miR-195 在孕產(chǎn)婦下肢深靜脈血栓患者外周血中的表達及其臨床意義

閆莉麗 楊濤 張春梅 張桂欣

下肢深靜脈血栓（deep vein thrombosis，DVT）主要表現(xiàn)為血液異常凝結(jié)在下肢深靜脈內(nèi)，造成管腔堵塞，進一步引發(fā)靜脈回流障礙。DVT 的發(fā)生率逐年呈不斷上升趨勢，而孕產(chǎn)婦女性因妊娠疾病、子宮壓迫、激素水平等因素導(dǎo)致其成為DVT的高發(fā)人群，孕產(chǎn)婦DVT 的發(fā)生率是健康成年女性的4～5 倍［1］。孕產(chǎn)婦DVT 的形成使孕產(chǎn)婦及胎兒并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險進一步提高，不僅能并發(fā)大出血、肺栓塞、壞疽等嚴重并發(fā)癥，甚至還威脅孕產(chǎn)婦及胎兒的生命健康。因此，早期診治DVT 可降低該疾病帶來的危害，對病死率的降低均有積極意義。目前，診斷DVT 的“金標準”是靜脈造影，但其為有創(chuàng)操作，不適用于孕產(chǎn)婦群體。因而亟需尋找一種敏感性、特異性高且為無創(chuàng)的臨床診斷標志物。有研究顯示［2］，與健康對照相比，靜脈栓塞患者的外周血中微小核糖核酸（microRNA，miRNA）表達具有顯著差異。TANG 等［3］也表示miRNA 對DVT 具有一定的促進作用，并可調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因，對維持機體內(nèi)的穩(wěn)定狀態(tài)具有重要意義。有研究報道［4］，miR-195 可抑制血管形成以及細胞增殖。因此，本研究通過檢測miR-195 在孕產(chǎn)婦DVT 患者的表達水平，分析其與與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性，旨在證實血清miR-195 成為孕產(chǎn)婦DVT 患者早期診斷指標和預(yù)后判斷分子的潛力。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017 年1 月至2019 年12 月在唐山市婦幼保健院產(chǎn)檢并分娩的116 例孕產(chǎn)婦DVT 患者為DVT 組，納入標準：①所有患者均在產(chǎn)后1 周經(jīng)下肢靜脈造影確診，且均符合《深靜脈血栓形成的診斷和治療指南》［5］中DVT 的診斷標準；②認知及溝通正常，可配合研究；③患者或家屬知情并簽署知情同意書。排除標準：①孕前診斷為DVT；②合并下肢感染或存在外傷；③合并易栓癥、凝血功能障礙及血液系統(tǒng)疾??；④近14 d 服用抗凝藥物者；⑤異常妊娠者。另選擇同期109 例產(chǎn)檢并分娩且未發(fā)生DVT 的孕產(chǎn)婦為非DVT 組，均在產(chǎn)后1 周經(jīng)下肢靜脈造影確認為未發(fā)生DVT。

1.2 方法

1.2.1 標本收集及檢測

使用一次性真空采血管采集所有研究對象的空腹外周靜脈血5 mL，3 000 r/min 離心10 min，離心半徑為10 cm，分離后取上清液，置于-80℃存放，待測。①miR-195：采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測miR-195 的表達量。取外周血樣本采用miRNeasy Serum/Plasma Kit（大連TAKARA）進行總RNA 的提取，取2 μL RNA 為模板，按照SuperScript RT kit（大連TAKARA）說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以及熒光定量PCR 反應(yīng)。miR-195 引物序列（F：5-GTATTCGCACTGGATACGACC-GACC-3'，R：5'-TGCGCTAACAGTCTACAGCCA-3'）。每個樣品的CT 值以U6 為內(nèi)參，得到平均循環(huán)閾值（Ct 值），用2-ΔΔCt計算miR-195 相對表達量。②D-二 聚體（D-Dimer，D-D）、凝血功能指標檢測：采用XT-1800i 全自動血液分析儀（日本SYSMEX 公司）及其對應(yīng)試劑盒檢測所有研究對象的D-D、凝血功能相關(guān)指標［纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)ib）、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、部分活化凝血酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、國際標準化比值（international normalized ratio，INR）］。③紅細胞計數(shù)：采用HA-360 型全自動血細胞分析儀（艾康生物技術(shù)）及其對應(yīng)試劑盒檢測所有研究對象的紅細胞計數(shù)。以上操作均由經(jīng)過培訓(xùn)的檢驗科人員嚴格按照試劑盒說明書完成。

1.2.2 資料收集

查閱病歷資料獲取所有研究對象的臨床資料，包括研究對象的年齡、體質(zhì)量指數(shù)（Body mass index，BMI）、妊娠合并癥（妊娠期高血壓、糖尿病等）、孕產(chǎn)次、分娩方式、產(chǎn)褥期臥床時間、產(chǎn)后出血等臨床資料。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件分析處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料用n（%）表示，組間比較行卡方檢驗；計量資料用（±s）表示，兩組間比較行獨立樣本t檢驗。Pearson 分析miR-195 與DD、紅細胞計數(shù)、Fib、PT、APTT、INR 的相關(guān)性；Logistic 回歸分析孕產(chǎn)婦并發(fā)DVT 的獨立影響因素；受試者工作曲線（ROC）評估m(xù)iR-195 對孕產(chǎn)婦并發(fā)DVT 的診斷價值。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料比較

兩組年齡、BMI、分娩方式、產(chǎn)后出血、妊娠合并癥、產(chǎn)褥期臥床時間、miR-195、DD、Fib、PT、APTT 等比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患兒的臨床資料比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data of children in two groups［n（%），（±s）］

表1 兩組患兒的臨床資料比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data of children in two groups［n（%），（±s）］

2.2 孕產(chǎn)婦并發(fā)DVT 的多因素Logistic 回歸分析

以孕產(chǎn)婦是否發(fā)生DVT 為因變量，將上述具有統(tǒng)計學(xué)意義的因素為自變量納入Logistic 回歸模型。結(jié)果顯示，年齡、BMI、分娩方式、產(chǎn)后出血、妊娠合并癥、產(chǎn)褥期臥床時間、miR-195、DD、Fib、PT、APTT 均與孕產(chǎn)婦并發(fā)DVT 的獨立有關(guān)（P＜0.05）。見表2。

表2 孕產(chǎn)婦并發(fā)DVT 的多因素Logistic 回歸分析Table 2 Multifactorial logistic regression analysis of maternal complications of DVT

2.5 miR-195 對孕產(chǎn)婦并發(fā)DVT 的診斷價值

ROC 曲線顯示，miR-195 診斷孕產(chǎn)婦并發(fā)DVT的AUC 為0.952（95%CI：0.904～0.989），最佳截斷值敏為1.56，敏感度0.948、特異度0.908（P＜0.05）。

2.2 miR-195 與DD、紅細胞計數(shù)、Fib、PT、APTT、INR 的相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)分析顯示，miR-195 與DD、紅細胞計數(shù)Fib 呈正相關(guān)，與PT、APTT 呈負相關(guān)（P＜0.05）。見表3。

表3 miR-195 與DD、紅細胞計數(shù)、Fib、PT、APTT、INR 的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of miR-195 with DD，erythrocyte count，F(xiàn)ib，PT，APTT，and INR

3 討論

孕產(chǎn)婦女性處于特殊生理期，血液中的促凝、抗凝等物質(zhì)以及纖溶活性會發(fā)生改變，特別是孕晚期時變化更顯著，使孕產(chǎn)婦呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，容易誘發(fā)DVT［6］。DVT 一旦形成，使孕產(chǎn)婦的生活質(zhì)量、身心健康受到嚴重影響，而且脫落后容易發(fā)生肺動脈栓塞，嚴重威脅孕產(chǎn)婦的生命。因此，早期預(yù)測及診斷孕產(chǎn)婦DVT 的具有重要的臨床意義。本研究結(jié)果提示miR-195 及相關(guān)高凝狀態(tài)在DVT的發(fā)病過程中具有重要作用。本研究進一步Logistic 回歸分析證實，miR-195、DD、Fib、APTT、PT 與孕產(chǎn)婦并發(fā)DVT 的密切相關(guān)。凝血功能指標是有效反映人體血液凝集狀態(tài)，常用的指標Fib、APTT、PT 等，這些凝血功能指標常在妊娠期、產(chǎn)褥期等均會發(fā)生顯著變化，能為孕產(chǎn)婦DVT 的發(fā)生提供臨床參考，丁光偉等［7］表示當PT 水平下降時提示患者的血液呈現(xiàn)出高凝狀態(tài)并逐步加重；Nykanen 等［8］研究表明APTT 和PT 水平下降，F(xiàn)IB 升高時提示隨著病情的加重，患者的血管內(nèi)凝血會加劇消耗。然而，因孕產(chǎn)婦的臨床表現(xiàn)比較復(fù)雜且并發(fā)癥的發(fā)生也較多，凝血功能指標的檢測對于孕產(chǎn)婦DVT 的診斷具有一定的局限性。DD 是纖維蛋白原降解形成的一種特異性產(chǎn)物，是反映機體凝血功能、血栓溶解及血栓形式重要指標，也是臨床診斷DVT 最常用的生物指標。張茜等［9］研究表示與非DVT 患者比較，DVT 患者的血清DD 水平異常升高，且曲線下面積為0.893，提示DD 水平與DVT 疾病存在著密切的聯(lián)系。而孕產(chǎn)婦在妊娠與分娩等因素的作用下，會出現(xiàn)高凝狀態(tài)，加之分娩時會產(chǎn)生一定的應(yīng)激反應(yīng)，因此孕產(chǎn)婦的DD 水平會高于其他人群，故依據(jù)DD 水平不能作為診斷孕產(chǎn)婦DVT 的依據(jù)。miRNA 已廣泛參與生理調(diào)節(jié)以及多種細胞、組織中的病理過程，且涉及到細胞增殖、分化、凋亡及機體器官、組織的發(fā)育，其與腫瘤、心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)［10］。Jin等［11］研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞凋亡是形成DVT 形成的關(guān)鍵因素，miR-195 在DVT 患者血液中的顯著升高，而miR-195 降低能促進細胞活力及細胞代謝，進而抑制血管內(nèi)皮細胞凋亡，當miR-195 升高則可參與血管內(nèi)皮細胞凋亡，逐步形成DVT，可作為DVT 的治療靶點。Srivastava 等［12］研究也發(fā)現(xiàn)miR-195 在DVT 的診斷中具有重要價值。本研究ROC 結(jié)果證實，miR-195 診斷孕產(chǎn)婦并發(fā)DVT 的AUC 為0.952，表示該指標的診斷效能好，具有較高的臨床價值。本研究相關(guān)性提示通過檢測外周血miR-195 水平不僅可為孕產(chǎn)婦DVT 的發(fā)生提供量化參考，亦可作為評估DVT 病情的重要參考指標。

此外，本研究還顯示，年齡、BMI、剖宮產(chǎn)、產(chǎn)后出血、妊娠合并癥、產(chǎn)褥期臥床時間均是孕產(chǎn)婦并發(fā)DVT 的獨立影響因素，提示可根據(jù)以上影響采取對應(yīng)措施降低孕產(chǎn)婦DVT 的形成。臨床研究發(fā)現(xiàn)［13］，年齡＞35 歲高齡孕產(chǎn)婦會提高相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生情況，因年齡的增長，機體功能逐漸減退，下肢血回流、靜脈瓣及心功能逐漸衰弱，加之妊娠期激素水平的變化，血液黏稠度會增加，進一步增加DVT 的發(fā)生風(fēng)險。BMI 越大的患者其血液黏稠度越高，血栓形成風(fēng)險隨之增加。產(chǎn)褥期臥床時間、產(chǎn)后出血均會增加DVT 的發(fā)生，故應(yīng)予以針對性護理干預(yù)預(yù)防血栓的形成，并鼓勵孕產(chǎn)婦早下床活動，縮短臥床時間，促進靜脈血流，降低高凝狀態(tài)的發(fā)生［14］。分娩方式為剖宮產(chǎn)DVT 的發(fā)生風(fēng)險顯著高于自然順產(chǎn)的產(chǎn)婦，與Swartz 等［15］研究報道一致，可能因剖宮產(chǎn)因術(shù)中的麻醉藥物及創(chuàng)傷等因素導(dǎo)致靜脈平滑肌舒張、血管內(nèi)皮細胞損傷，且術(shù)后產(chǎn)后出血及需要臥床休息等，增加下肢靜脈血液回流的難度，進而誘發(fā)血栓的形成。妊娠合并癥可影響孕產(chǎn)婦的血流動力學(xué)，導(dǎo)致代謝穩(wěn)亂，且存在妊娠合并癥的孕產(chǎn)婦多應(yīng)用剖宮產(chǎn)來終止妊娠，故DVT 的發(fā)生風(fēng)險會增高［16］。

綜上所述，孕產(chǎn)婦DVT 患者中的miR-195 水平顯著升高，且對孕產(chǎn)婦DVT 的發(fā)生具有較高的診斷效能，可為臨床診斷DVT 提供參考，具有重要的臨床意義。