彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤MYD88、A20 基因突變的表達(dá)及臨床意義

楊宇娟 王倩 張慈現(xiàn) 付杰 李曉林

彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤中最常的一種類(lèi)型，占比為30%～40%，具有較高的惡性程度，尋找新的分子治療靶點(diǎn)、降低復(fù)發(fā)死亡率是目前臨床亟待解決的問(wèn)題［1］。MYD88基因編碼蛋白屬于銜接蛋白，在腫瘤發(fā)展中通過(guò)Toll-like 受體活化核轉(zhuǎn)錄因子κB（nucleartranscription factor κB，NF-κB）通路使腫瘤細(xì)胞生存，有一定突變率［2-3］。腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白3 基因（tumor necrosis factor alphainduced protein 3 gene，A20）處于侵襲性B 細(xì)胞淋巴瘤缺失高發(fā)區(qū)域的6q23.3 位點(diǎn)中，參與NF-κB通路的活化［4］。研究顯示，在18%～22%黏膜相關(guān)邊緣區(qū)的DLBCL 中可見(jiàn)有A20基因的缺失突變、異常［5］。對(duì)此，本研究旨在分析彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤MYD88、A20基因突變的表達(dá)及臨床意義，以期為臨床診療提供新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015 年1 月至2022 年1 月徐州市中心醫(yī)院收治的DLBCL 患者213 例，其中男93 例，女120例，年齡39～81 歲，平均年齡（65.33±5.46）歲，臨床分期（Ann arbor 分期）［6］：Ⅰ～Ⅱ期127 例，Ⅲ～Ⅳ期86 例，分型參考Hans［7］標(biāo)準(zhǔn)分為GCB（CD10+或CD10-/bcl-6+/MUM1-）-DLBC L91 例，ABC（CD10-/bcl-6+/MUM1+或CD10-/bcl-6-/MUM1+）-DLBCL 122例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合WHO 淋巴造血組織腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)［7］；②臨床資料完整；③簽署知情同意書(shū)；④經(jīng)病理診斷明確為DLBCL。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他腫瘤；②術(shù)前已進(jìn)行放療或化療；③有足夠的組織樣本用于二代測(cè)序檢測(cè)；④完成隨訪。本研究已通過(guò)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1MYD88、A20基因檢測(cè)

基因突變檢測(cè)［8］：獲取4～6 μm 厚的腫瘤組織切片，放置EP 管中，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度濃度乙醇去除二甲苯和流水水化，按照DNA 提取試劑盒（德國(guó)Qiagen 公司）提取核酸，提純后加入PCR 混合液，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增MYD88、A20基因。純化后將其送上海生工基因公司進(jìn)行雙向測(cè)序，對(duì)有突變病例再進(jìn)行反向測(cè)序證實(shí)。具體操作參考儀器及配套試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.2 療效評(píng)估及資料收集

治療后3 個(gè)月患者采用PET-CT 進(jìn)行療效評(píng)估，根據(jù)淋巴瘤國(guó)際協(xié)作組的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［9］，療效評(píng)價(jià)包括完全緩解（complete 1response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、疾病穩(wěn)定（stable dissease，SD）、復(fù)發(fā)或進(jìn)展（stable disease，PD）。根據(jù)患者治療效果分為有效組（CR+PR）與無(wú)效組（SD+PD）。并隨訪12 個(gè)月，截止至2023 年1 月，以患者門(mén)診復(fù)查、電話隨訪結(jié)合信函調(diào)查獲得隨訪資料，臨床資料包括：性別、年齡、分期、分型、國(guó)際預(yù)后指數(shù)（international prognostic index，IPI）評(píng)分、原發(fā)部位、血清乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平等。

1.3 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)患者M(jìn)YD88、A20基因突變情況；分析MYD88、A20基因突變與患者臨床特征的關(guān)系；收集相關(guān)資料，分析不同療效患者M(jìn)YD88、A20基因突變情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料通過(guò)n（%）表示，并采用χ2檢驗(yàn)，均以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 213 患者M(jìn)YD88、A20 基因突變情況

213 例患者中MYD88基因突變75 例（35.21%），其中54 例（72.00%）突變點(diǎn)位為L(zhǎng)265P，15 例（20.00%）為突變點(diǎn)位為V147A，3 例（4.00%）為突變點(diǎn)位為S234N，2 例（2.67%）為突變點(diǎn)位為S234N，1 例（1.33%）為突變點(diǎn)位為S234N。A20基因突變48 例（22.54%），均為3 號(hào)外顯子的錯(cuò)義突變。MYD88、A20基因雙突變者12 例（5.63%）。

2.2 MYD88 基因突變與患者臨床特征的關(guān)系

MYD88基因突變者Ki-67 高表達(dá)、Bcl-2 陽(yáng)性、c-MYC/Bcl-2 陽(yáng)性、疾病類(lèi)型為ABC-DLBCL 型占比高于MYD88基因未突變者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 MYD88 突變與患者臨床特征的關(guān)系［n（%）］Table 1 Relationship between MYD88 mutation and clinical characteristics of patients［n（%）］

2.3 A20 基因突變與患者臨床特征的關(guān)系

A20基因突變者疾病類(lèi)型為ABC-DLBCL 型、PgP 陽(yáng)性中占比高于A20基因未突變者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 A20 基因突變與患者臨床特征的關(guān)系［n（%）］Table 2 Relationship between A20 gene mutation and clinical characteristics of patients［n（%）］

2.4 MYD88/A20 基因雙突變與患者臨床特征的關(guān)系

MYD88/A20基因雙突變者疾病類(lèi)型為ABCDLBCL 者高于MYD88/A20基因均未突變者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 MYD88、A20 基因均突變與患者臨床特征的關(guān)系［n（%）］Table 3 Relationship between mutations of MYD88 and A20 genes and clinical characteristics of patients［n（%）］

2.5 不同療效患者M(jìn)YD88、A20 基因均突變情況比較

有效者172 例（CR 96 例，PR 76 例），無(wú)效組41例（SD 14 例，PD 27 例）；無(wú)效組MYD88、A20、MYD88/A20基因突變者占比高于有效組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 不同療效患者M(jìn)YD88、A20 基因均突變情況比較［n（%）］Table 4 Comparison of MYD88 and A20 gene mutations in patients with different therapeutic effects［n（%）］

3 討論

DLBCL 是常見(jiàn)的成人淋巴瘤，目前根據(jù)臨床分期、腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)、IPI 等惡性腫瘤通用的預(yù)后預(yù)測(cè)因素?zé)o法滿足異質(zhì)性DLBCL 的治療、預(yù)后、化療效果等臨床需要。

研究顯示，DLBCL 可根據(jù)基因、表觀遺傳、臨床特征等分為4 型，其中MCD 型以MYD88基因突變?yōu)樘攸c(diǎn)，MYD88基因突變?cè)贒LBCL 發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中有重要的作用［10］。MYD88基因突變發(fā)生檢出率差異較大，檢出率為0%～90%，出現(xiàn)此情況與患者選擇檢測(cè)技術(shù)、是否檢測(cè)L265P 突變、外顯子3～5 所有突變等情況有關(guān)［11］。在臨床中發(fā)現(xiàn)，MYD88L265P 突變?cè)贏BC-DLBCL 中表達(dá)常見(jiàn)，在其他亞型中罕見(jiàn)，此突變可導(dǎo)致機(jī)體IRAK4 激酶、NF-κB 通路、JAK/STAT3 通路等活化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存發(fā)展。以上結(jié)果也提示MYD88信號(hào)通路與ABC-DLBCL 發(fā)生發(fā)展存在聯(lián)系，或?yàn)槠浒l(fā)生過(guò)程中不可缺少的因素。本研究顯示ABC-DLBCL型MYD88基因突變占比為73.33%顯高于MYD88基因未突變者，與上述研究結(jié)果相符。實(shí)際上MYD88基因突變與ABC 型DLBCL 中MYC/Bcl-2蛋白雙表達(dá)及MYC 單一基因表達(dá)無(wú)明顯聯(lián)系［12］。但本研究結(jié)果提示MYD88基因突變者Ki-67 高表達(dá)、Bcl-2 陽(yáng)性、c-MYC/Bcl-2 陽(yáng)性率更高，而單一MYC 蛋白表達(dá)與該基因突變并無(wú)相關(guān)性，與上述研究結(jié)果存在出入。但也有報(bào)道認(rèn)為ABC-DLBCL 患者中有MYD88基因突變者其Bcl-2 陽(yáng)性表達(dá)更高，與本研究結(jié)果類(lèi)似［13］。有關(guān)MYD88基因突變與MYC、Bcl-2 之間的關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究。

在DLBCL 發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，NF-κB 的異常持續(xù)活化逐漸被臨床重視，因此關(guān)于此通路活化相關(guān)基因的異常也成為臨床研究熱點(diǎn)。A20基因?qū)儆贜F-κB 負(fù)調(diào)控中的重要因子，其缺失、突變、甲基化均可使NF-κB 失活，在臨床中被認(rèn)為是腫瘤抑制因子，其表達(dá)異常可促進(jìn)淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，DLBCL 中22.54%有A20基因突變，且均為為3 號(hào)外顯子的錯(cuò)義突變，同時(shí)進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，以ABC-DLBCL 型、PgP 陽(yáng)性者A20基因突變機(jī)率高。推測(cè)A20基因突變后，A20基因抑制功能受損，最終影響DLBCL 發(fā)展，以ABC-DLBCL患者中表現(xiàn)明顯；而DLBCL 中A20基因突變后對(duì)NF-κB 負(fù)調(diào)控作用削弱，NF-κB 處于持續(xù)活化狀態(tài)，對(duì)調(diào)控的靶基因mdr1 表達(dá)上調(diào)，致使PgP 表達(dá)增加，影響腫瘤化療效果。同時(shí)本研究結(jié)果還顯示，在ABC-DLBCL 患者中其MYD88、A20基因均突變者占比高，與以往研究結(jié)果類(lèi)似［14］。進(jìn)一步分析不同療效患者M(jìn)YD88、A20基因突變及MYD88、A20基因雙突變情況可知，無(wú)效組MYD88、A20、MYD88、A20基因突變者占比明顯高于有效組，提示存在MYD88、A20基因突變或預(yù)示患者預(yù)后較差。

綜上所述，MYD88、A20基因突變與DLBCL 患者臨床特征及治療反應(yīng)存在一定聯(lián)系，兩者或可成為DLBCL 治療的新靶點(diǎn)。