BCR-ABL 融合基因定性檢測試劑盒的性能評價

李麗莉 黃杰 張文新 孫楠 黃傳峰 曲守方

白血病是我國高發(fā)的惡性腫瘤之一，存在某些染色體畸變，如易位、缺失、插入等。染色體易位時形成相關(guān)的融合基因，可以作為某種白血病的特異性分子診斷標(biāo)志，用于白血病的分子生物學(xué)分型、預(yù)后觀察及微小殘留?。╩inimal residual disease，MRD）的診斷。白血病融合基因主要有BCR-ABL、PML-RARA、AMLl-ETO、CBβl3-MYH11、TEL/AMLl、E2A/PBXl以及MLL融合基因等［1］。其中BCR-ABL融合基因最早在慢性髓系白血病細胞的費城染色體（Philadelphia Chromosome，Ph）中發(fā)現(xiàn)，由原癌基因ABL 與BCR 基因融合形成，編碼的P210、P230 和P190 融合蛋白，具有酪氨酸激酶活性，通過激活下游多條信號通路使細胞顯著轉(zhuǎn)化［2-3］。BCR-ABL融合基因在約95%以上的慢性粒細胞白血病患者（chronic myelogenous leukemia，CML）和20%的急性淋巴細胞白血病患者（acute lymphoblastic leukemia，ALL）的白血病細胞中表達。BCR-ABL 融合蛋白的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKI）藥物，如甲磺酸伊馬替尼等，改善了慢性粒細胞白血病患者的生存期［4］，因此BCR-ABL融合基因的檢測具有重要的臨床意義。

BCR-ABL融合基因的方法主要包括熒光原位雜交法、免疫印跡法、實時熒光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法和測序法［5-7］等。本研究使用BCR-ABL 參考品，評價國內(nèi)的BCR-ABL融合基因定性檢測試劑盒（熒光PCR 法）的陽性參考品符合率、陰性參考品符合率、檢出限和重復(fù)性項目，為該類試劑盒的性能評價提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

陽性參考品P1、P2 和P3 分別為P210、P230和P190 的BCR-ABL融合基因型樣本，陰性參考品N1～N5 分別為HL-60、PML-RARa、MLL-AF9、TEL-AML 和E2A-PBX1 樣本，重復(fù)性參考品WS1 和WS3 分別為高、低融合比例的P210 型樣本，由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 試劑

白血病融合基因檢測試劑盒（熒光PCR 法）和高效血液總RNA 提取試劑盒（離心柱型），廈門致善生物科技股份有限公司；白血病相關(guān)15 種融合基因檢測試劑盒（熒光RT-PCR 法）和TRIzol Reagent，蘇州云泰生物醫(yī)藥科技有限公司；白血病相關(guān)融合基因檢測試劑盒（RT-PCR 法）和TRIzol Reagent，上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 儀器

全自動醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)，型號：SLAN-96S（上海宏石醫(yī)療科技有限公司）；熒光定量PCR儀，型號：Bio-Rad CFX96（美國伯樂公司）；熒光定量PCR 儀，型號：ABI 7500（美國賽默飛世爾科技公司）。

1.4 方法

使用試劑盒說明書中指定的RNA 提取試劑盒，提取參考品的RNA，并對RNA 的濃度和純度進行測定。將陽性參考品P1、P2、P3 和陰性參考品N1 使用數(shù)字PCR 平臺進行濃度標(biāo)定，獲得相應(yīng)的拷貝數(shù)，用N1 將P1、P2、P3 分別稀釋至融合基因為100 copies/反應(yīng)的檢測限參考品L1、L2、L3。使用白血病融合基因檢測試劑盒對陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品和重復(fù)性參考品進行PCR 擴增。使用不同平臺的熒光定量PCR 儀進行檢測，并使用儀器軟件進行分析，獲得樣本的BCR-ABL融合基因的結(jié)果。對國內(nèi)常見BCR-ABL融合基因型別的陽性參考品檢測1次，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中“陽性參考品符合率”要求結(jié)果應(yīng)為陽性。對不含被測物和不在試劑盒宣稱檢測范圍內(nèi)融合基因型別的陰性參考品檢測1 次，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中“陰性參考品符合率”要求結(jié)果應(yīng)為陰性。對于拷貝數(shù)不高于100 copies/反應(yīng)的BCR-ABL融合基因檢測限標(biāo)準(zhǔn)品檢測1 次，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中“檢出限”要求結(jié)果應(yīng)為陽性。對重復(fù)性參考品重復(fù)檢測10 次，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中“重復(fù)性”要求BCR-ABL 反應(yīng)通道Ct 值的變異系數(shù)（CV，%）應(yīng)≤5.0%或結(jié)果應(yīng)為陽性。

2 結(jié)果

2.1 陽性參考品符合率

研究結(jié)果顯示在三個試劑盒中，陽性參考品P1～P3 在BCR-ABL 反應(yīng)通道擴增曲線有明顯對數(shù)增長期且Ct 值＜試劑盒的陽性Ct 界值，為BCR-ABL融合突變陽性。見圖1。

圖1 陽性參考品的BCR-ABL 融合基因結(jié)果Figure 1 Results of BCR-ABL fusion gene mutation for positive reference

2.2 陰性參考品符合率

本研究提供的陰性參考品包括BCR-ABL融合陰性的樣本（N1）和其他白血病融合基因型別的樣本（N2～N5）。結(jié)果顯示陰性參考品N1～N5 在BCR-ABL 反應(yīng)通道均沒有擴增曲線，為BCR-ABL融合突變陰性，其中試劑盒B 的結(jié)果。見圖2。

圖2 陰性參考品的BCR-ABL 融合基因結(jié)果Figure 2 Results of BCR-ABL fusion gene mutation for negative reference

2.3 檢出限

將陽性參考品P1～P3 稀釋至融合基因為100 copies/反應(yīng)的檢測限參考品L1、L2、L3。結(jié)果顯示檢測限參考品L1、L2、L3 在BCR-ABL 反應(yīng)通道擴增曲線有明顯對數(shù)增長期且Ct 值＜陽性Ct 界值，為BCR-ABL融合突變陽性，見圖3。

圖3 檢測限參考品的BCR-ABL 融合基因結(jié)果Figure 3 Results of BCR-ABL fusion gene mutation for detection limit reference

2.4 重復(fù)性

統(tǒng)計結(jié)果顯示重復(fù)性參考品WS1 在三個試劑盒的BCR-ABL 反應(yīng)通道的Ct 值的變異系數(shù)（CV，%）分別為0.4%、0.5%和0.4%且為BCR-ABL融合突變陽性，WS3 在BCR-ABL 反應(yīng)通道的Ct值的變異系數(shù)（CV，%）分別為1.8%、0.7%和0.4%且為BCR-ABL融合突變陽性，其中試劑盒B 的結(jié)果見圖4。

圖4 重復(fù)性參考品的BCR-ABL 融合基因結(jié)果Figure 4 Results of BCR-ABL fusion gene mutation for reproducibility reference

3 討論

白血病融合基因的檢測，對白血病的正確分型、臨床治療指導(dǎo)和判斷預(yù)后具有重要意義。其中BCR-ABL融合基因已成為白血病早期診斷、常規(guī)分子檢測和藥物監(jiān)測的重要生物標(biāo)志物［7-8］。微小殘留病（MRD）是指白血病誘導(dǎo)化療完全緩解后仍然殘留在血液中的少量白血病細胞的狀態(tài)，MRD 的監(jiān)測對于預(yù)測白血病的復(fù)發(fā)和治療方案的選擇具有一定的指導(dǎo)意義。檢測MRD 的方法包括多色流式細胞術(shù)、實時熒光定量PCR（RT-qPCR）和高通量測序法［9-10］。美國綜合癌癥網(wǎng)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南推薦采用實時熒光定量PCR 檢測BCR-ABL融合基因評估Ph+ALL 患者的微小殘留?。?1］，北美專家共識中優(yōu)先推薦在骨髓標(biāo)本中使用RT-qPCR 檢測BCR-ABL融合基因作為監(jiān)測MRD 的方法［12］。我國中國成人急性淋巴細胞白血病診斷與治療指南（2016 年版）推薦MRD 的監(jiān)測方法包括融合基因轉(zhuǎn)錄本的實時定量PCR 的檢測，如BCR-ABL融合基因［13］。國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的3 個白血病融合基因檢測試劑盒（熒光PCR 法），定性檢測人骨髓樣本中白血病融合基因。目前我國尚無相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)對斷裂點簇集區(qū)-艾貝爾遜白血病病毒（BCRABL）融合基因檢測試劑盒的質(zhì)量要求進行規(guī)范，對臨床使用上的風(fēng)險不易把控。為了提高產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)，本院負責(zé)《斷裂點簇集區(qū)-艾貝爾遜白血病病毒（BCR-ABL）融合基因檢測試劑盒》標(biāo)準(zhǔn)的制定工作。

本研究使用統(tǒng)一的參考品對白血病融合基因檢測試劑盒（熒光PCR 法）的陽性參考品符合率、陰性參考品符合率、檢出限和重復(fù)性項目進行評價。陽性參考品包含BCR-ABL融合基因主要型（p210）、次要型（p190）和微小型（p230），陰性參考品包括BCR-ABL融合陰性和其他白血病融合基因型別（PML-RARa、MLL-AF9、TEL-AML 和E2APBX1）的樣本。BCR-ABL融合基因定性檢測試劑盒用于檢測CML 或ALL 患者中外周全血或骨髓樣本中的BCR-ABL融合基因的轉(zhuǎn)錄水平。因為外周全血或骨髓樣本需要經(jīng)過RNA 提取，而且不同試劑盒的提取效率會有差異，不能對檢出限進行絕對定量。我們根據(jù)目前國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的白血病融合基因檢測試劑盒的檢測限要求，在標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了定性試劑盒的檢出限是拷貝數(shù)不高于100 拷貝/反應(yīng)能檢測出BCR-ABL融合基因突變陽性。本研究結(jié)果表明陽性參考品均檢出BCR-ABL融合基因突變陽性，不高于100 拷貝/反應(yīng)的檢測限參考品均能檢出BCR-ABL融合基因突變陽性，BCR-ABL融合基因突變陰性和其他白血病融合基因突變的陰性參考品均未檢出BCR-ABL融合基因突變陽性，高和低融合比例的重復(fù)性參考品的BCR-ABL 反應(yīng)通道Ct 值的變異系數(shù)（CV，%）均不高于5.0%且為BCR-ABL融合陽性。驗證結(jié)果符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《斷裂點簇集區(qū)-艾貝爾遜白血病病毒（BCR-ABL）融合基因檢測試劑盒》中定性試劑盒的陽性參考品符合率、陰性參考品符合率、檢出限和重復(fù)性要求，為該類試劑盒的技術(shù)指標(biāo)設(shè)置的合理性和科學(xué)性提供了技術(shù)基礎(chǔ)。本研究為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的頒布實施，試劑盒的注冊工作和上市后的監(jiān)管工作提供了技術(shù)指導(dǎo)。