鴉膽子苦醇對IMQ誘導的小鼠銀屑病樣皮損的療效及其機制研究

陳茜 韓曉鳳 唐雪勇 龔娟 胡祥宇

摘要： ?目的 ?探究鴉膽子苦醇對balb/c小鼠銀屑病模型的療效及對相關(guān)炎癥因子的影響。 方法 ?將6-8周齡雌性balb/c小鼠隨機分為：正常對照組、模型組、卡泊三醇組、鴉膽子苦醇高、中、低劑量組， n =6。小鼠背部剃毛，連續(xù)7天62.5mg IMQ涂抹造模，同上各組小鼠分別給予對應干預治療。記錄形態(tài)學變化并行PASI評分，干預結(jié)束后行常規(guī)HE染色，實時熒光定量PCR法檢測組織NF-κB、CK1、CK10、TNF-α、IL-1β、IL-17的mRNA表達水平，蛋白免疫印跡法檢測NF-κB、pNF-κB、CK10、TNF-α等相關(guān)蛋白表達水平。ELISA檢測血清 細胞因子IL-1β、IL-17、IL-6表達水平。 結(jié)果 ?鴉膽子苦醇治療后，小鼠銀屑病樣皮損明顯減輕，高中低劑量組PASI評分較模型組均有明顯好轉(zhuǎn)（ P <0.05），HE結(jié)果顯示鴉膽子苦醇治療組角質(zhì)層增厚情況較模型組明顯減輕，且表皮平整，表皮突恢復平整，炎癥細胞浸潤減輕。Real-time PCR、 Western blot 及ELISA結(jié)果經(jīng)治療后相關(guān)因子均明顯表達下調(diào)（ P <0.001）。 結(jié)論 ?鴉膽子苦醇有效減輕了銀屑病小鼠皮損癥狀，這種改善作用可能通過NF-KB及相關(guān)炎癥因子信號通路調(diào)控。

關(guān)鍵詞： ?銀屑??；鴉膽子苦醇；NF-κB信號通路

中圖分類號 ：R758.63 ???文獻標志碼 ：A ???文章編號 ：1007-2349（2023）08-0076-06

Study o the Effect and Mechanism of Brusatol on Psoriatic Lesions Induced by IMQ in Mice

CHEN Qian， HAN Xiao-Feng， TANG Xue-Yong， GONG Juan， HU Xiang-Yu

（Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine/Chongqing First People's Hospital， Chongqing 400011， China）

【Abstract】 Objective： To study the effect of brusatol on balb/c mouse psoriasis model and related inflammatory factors. Methods： Female balb/c mice aged 6-8 weeks were randomly divided into normal control group， model group， calcipotriol group， and brusatol groups of high-dose， medium-dose and low-dose （ n =6）. The back of mice was shaved， 62.5mg IMQ was applied for seven consecutive days， and corresponding intervention treatment was given to the mice in the same groups as above. Morphological changes and PASI score were recorded， and routine HE staining was performed after the intervention. The mRNA expression levels of NF-κB， CK1， CK10， TNF-α， IL-1β and IL-17 were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The expression levels of NF-κB， pNF-κB， CK10， TNF-α and other related proteins were detected by Western Blot. The expression levels of serum cytokines IL-1β， IL-17 and IL-6 were detected by ELISA. Results： The psoriatic skin lesions of the mice were significantly alleviated after treatment with brusatol， and PASI scores of the high， medium and low dose groups were significantly improved compared with the model group （ P <0.05）. HE results showed that cholebrachitol treatment group was significantly alleviated compared with the model group. The epidermis was smooth， the epidermal process was restored and the inflammatory cell infiltration was alleviated. Results： The results of Real-time PCR， Western Blot and ELISA after treatment， the expression of related factors were significantly down-regulated （ P <0.001）. Conclusion： Brusatol can effectively reduce the symptoms of psoriasis in mice， and this improvement may be regulated by NF-KB and related inflammatory factor signaling pathways.

【Key words】 Psoriasis; Brusatol; NF-κB Signaling Pathway

銀屑?。╬soriasis）是一種多基因遺傳性的慢性、復發(fā)性、炎癥性皮膚病 ?［1］。根據(jù) World Psoriasis Day constortium 的報道，銀屑病在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率為 3%。我國 2007 年 11 月-2008 年 9 月對中國六省市銀屑病流行病學調(diào)查得出本病的患病率為 0.59% ?［2］。由于銀屑病病因不明，缺乏特效藥物，多年來研究人員一直致力于病因、發(fā)病機理與新藥的探索，但仍然未取得根本性突破，包括生物治療。如果從中醫(yī)藥的理論出發(fā)，辨證施治，挖掘新的治療藥物，將有可能提供一種全新的治療手段。 鴉膽子（fructus bruceae）作為中醫(yī)外科治療“寒涼箍圍藥”的經(jīng)典代表藥，是苦木科植物鴉膽子（brucea javancia L.Merr.）屬的干燥成熟果實。其性苦，味寒，有毒，有清熱、燥濕、殺蟲、解毒作用，可治療痢疾、腫瘤、久瀉、瘧疾、痔瘡、疔毒，外用可治贅疣、雞眼 ?［3-4］，文獻報道鴉膽子苦醇在抗癌方面有一定療效 ?［5］。相關(guān)研究證明鴉膽子苦醇是一個在體外抗胰腺癌效果比喜樹堿更強的化合物 ?［6］。，鴉膽子的作用機制主要為抑制細胞有絲分裂，使細胞有絲分裂 停止在G1期，誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖。鴉膽子苦醇理論上也存在誘導細 胞凋亡，抑制細胞增殖的作用。目前普遍認為銀屑病中表皮角質(zhì)形成細胞與免疫細胞之間的失調(diào)導致表皮增生，而NF-kB可能是其中的一個環(huán)節(jié)，銀屑病斑塊的表皮表現(xiàn)出高水平的磷酸化p65，與表皮增生的級別密切相關(guān)。因此，本研究通過建立銀屑病小鼠模型，初步探索鴉膽子苦醇通過調(diào)控NF-kB信號通路及相關(guān)細胞因子對銀屑病小鼠模型干預機制。

1 材料

1.1 實驗動物 雌性balb/c小鼠36只，6-8周齡，25 g-30 g，由陸軍軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心提供（許可證號：SCXK-（渝）2017-0006）。

1.2 試劑與儀器 鴉膽子苦醇購買于江萊生物，咪喹莫特（IMQ）購買于四川明欣藥業(yè)有限責任公司，DMSO、電泳相關(guān)基礎(chǔ)試劑及β-actin抗體均購買于碧云天生物技術(shù)有限公司，ECL化學發(fā)光試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM、RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購買于瑞士羅氏公司，NF-κB、pNF-κB、CK10、TNF-α等一抗購買于abcam公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠、山羊抗兔二抗購買于聯(lián)科生物公司，ELISA試劑盒購買于北京四正柏生物科技有限公司，所有引物均由擎科生物科技有限公司合成。蛋白電泳儀及酶標儀購買于BIO-RED，熒光定量PCR儀購買于瑞士羅氏公司。

2 實驗方法

2.1 銀屑病小鼠模型建立 Balb/c 小鼠提前1 d使用脫毛膏將背部2 cm×3 cm區(qū)域脫毛。次日，除正常組外，其余各組小鼠背部皮膚涂抹 5% 咪喹莫特乳膏 62.5 mg，正常組小鼠背部涂抹等量凡士林，每天 1次，持續(xù)7 d。

2.2 分組與給藥 Balb/c 小鼠隨機分為6組，每組 6只：正常對照組、模型組、卡泊三醇組、鴉膽子苦醇高濃度組、鴉膽子苦醇中濃度組、鴉膽子苦醇低濃度組。造模當天上午涂抹咪喹莫特后，下午進行涂抹卡泊三醇或尾靜脈注射高中低劑量鴉膽子苦醇。鴉膽子苦醇溶于DMSO至濃度分別為20、50、100 nmol/L。

2.3 形態(tài)學觀察及PASI評分 每日造模前，觀察并記錄各組小鼠皮損情況，同時采用銀屑病面積和嚴重性指數(shù)評分法（psoriasis area and severity index，PASI）評估皮損嚴重程度。分別從紅斑、鱗屑及皮膚增厚三個方面進行評分，無癥狀0分至極重度4分，各計0-4分，三個計分的總分為最終PASI評分。

2.4 組織病理切片HE染色 各組小鼠于第七天干預結(jié)束后，戊巴比妥鈉麻醉小鼠，取材，備用。皮損組織經(jīng)多聚甲醛液固定、30%蔗糖溶液脫水、石蠟包埋、切片（厚6um）、行Hematoxylin-Eosin染色，光學顯微鏡拍照。

2.5 Real-time PCR 組織總RNA獲取采用常規(guī)TRIZOL法，并進一步用ROCHE試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。Real-time PCR的反應體系為：SYBR TaqII （2×）5 uL，上游引物0.5 uL，下游引物0.5 uL，cDNA ?1 uL，dH 2O 3 uL，總體積為10 uL。 Real-time PCR程序為：95℃10 min，95℃ 15s，60℃ 30 s，總循環(huán)數(shù)為40；溶解曲線95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃ 1 s，冷卻40℃ ?10 s。下表1為引物上下游堿基序列。

2.6 Western blot 組織總蛋白提取及制備，電泳分離（電壓先80V分離0.5 h后，再調(diào)至120V分離約1.5 h），蛋白膜轉(zhuǎn)移（電壓100 V轉(zhuǎn)移時間1 h），脫脂牛奶封閉1 h后加入合適稀釋度的一抗（NF-κB、pNF-κB、CK10、TNF-α），4℃冰箱孵育過夜，加TBST，于搖床洗膜3次每次10 min，合適濃度的二抗1 h，重復TBST洗膜3次每次10min，顯色。ImageJ軟件測量目的蛋白條帶灰度值。

2.7 ELISA檢測 小鼠眼眶取血后，離心分離小鼠血清，按照ELISA試劑盒說明對各組小鼠血清 IL-1β、IL-17、IL-6 細胞因子水平進行檢測。

2.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS l 9.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，運用多個樣本均數(shù)比較的方差分析檢驗，數(shù)據(jù)以表示，組間差異采用單因素方差分析。 ?P <0.05表示具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠銀屑病模型建立及療效 由下圖1可見，與對照組比較，隨著咪喹莫特持續(xù)涂抹，小鼠背部區(qū)域逐步出現(xiàn)紅斑，鱗屑，皮膚持續(xù)增厚，至第7日，模型組基本形成類似銀屑病樣皮損。卡泊三醇組和鴉膽子苦醇給藥組相較于模型組，銀屑病樣癥狀均有明顯減輕，肉眼可見小鼠背部皮損鱗屑較少，紅斑變淺，浸潤增厚減輕，肉眼觀察可見，除鴉膽子苦醇低劑量組恢復情況略微不及其他幾組，鴉膽子苦醇高、中劑量組與卡泊三醇組銀屑病樣皮損癥狀減輕相似。

3.2 PASI評分 小鼠造模干預期間，依據(jù)銀屑病面積和嚴重性指數(shù)評分法，并采用重復測量數(shù)據(jù)方差 分析進行統(tǒng)計分析并繪制趨勢線，見下圖２。正常對照組小鼠整個過程皮膚呈現(xiàn)紅潤光澤狀態(tài)，模型組小鼠經(jīng)咪喹莫特藥物刺激，第二天即開始出現(xiàn)輕微的紅斑，并伴隨出現(xiàn)零星的小點狀鱗屑同時測量到皮膚稍微增厚，隨著持續(xù)給藥時間增加，藥物作用累積，模型組小鼠背部皮損逐步擴大嚴重，紅斑面積增大顏色加深，鱗屑范圍也逐步擴大，塊狀飛屑明顯，且皮損厚度遞增，至造模第7日，模型組小鼠基本形成類銀屑病樣皮損?？ú慈冀M及鴉膽子苦醇治療組給藥干預后，皮損情況較模型組都明顯好轉(zhuǎn)，紅斑減輕變淡、鱗屑減少皮膚略顯光滑及皮膚增厚浸潤減輕， P <0.05。

3.3 組織病理改變 各組小鼠經(jīng)7 d干預后，背部皮損經(jīng)HE染色結(jié)果顯示，正常對照組小鼠角質(zhì)層不明顯表皮光滑無增厚，皮脂腺規(guī)則無增大；模型組角質(zhì)層明顯增厚，角化不全伴角化過度，表皮增厚尤其是脊層，表皮突下伸，真皮淺層及乳頭層炎癥細胞浸潤，整體表現(xiàn)與銀屑病病理表現(xiàn)較一致。卡泊三醇組及鴉膽子苦醇高劑量組HE結(jié)果可見，角質(zhì)層增厚情況較模型組明顯減輕，且表皮平整，表皮突恢復平整，炎癥細胞浸潤減輕；鴉膽子苦醇中低劑量組病理改變較模型組也相對減輕，但好轉(zhuǎn)情況略微不及卡泊三醇組及鴉膽子苦醇高劑量組。

3.4 Real-time PCR檢測結(jié)果 與正常對照組相比，模型組NF-κB、CK1、CK10、TNF-α、IL-1β、 IL-17的mRNA水平明顯增加（ P <0.001）；與模型組相比，卡泊三醇組及鴉膽子苦醇高中低劑量組 NF-κB、CK1、CK10、TNF-α、IL-1β、IL-17mRNA水平均明顯下降，具有統(tǒng)計學意義（ P <0.001），見表2中mRNA數(shù)據(jù)。

3.5 Western blot檢測結(jié)果 與模型組相比，卡泊三醇組及鴉膽子苦醇高、中、低劑量組NF-κB、 pNF-κB、CK10、TNF-α蛋白表達水平均明顯下降 （ P <0.001），見圖4。

3.6 ELISA 檢測血清炎癥因子 取小鼠血清，按照試劑盒說明對 IL-1β、IL-17、IL-6細胞因子水平進行檢測。由下圖5檢測結(jié)果顯示：與模型組相比，卡泊三醇組及鴉膽子苦醇高、中、低劑量組血清炎癥因子IL-1β、IL-17、IL-6表達水平均明顯下降（ ?* * * P <0.001），見下圖5。

4 討論

銀屑?。╬soriasis）是一種多基因遺傳性的慢性、復發(fā)性、炎癥性皮膚病 ?［1］。該病常常起病隱蔽，病程久，緩慢加重，惡性與緩解交替，中醫(yī)認為“邪之所湊，其氣必虛”，“久病耗散”，中醫(yī)認為“素體血熱內(nèi)盛，營血虧虛，肌膚失養(yǎng)，生風生燥”故而發(fā)病。主流學術(shù)觀點認為初以熱為主，久則虛，頑則瘀夾虛。2014年中成藥銀屑病治療專家共識明確提出該病血熱證、血燥證和血瘀證是基本證型。傳統(tǒng)對于本病的外治方藥，多沿用涂搽《醫(yī)宗金鑒》的黃連膏；2014年專家共識提出以清熱解毒、潤膚止癢等中藥軟膏外涂，以安撫為主，避免刺激。大量的藥理學已經(jīng)證實，這些消腫定痛的清熱解毒、清熱涼血藥的作用機理多在于抑制細胞的有絲分裂，促進顆粒層的形成，改善表皮的角化形成，從不全角化轉(zhuǎn)為顆粒層形成的完全角化 ?［7-8］。從目前病理來看，銀屑病微血管增生和炎細胞浸潤出現(xiàn)最早且與角質(zhì)細胞過度增殖同樣突出，針對這點，傳統(tǒng)的清熱解毒、潤膚止癢的中藥軟膏的涂擦外治方法是無法解決的。

從中醫(yī)藥的理論出發(fā)，辨證施治，挖掘新的治療 藥物，將有可能提供一種全新的治療手段。最早記載出自《本草綱目拾遺》：“鴉膽子，出閩、廣，藥肆中皆有之。形如梧子，其仁多油，生食令人吐，作霜，捶去油，入藥佳” ?［9］。是中醫(yī)外科治療“寒涼箍圍藥”的經(jīng)典代表藥。鴉膽子具有多種藥理活性，目前在臨床上被廣泛應用于肺癌、前列腺癌和胃腸癌的治療。我國于 1978 年開始研制鴉膽子油靜脈乳劑，并用于各種惡性腫瘤的治療 ?［10］。國內(nèi)外學者對鴉膽子的化學成分和抗癌作用進行了大量的研究，充分證明其果實中所含的苦木內(nèi)酯類成分是主要抗癌活性成分。迄今已從鴉膽子種子和全草中分離鑒定了150 多個化合物，70 余種單體，代表性化合物為鴉膽丁、鴉膽子苦醇、鴉膽子苷。鴉膽子苦醇為鴉膽子的主要成分，且毒副作用小，因而入選研究。

銀屑病主要特征是角質(zhì)形成細胞過度增殖和分化異常，微血管增生和炎細胞浸潤。IL-17等與銀屑病發(fā)病重要相關(guān)的炎癥性細胞因子主要是由皮損中的TH17細胞分泌 ?［11］，大量分泌的IL-17可以通過下調(diào)人胰島源性蛋白 3 a，進一步起到角質(zhì)形成細胞的分化抑制并促進其增殖，角質(zhì)形成細胞進而合成分泌抗菌肽，募集炎癥細胞的浸潤，擴大炎癥反應 ?［12］。 NF-κB是一種廣泛存在于哺乳動物組織細胞中的核蛋白，參與免疫 、炎癥及細胞增殖等多種生物學過程。研究表明，NF-κB在銀屑病皮損中及外周血單核細胞中均增加，高表達的NF-κB進一步誘導 IL-17和 TNF-α產(chǎn)生，起到下游炎癥反應得放大作用。

本研究采用咪喹莫特誘導的balb/c小鼠銀屑病模型，鴉膽子苦醇尾靜脈注射進行干預治療，實驗結(jié)果顯示，鴉膽子苦醇治療后，小鼠銀屑病樣皮損明顯減輕，高中低劑量組PASI評分較模型組均有明顯好轉(zhuǎn)， P <0.05，HE結(jié)果顯示鴉膽子苦醇治療組角質(zhì)層增厚情況較模型組明顯減輕，且表皮平整，表皮突恢復平整，炎癥細胞浸潤減輕。Real-time PCR、 ?Western blot 及ELISA結(jié)果經(jīng)治療后，NF-κB、TNF-α、 IL-17等相關(guān)炎癥因子及CK1、CK10等細胞增殖相關(guān)因子均明顯表達下調(diào)。說明鴉膽子苦醇可能通過 NF-κB及相關(guān)炎癥因子信號通路調(diào)控有效抑制角質(zhì)細胞過度增殖，減輕炎癥反應從而改善了銀屑病小鼠皮損癥狀。

本試驗探究了鴉膽子苦醇治療銀屑病的初步療效，檢測了潛在相關(guān)信號通路，為進一步探究其具體作用靶點打下基礎(chǔ)，為中醫(yī)藥防治銀屑病提供理論和實驗依據(jù)，為提高中醫(yī)藥治療銀屑病療效尋求的新的途徑，為中醫(yī)藥防治銀屑病的早期診斷、治療與預后都具有深遠的意義。

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（收稿日期：2022-10-26）