PAX-9、CXCL-14、TGF-β1 在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及與其預(yù)后的關(guān)系

周士霞 王海莉 趙蓉爽

近年來，腫瘤標(biāo)志物已成為肺癌早期診斷的重要指標(biāo)［1］。配對盒基因（Paired Box Gene，PAX）是一類進(jìn)化保守的基因家族，在胚胎發(fā)育、組織器官形成和分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用［2-3］。PAX-9 在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，在人類口腔黏膜鱗狀細(xì)胞癌和唾液腺腫瘤中均呈高表達(dá)，而在食管鱗狀細(xì)胞癌和黑色素瘤中呈低表達(dá)［4］。研究表明，趨化因子配體14（C-X-C Motif Chemokine Ligand 14，CXCL-14）與乳腺癌、肺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、胰腺癌、骨肉瘤等腫瘤性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5］。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1）對腫瘤細(xì)胞的生長調(diào)節(jié)也起著非常重要的作用，所以當(dāng)前對它的研究較為廣泛。目前已有研究證實TGF-β1 在多種惡性腫瘤中具有高表達(dá)，并且與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其可能可作為一種判斷腫瘤預(yù)后的指標(biāo)［6］。本文主要探討PAX-9、CXCL-14、TGF-β1 在非小細(xì)胞肺癌（Non-small-cell lung carcinoma，NSCLC）患者中的表達(dá)及與其預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年5 月至2019 年5 月鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的NSCLC 患者68 例為研究對象。其中男49 例，女19 例，年齡40～72 歲，平均年齡（60.49±3.27）歲。按2015 年WHO 肺癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)［7］和國際肺癌研究協(xié)會的TNM 臨床分期［8］，腫瘤類型：鱗癌38 例、腺癌30 例；組織分化程度：低分化16 例、中分化20 例、高分化32 例；TNM 分期：Ⅰ期27 例、Ⅱ期21 例、Ⅲ期12 例、Ⅳ期8 例。本研究經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)通過，受試者或家屬已簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床病理資料完整；②均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為NSCLC［9］；③所有NSCLC 患者術(shù)前均未接受放化療、介入治療、生物治療和靶向治療等；排除標(biāo)準(zhǔn)：①有嚴(yán)重造血系統(tǒng)疾病和傳染病者；②合并心、肺、肝、腎等其他臟器并發(fā)癥者；③合并肺外其他原發(fā)惡性腫瘤和全身感染者。

1.2 方法

所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片5 張，1 張用于H&E 染色，其余4 張黏附于涂膠載玻片上做免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)采用SP 法，常規(guī)烤片、脫蠟水化，修復(fù)儀修復(fù)，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉非特異性抗原表位，一抗4℃冰箱過夜，之后二抗37℃孵育20 min，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，切片脫水透明，樹脂封片，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。以磷酸緩沖液（PBS）代替一抗為陰性對照，以試劑公司提供的陽性切片為陽性對照。PAX-9 試劑盒購自上海拜力生物科技有限公司，CXCL-14 試劑盒購自上海康朗生物科技有限公司，TGF-β1 試劑盒購自上海篤瑪生物科技有限公司，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

結(jié)果判讀［10］：陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞核或細(xì)胞漿中出現(xiàn)淺黃色至棕褐色細(xì)顆粒視為陽性表達(dá)。結(jié)果判定采用半定量記分法，根據(jù)染色強(qiáng)度分為4 級，無色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分；再按陽性細(xì)胞所占百分比評分，隨機(jī)選取5 個高倍（400×）視野，每個視野計數(shù)100 個腫瘤細(xì)胞，計數(shù)陽性細(xì)胞的百分比，＜5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分。最后兩項得分相乘：0～3 分為陰性（-），4～5 分為弱陽性（+），6～8 分為中度陽性（++），9～12 為強(qiáng)陽性（+++）。結(jié)果判定：陽性：6～12 分，陰性：0～5 分。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 27.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料采用（±s）表示；計數(shù)資料采用n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用多元Logistic 回歸模型對單因素生存進(jìn)行分析；均以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組PAX-9、CXCL-14、TGF-β1 蛋白表達(dá)情況比較

肺癌組織PAX-9、CXCL-14、TGF-β1 陽性率分別為63.24%、77.94%、79.41%，均高于癌旁正常組織的41.18%、57.35%、44.12%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

圖1 NSCLC 患者癌組織中PAX-9、CXCL-14、TGF-β1 蛋白表達(dá)情況（SP，×400）Figure 1 PAX-9 in NSCLC patients with cancers，CXCL-14，TGF-beta 1 protein expression（SP，×400）

表1 兩組PAX-9、CXCL-14、TGF-β1 蛋白表達(dá)情況比較［n（%）］Table 1 Comparison of PAX-9、CXCL-14、TGF-β1 protein expression between the two groups［n（%）］

2.2 不同臨床特征肺癌患者間PAX-9、CXCL-14、TGF-β1 表達(dá)情況比較

NSCLC 組織中PAX-9 蛋白表達(dá)在不同腫瘤病理類型、分化程度及臨床TNM 分期中表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；CXCL-14 蛋白表達(dá)在不同分化程度、臨床TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小中表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TGF-β1 蛋白表達(dá)在不同分化程度及臨床TNM分期中表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同臨床特征肺癌患者間PAX-9、CXCL-14、TGF-β1 表達(dá)情況比較Table 2 Comparison of expression of PAX-9、CXCL-14、TGF-β1 in lung cancer patients with different clinical features

2.3 68 例NSCLC 患者預(yù)后情況

3 年隨訪結(jié)束后，68 例NSCLC 患者3 年總生存率為38.24%（26/68）。其中PAX-9 蛋白高表達(dá)和低表達(dá)患者其3 年總生存率分別為51.16%（22/43）和16.00%（4/25），CXCL-14 蛋白高表達(dá)和低表達(dá)患者其3 年總生存率分別為45.28%（24/53）和13.33%（2/15），TGF-β1 蛋白高表達(dá)和低表達(dá)患者其3 年總生存率分別為44.44%（24/54）和14.29%（2/14），組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.277，P=0.004；χ2=5.053，P=0.025；χ2=4.282，P=0.038）。

2.4 影響NSCLC 患者預(yù)后的因素分析

經(jīng)多元Logistic 回歸分析得出，病理類型、分化程度、TNM 臨床分期、和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為影響NSCLC 患者預(yù)后生存的獨立危險因素（P＜0.05）。見表3。

表3 影響NSCLC 患者預(yù)后的因素分析Table 3 Analysis of factors affecting the prognosis of NSCLC patients

3 討論

NSCLC 是常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類健康。腫瘤標(biāo)志物是指存在于人體血液、組織和體液中的反映腫瘤發(fā)生、發(fā)展的物質(zhì)，對腫瘤的治療及預(yù)后起輔助作用，故探索能精準(zhǔn)評估NSCLC 病情發(fā)展的標(biāo)志物，對NSCLC 的治療及預(yù)后評估具有重要的臨床意義。

PAX-9 是PAX 基因家族的一員，其在人類涎腺腫瘤、口腔黏膜鱗狀細(xì)胞癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)。國內(nèi)外均有研究顯示，PAX-9是肺鱗狀細(xì)胞癌的抑凋亡基因，能夠促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，抑制癌細(xì)胞凋亡，且該基因表達(dá)水平與肺鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病以及患者的預(yù)后密切相關(guān)，與肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和克隆也有關(guān)［11-12］。CXCL-14 是一種具有非特異性受體的新型非谷氨酸-亮氨酸-精氨酸趨化因子，最早從人類乳腺和腎臟組織中分離克隆而來，它能調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)的血管生成、炎癥免疫反應(yīng)以及腫瘤生長的自分泌，也能激活宿主對腫瘤的特異性免疫［13］。已有研究表明［14］，CXCL-14對自身免疫性疾病、膿毒血癥相關(guān)的急性腎損傷、缺血性腦卒中、感染性疾病等多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展有重要影響，也可能與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。孟俏俏等［15］等研究中指出，趨化因子及其受體參與NSCLC 的血管生成和凋亡，并為NSCLC 的增殖和轉(zhuǎn)移提供良好的基礎(chǔ)，其將會為未來的治療提供新的靶點。TGF-β1 具有多種細(xì)胞學(xué)功能，對調(diào)控免疫系統(tǒng)具有重要作用，并其在腫瘤的早期可以抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡，但是在腫瘤的進(jìn)展期則可增加血管的形成、介導(dǎo)上皮組織轉(zhuǎn)化為間葉組織，而有利于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［16］。有研究發(fā)現(xiàn)［16］，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ期NSCLC 患者TGF-β1 表達(dá)明顯比淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移和Ⅰ、Ⅱ期病人高，且TGF-β1水平高的患者預(yù)后差，說明過表達(dá)的TGF-β1 與NSCLC 的發(fā)展進(jìn)程及腫瘤血管生成有關(guān)。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，肺癌組織PAX-9、CXCL-14、TGF-β1 陽性率分別為63.24%、77.94%、79.41%，均高于癌旁正常組織的41.18%、57.35%、44.12%。說明PAX-9、CXCL-14、TGF-β1 蛋白可能參與了NSCLC 的發(fā)病過程。另外，NSCLC 組織中PAX-9蛋白表達(dá)在不同腫瘤病理類型、分化程度及臨床TNM 分期中存在差異，CXCL-14 蛋白表達(dá)在不同分化程度、臨床TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小中存在差異，TGF-β1 在NSCLC 中表達(dá)顯著升高，其表達(dá)在不同分化程度及臨床TNM 分期間存在差異，結(jié)果與秦雯學(xué)者［17］研究結(jié)果基本一致。此外，3 年隨訪結(jié)束后，68 例NSCLC 患者3 年總生存率為38.24%（26/68），其中PAX-9、CXCL-14、TGF-β1 蛋白高表達(dá)與低表達(dá)比較均存在差異。提示TGF-β1 通過調(diào)控多種不同的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，也證明了PAX-9、CXCL-14、TGF-β1 的高表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移、惡性程度及預(yù)后密切相關(guān)。

綜上所述，PAX-9、CXCL-14、TGF-β1 在NSCLC 組織中呈高表達(dá)，可作為判斷NSCLC 預(yù)后的相關(guān)指標(biāo)。