采集空腹外周靜脈血3 mL，1 500×g離心10 min，留取上層血清。采用TRIzol法提取血清總RNA，經(jīng)Nano-300微量分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。以cDNA為模板，按PCR擴(kuò)增試劑盒說明進(jìn)行擴(kuò)增。所有引物序列由上海新貝生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：miR-181a上游引物5'-GTCCAGATGCTGTACCTTCCTC-3'、下游引物5'-GCGAGTCTTCTCCCCAGTAT-3'，內(nèi)參U6上游引物5'-AGCGCCTTGACCTGGACA-3'、下游引物5'-TCGGCGTGCTCTGGAAAA-3'；Smad7上游引物5'-GACATGTTCAGCTTTGTGGACCTC-3'、下游引物5'-GGGACCCTTAGGCCATTGTGTA-3'，內(nèi)參GAPDH上游引物5'-CCGAGGGTCATCGATGACGT-3'、下游引物5'-ACAATTCCCACTTTGAGCTC-3'。PCR反應(yīng)體系共20 μL：cDNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，2 × TransStart?Top Green qPCR SurperMix 10 μL，無核酸酶水8 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃30 s、72 ℃ 15 s共40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，獲取循環(huán)閾值（CT）數(shù)。分別以U6或GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算血清miR-181a、Smad7 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.道重塑評(píng)價(jià) 所有研究對(duì)象入組后接受胸部CT掃描。取仰臥位，雙臂上舉，屈曲抱頭，采用16排螺旋CT行胸部高分辨率掃描，測(cè)量氣道腔內(nèi)徑（L）、氣道腔外徑（D）、氣道壁面積（WA）、氣道總橫截面積，計(jì)算氣道壁厚度（T）與D比值（T/D）、WA占?xì)獾揽倷M截面積百分比（WA%）。T/D=（D/2-L/2）/D，WA%=（氣道總橫截面積-WA）/氣道總橫截面積。

1.4.計(jì)學(xué)方法 采用SPSS28.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson或Spearman相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.果

2.1.組血清miR-181a、Smad7 mRNA表達(dá)以及T/D、WA%比較 見表1。

表1.組血清miR-181a、Smad7 mRNA表達(dá)以及T/D、WA%比較

2.2.同病情嚴(yán)重程度AECOPD患者血清miR-181a、Smad7 mRNA表達(dá)以及T/D、WA%比較 見表2。

表2.同病情嚴(yán)重程度AECOPD患者血清miR-181a、Smad7 mRNA表達(dá)以及T/D、WA%比較

2.3.ECOPD患者血清miR-181a、Smad7 mRNA表達(dá)與病情嚴(yán)重程度和氣道重塑的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析顯示，AECOPD患者血清miR-181a表達(dá)與Smad7 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.716，P＜0.01）。Spearman相關(guān)分析顯示，AECOPD患者血清miR-181a表達(dá)與病情嚴(yán)重程度和WA%、T/D均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（rs分別為-0.662、-0.681，P均＜0.01），血清Smad7 mRNA表達(dá)與病情嚴(yán)重程度和WA%、T/D亦均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（rs分別為-0.667、-0.672，P均＜0.01）。

3.論

COPD是臨床最常見的慢性氣道炎癥性疾病，其病理學(xué)改變主要是氣道和（或）肺泡異常。COPD的發(fā)生通常認(rèn)為與氣道和肺臟對(duì)有害顆?；驓怏w的慢性炎癥反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)。AECOPD不僅會(huì)加重患者主訴癥狀，還會(huì)引起多器官或系統(tǒng)功能損傷，是導(dǎo)致患者住院和死亡的重要原因［8-9］。在我國(guó)COPD患者每年發(fā)生0.5～3.5次急性加重，并且首次發(fā)生急性加重后，急性加重風(fēng)險(xiǎn)和病情嚴(yán)重程度會(huì)進(jìn)一步增加，難以恢復(fù)至急性加重前狀態(tài)。但現(xiàn)階段臨床較多AECOPD患者病情未能及時(shí)得以評(píng)估和控制，最終引起心腦血管合并癥、呼吸衰竭甚至死亡［10］。因此，準(zhǔn)確評(píng)估AECOPD及其病情嚴(yán)重程度，是COPD患者個(gè)體化評(píng)估與管理策略的關(guān)鍵。

氣道炎癥是COPD發(fā)生、發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)之一，而持續(xù)的氣道炎癥能夠引起氣道上皮反復(fù)損傷和修復(fù)，驅(qū)動(dòng)氣道重塑導(dǎo)致氣流受限、黏液分泌增多和肺泡被破壞，從而促進(jìn)AECOPD的發(fā)生、發(fā)展［2］。近年隨著對(duì)表觀遺傳學(xué)研究的不斷深入，越來越多證據(jù)表明，miRNA能夠通過引起mRNA降解或轉(zhuǎn)錄后基因沉默參與COPD的發(fā)生、發(fā)展［4］。miR-181a是一個(gè)與炎癥反應(yīng)高度相關(guān)的miRNA，可參與炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展。張瑜等［11］研究報(bào)道，miR-181a能夠通過Th17/Treg抑制急性胰腺炎患者炎癥反應(yīng)。LIU等［12］研究表明，miR-181a能夠靶向腫瘤壞死因子α改善糖尿病腎病的炎癥反應(yīng)。在急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-181a表達(dá)能夠抑制肺部炎癥［13］。上述研究表明，miR-181a作為一種抗炎miRNA可參與AECOPD的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組、SCOPD組、AECOPD組血清miR-181a表達(dá)依次降低；隨著AECOPD患者病情加重，血清miR-181a表達(dá)逐漸降低。結(jié)果提示，血清miR-181a表達(dá)降低與AECOPD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

TGF-β信號(hào)通路是調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)的重要信號(hào)通路，其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與氣道炎癥密切相關(guān)［14］。Smad是TGF-β家族受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。Smad7是一種重要的抑制型Smad蛋白，能夠通過與轉(zhuǎn)錄抑制劑相互作用或干擾Smad-DNA復(fù)合物形成，抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路，繼而抑制炎癥反應(yīng)［6，15］。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組、SCOPD組、AECOPD組血清Smad7 mRNA表達(dá)依次降低；隨著AECOPD患者病情加重，血清Smad7 mRNA表達(dá)逐漸降低。結(jié)果表明，血清Smad7 mRNA表達(dá)降低與AECOPD的發(fā)生、發(fā)展亦密切相關(guān)。

T/D、WA%是臨床評(píng)估氣道重塑的常用指標(biāo)。COPD患者由于氣道上皮反復(fù)損傷和修復(fù)可導(dǎo)致氣道重塑，故T/D、WA%會(huì)顯著升高［2］。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組、SCOPD組、AECOPD組T/D和WA%依次升高；隨著AECOPD患者病情加重，T/D和WA%逐漸升高。結(jié)果表明，AECOPD患者存在明顯的氣道重塑情況，并且病情嚴(yán)重程度越重，氣道重塑越明顯。

本研究相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，AECOPD患者血清miR-181a、Smad7 mRNA表達(dá)與WA%、T/D均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。提示血清miR-181a、Smad7 mRNA表達(dá)降低可通過促進(jìn)氣道重塑參與AECOPD病情進(jìn)展。究其原因，miR-181a具有抗炎作用，其表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致氣道炎癥持續(xù)發(fā)展，從而促進(jìn)氣道重塑，最終導(dǎo)致病情加重［16］；Smad7能夠抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路介導(dǎo)的氣道炎癥，而Smad7 mRNA表達(dá)下調(diào)則導(dǎo)致TGF-β/Smad信號(hào)通路激活，從而促進(jìn)氣道炎癥持續(xù)發(fā)展并進(jìn)展為氣道重塑［17］。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，AECOPD患者血清miR-181a表達(dá)與Smad7 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，提示二者可能協(xié)同促進(jìn)氣道重塑繼而參與AECOPD進(jìn)展。最近王雅杰等［18］研究證實(shí)，上調(diào)miR-181a表達(dá)可誘導(dǎo)Smad7表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而改善COPD大鼠氣道重塑。但二者協(xié)同作用的具體機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，AECOPD患者血清miR-181a、Smad7 mRNA表達(dá)降低，二者表達(dá)變化與病情嚴(yán)重程度和氣道重塑密切相關(guān)。