遼寧某規(guī)?；i場豬源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

王洪奎

(阜新蒙古族自治縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 阜新 123125)

豬巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的急性流行性或散發(fā)性和繼發(fā)性傳染病，又叫豬肺疫。豬巴氏桿菌病根據(jù)臨床癥狀可分為急性型和慢性型2 類。急性型多以出血性敗血性病變、咽喉腫脹發(fā)炎和肺部充血、水腫、炎癥等為主要臨床表現(xiàn)，慢性病例多發(fā)病緩慢，主要表現(xiàn)為呼吸苦難，慢性肺炎，個別可見關(guān)節(jié)炎癥狀，且其常與豬瘟等混合感染，嚴(yán)重的可引起豬只死亡，對養(yǎng)豬業(yè)危害巨大[1，2]。

近日，遼寧某規(guī)模化豬場部分豬發(fā)病，病豬體溫升高，可達(dá)40 ～41 ℃，精神沉郁，食欲減少或不食，干咳，部分豬鼻孔流出漿性或膿性分泌物，呼吸困難，張口呼吸，結(jié)膜發(fā)紺，皮膚表面有大小不一致且形狀不規(guī)則的紅色斑塊，少數(shù)豬輕微腹瀉，部分豬于發(fā)病7 日內(nèi)死亡。剖檢死亡病豬后，可見咽喉部紅腫發(fā)炎，黏膜充血、水腫，胸腔與肺臟黏連，胸腔積液，肺充血、水腫，部分壞死，脾臟表面有散在出血點，輕微腫大。綜合臨床癥狀、剖檢變化及流行病學(xué)情況，疑似為巴氏桿菌引起。為進(jìn)一步確診，現(xiàn)場采集病豬肺臟、淋巴結(jié)等組織樣品，對致病菌進(jìn)行分離鑒定，同時進(jìn)行藥物敏感性試驗，以期對臨床上該類疾病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑 普通營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基，LB 培養(yǎng)基，革蘭氏染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。DNA marker DL2000，TaKa-Ra Ex Taq DNA Polymerase (含dNTP Mixture)購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購于生工生物工程(上海) 股份有限公司。甲醇、無水乙醇、三氯甲烷等試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱，購自于北京六一儀器有限公司； c300 凝膠成像系統(tǒng)，購自于江蘇捷達(dá)科技有限公司； 電泳儀Power-Pac HC、電泳槽 GT1704482、T100 Thermal Cycler PCR 儀，購自于美國伯樂有限公司； 無菌工作臺，購自于青島海爾公司。

1.1.3 病料及實驗動物 豬場發(fā)病死亡豬2頭，剖檢后無菌采集肺臟組織樣品，-20 ℃保存待檢。SPF 級昆明小鼠20 只，雌雄各半，購自于沈陽長生實驗動物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將病料組織樣品涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和血平板培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)觀察。用接種環(huán)取單菌落，進(jìn)一步劃線培養(yǎng)純化。同時挑取單個菌落在LB 培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，純化培養(yǎng)后菌株進(jìn)行革蘭染色鏡檢，觀察菌體染色特性及形態(tài)。

1.2.2 生化鑒定 參考生化試驗試劑說明書，將分離菌培養(yǎng)物接種于各生化反應(yīng)管中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.3 細(xì)菌16S rRNA 基因序列分析 使用16 sRNA 通用引物進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增，上下游引物分別為5′AGAGTTTGATCATGGCTCAG 3′和5′ GGCTACCTTGTTACGACTT 3′，引物由生工生物公司進(jìn)行引物合成。擴(kuò)增條件: 95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，退火溫度52 ℃，退火時間30 s，72 ℃延伸1.5 min，共34 個循環(huán)。最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。然后取5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀察結(jié)果，同時將PCR 產(chǎn)物送往上海生工生物公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果與NCBI 中已發(fā)表的基因序列進(jìn)行同源性比對。

1.2.4 致病性試驗 無菌條件下挑取普通瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)的單個菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)12 h。取20 只健康的SPF 級小鼠，隨機(jī)分為試驗組和對照組，每組10 只。對試驗組小鼠腹腔注射0.2 mL 含有1 × 108個細(xì)菌的菌液，對照組小鼠注射等體積的LB 液體培養(yǎng)基，逐日觀察小鼠發(fā)病死亡情況。并對死亡小鼠及未死亡小鼠分別進(jìn)行剖檢，觀察記錄小鼠各個組織病變情況，同時取病變臟器進(jìn)一步分離病原菌。

1.2.5 藥敏試驗 采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗。挑取瓊脂平板培養(yǎng)基上的單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)12 h，取100 μL 菌液分點滴加在瓊脂平板上，應(yīng)用玻璃棒均勻涂布于培養(yǎng)基上，將常用抗菌藥物藥敏紙片貼在平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈是否出現(xiàn)并測定其直徑。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

分離菌在普通瓊脂平板上生長出灰白色菌落，表面光滑且較為濕潤、邊緣整齊。血平皿上生長出灰白色菌落，表面光滑且較為濕潤、邊緣整齊且沒有溶血現(xiàn)象(圖1)。挑取單菌落至于載玻片上，進(jìn)行革蘭氏染色。染色后將載玻片置于油鏡下觀察，鏡下可見本次分離菌株呈淡紅色、兩端鈍圓的短桿狀，為革蘭陰性菌(圖2)。

圖1 分離菌平板培養(yǎng)基菌落形態(tài)

圖2 分離菌革蘭氏染色結(jié)果(1 000 ×)

2.2 生化鑒定

生化試驗結(jié)果表明，本次分離菌株可分解葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖和半乳糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。對乳糖、鼠李糖、肌醇不發(fā)酵。可生成靛基質(zhì)，甲基紅和VP 試驗陰性，不液化明膠(表1)。

表1 分離菌的生化鑒定結(jié)果

2.3 細(xì)菌16S rRNA 基因序列分析

菌液PCR 產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增出預(yù)期1 420 bp 的單一條帶(圖3)。將目標(biāo)片段測序后，通過BLAST 工具將其結(jié)果進(jìn)行在線比對，結(jié)果顯示該序列與GenBank 中多殺性巴氏桿菌的核苷酸序列相似程度最高，同源性大于99.9%。

圖3 分離菌16S rRNA PCR 結(jié)果

2.4 動物試驗

分離菌菌液接種小鼠8 h 后，試驗組小鼠開始出現(xiàn)不同程度的臨床表現(xiàn)。主要表現(xiàn)為運動遲緩、食欲不振、呼吸急促、體溫升高等癥狀，36 h 后全部死亡，對照組小鼠全部正常。無菌采集小鼠肺臟，均勻涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，鏡檢及菌液16S rRNA PCR 鑒定表明，試驗組小鼠肺臟中分離出的菌株為多殺性巴氏桿菌。

2.5 藥敏試驗

由表2 可知，本次分離的菌株對氟苯尼考、卡那霉素、氧氟沙星、慶大霉素、諾氟沙星、多西環(huán)素敏感，對環(huán)丙沙星中介，對頭孢氨芐、克拉霉素、丁胺卡那、紅霉素、頭孢唑林耐藥?？赏扑]養(yǎng)殖場選擇使用氟苯尼考等藥物進(jìn)行臨床治療。

表2 分離菌藥敏試驗結(jié)果

3 討論

多殺性巴氏桿菌是一種可引起多種畜禽疾病的革蘭氏陰性致病菌，可導(dǎo)致牛出血性敗血癥、禽霍亂等，在豬可引起豬肺疫和豬萎縮性鼻炎等。結(jié)合本次細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化實驗和PCR 鑒定結(jié)果，初步確診該豬場發(fā)病為豬巴氏桿菌病，通過對臨床分離菌進(jìn)行藥敏試驗，表明氟苯尼考、氧氟沙星等藥物對臨床分離菌株敏感，推薦養(yǎng)殖場采用上述藥物進(jìn)行防治，3 ～5 d后豬群整體發(fā)病率得到了控制，發(fā)病豬只臨床癥狀也得到了控制，15 d 后豬場疾病得到了控制，取得了不錯的效果。

巴氏桿菌擁有莢膜、脂多糖、菌毛和黏附素等多種毒力因子，根據(jù)莢膜類型可將其分為莢膜A 型、莢膜B 型、莢膜D 型、莢膜E 型和莢膜F 型等5 種血清型。豬巴氏桿菌肺炎(豬肺疫) 主要由莢膜A 型引起，臨床癥狀根據(jù)病程的不同可分為多種病型，主要表現(xiàn)為呼吸困難、氣喘等，病情重時剖檢可見胸膜與病肺黏連，胸腔及心包積液。我國是畜牧業(yè)大國，生豬存欄量居世界前列，豬巴氏桿菌病在豬群中常年存在，對養(yǎng)豬業(yè)危害巨大。李敏研究表明，豬巴氏桿菌病在成都市發(fā)病率約為8.97%，而李永剛的研究證實豬巴氏桿菌病發(fā)病率為3.27%，病死率高達(dá)54.72%[3，4]。臨床上針對該病的防控重點是疫苗免疫，國內(nèi)部分規(guī)?；i場采用豬肺疫弱毒苗進(jìn)行免疫，收到了不錯的預(yù)防效果。近期韋存莉嘗試推廣應(yīng)用豬瘟、豬丹毒、豬巴氏桿菌病三聯(lián)疫苗對豬只進(jìn)行免疫，起到了很好地預(yù)防效果。三聯(lián)苗不僅有效地降低豬巴氏桿菌病的發(fā)病率，同時也對豬瘟、豬丹毒起到了很好地預(yù)防作用。同時在豬場實行自繁自養(yǎng)、堅持標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)流程，采用免疫為主、綜合防控為輔的原則，對上述疾病防控取得了顯著效果[5]。2022 年6月，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第573 號公告對原?一、二、三類動物疫病病種名錄? 進(jìn)行修訂，將巴氏桿菌病由之前的二類疫病修改為三類疫病，但這并不代表巴氏桿菌病對畜禽養(yǎng)殖業(yè)的危害在逐年減小，反而應(yīng)該更加引起畜牧獸醫(yī)工作者對該類疾病防控的重視。近年來隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，巴氏桿菌病的臨床診斷技術(shù)也在不斷發(fā)展，多種敏感性高、特異性強(qiáng)的診斷技術(shù)不斷涌現(xiàn)，可以實現(xiàn)快速、精準(zhǔn)的診斷，從而提升了對該類疾病的防控水平。李偉杰等[6]也在2018 年修訂了?豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)? 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)的修訂也將為豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)的提升起到積極的促進(jìn)作用。