長(zhǎng)方案促排卵晚卵泡期孕酮升高對(duì)胚胎質(zhì)量及累積活產(chǎn)率的影響

李丹陽(yáng),張 亞,董孝貞,徐 影,楊如雪,黃江笛,張俊韋,胡繼君,管一春,孫麗君*

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院 a.生殖醫(yī)學(xué)中心;b.超聲科,鄭州 450052)

長(zhǎng)方案作為體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(in vitro fertilization/intra-cytoplasmic sperm injection-embryo transfer,IVF/ICSI-ET)技術(shù)中控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation,COH)的主導(dǎo)方案,具有卵泡發(fā)育同步性好、抑制早發(fā)黃體生成素(luteinizing hormone,LH)峰以及增加獲卵數(shù)和胚胎數(shù)等優(yōu)點(diǎn)[1],可提高卵巢儲(chǔ)備良好患者的新鮮周期種植率、臨床妊娠率及累積活產(chǎn)率(cumulative live birth rate,CLBR)[2-3]。但是,仍有13%～46%的促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(gonadotropin-releasing hormone agonist,GnRH-a)周期會(huì)出現(xiàn)晚卵泡期血清孕酮(progesterone,P)提前升高[4],對(duì)患者的子宮內(nèi)膜容受性造成一定損害,導(dǎo)致新鮮胚胎移植(embryo transfer,ET)周期的種植率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率降低[5-6]。因此,患者HCG注射日(HCG injection day)孕酮升高時(shí),多數(shù)生殖中心會(huì)選擇全胚冷凍策略以規(guī)避這一風(fēng)險(xiǎn),隨后選擇合適的時(shí)機(jī)解凍移植[7-8]。目前,HCG日孕酮升高對(duì)患者的胚胎質(zhì)量是否造成影響尚有爭(zhēng)議[8-11],而累積活產(chǎn)率作為評(píng)價(jià)IVF/ICSI治療效果和安全性的指標(biāo)較單次胚胎移植的成功率更全面、更準(zhǔn)確[11-12]。因此,本研究主要探討長(zhǎng)方案促排卵晚卵泡期孕酮升高對(duì)IVF/ICSI助孕患者的胚胎質(zhì)量及累積活產(chǎn)率(cumulative live birth rate,CLBR)的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組 本研究為單中心回顧性隊(duì)列研究,選取2015年10月至2021年12月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖中心行IVF/ICSI助孕長(zhǎng)方案促排卵的7001個(gè)周期的臨床資料。參考文獻(xiàn)[10,13],HCG日孕酮升高定義為P≥2.0ng/mL。研究組納入標(biāo)準(zhǔn):助孕方式為IVF/ICSI;促排卵方案為早卵泡期長(zhǎng)效長(zhǎng)方案/黃體中期長(zhǎng)效長(zhǎng)方案;女方年齡≤38歲[12];竇卵泡數(shù)(antral follicle counting,AFC)≥5個(gè);抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)≥1.2ng/mL;基礎(chǔ)促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone,FSH)<10U/L;因HCG日孕酮升高行全胚冷凍者的首個(gè)凍胚移植周期。納入同期以相同促排卵方案但HCG日P<2.0ng/mL行鮮胚移植的患者為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn):患子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、子宮腺肌病、畸形子宮、宮腔粘連、子宮內(nèi)膜息肉或輸卵管積水者;復(fù)發(fā)性流產(chǎn)或反復(fù)種植失敗者;有不良孕產(chǎn)史者;供精或供卵周期;行未成熟卵母細(xì)胞體外成熟(in vitro maturation,IVM)者;HCG日雌二醇(estradiol,E2)≥10000ng/L或獲卵數(shù)>25個(gè)或合并不同程度的腹脹、少尿、腹水等癥狀和體征者;移植日子宮內(nèi)膜厚度<7.0mm者;冷凍胚胎移植內(nèi)膜準(zhǔn)備方案為降調(diào)+人工周期者。依據(jù)患者HCG日P水平分為低孕酮組(6331例)和高孕酮組(670例)。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào)為2022-218-01)。

1.2 臨床促排卵方案及胚胎實(shí)驗(yàn)室操作方法

1.2.1 促排卵方案 早卵泡期長(zhǎng)效長(zhǎng)方案:月經(jīng)周期第2～4d給予長(zhǎng)效GnRH-a(達(dá)菲林,法國(guó)益普生)3.75mg降調(diào)節(jié)30～40d;黃體中期長(zhǎng)效長(zhǎng)方案:前一月經(jīng)周期的黃體中期給予長(zhǎng)效GnRH-a 1.5～1.875mg降調(diào)節(jié)14～16d,達(dá)到垂體降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)(LH<5U/L,E2<183.5pmol/L,子宮內(nèi)膜厚度<5mm,無(wú)卵巢功能性囊腫)時(shí),根據(jù)患者年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)和卵巢儲(chǔ)備等給予促性腺激素(gonadotropin,Gn)促排卵(75～300U/d啟動(dòng)),用藥過(guò)程中根據(jù)卵巢反應(yīng)性及激素水平調(diào)整Gn用量。

1.2.2 取卵、授精和胚胎培養(yǎng) 當(dāng)至少1枚主導(dǎo)卵泡直徑≥20mm,或3枚卵泡直徑≥18mm時(shí),停用Gn,采用電化學(xué)發(fā)光免疫法測(cè)血清LH、E2和P水平(根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行質(zhì)控,各試劑盒變異系數(shù)小于10%),當(dāng)晚皮下注射重組HCG(艾澤,瑞士默克雪蘭諾)250μg扳機(jī)。36～38h后行陰道超聲監(jiān)測(cè)下取卵術(shù)。根據(jù)男方精液及患者情況,行常規(guī)IVF/ICSI,受精后第3d(D3)觀察胚胎形成情況,卵裂期胚胎質(zhì)量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見參考文獻(xiàn)[14]。若繼續(xù)培養(yǎng)至第5～6d(D5～D6),發(fā)育至囊胚階段,參照Gardner評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行囊胚評(píng)分[15]。

1.2.3 胚胎移植與黃體支持 取卵后3～5d根據(jù)患者情況和胚胎質(zhì)量進(jìn)行移植。若HCG日P<2.0pg/mL,取卵術(shù)后給予常規(guī)黃體支持,于取卵后第3d或第5d進(jìn)行新鮮卵裂期胚胎或囊胚移植。若HCG注射日的孕酮升高則取消新鮮周期移植行全胚冷凍。根據(jù)患者的具體情況,至少間隔1個(gè)月經(jīng)周期,制定不同的凍融胚胎移植方案,包括自然周期、激素替代周期和刺激周期,移植后給予常規(guī)黃體支持。

1.3 觀察指標(biāo) (1)主要觀察指標(biāo):CLBR=每取卵周期中形成的胚胎(新鮮+凍融胚胎)移植后首次活產(chǎn)的周期數(shù)/取卵周期總數(shù)×100%,CLBR的統(tǒng)計(jì)時(shí)間截止為2019年12月,隨訪至2年。(2)次要觀察指標(biāo):可利用胚胎率=可利用胚胎數(shù)/2PN卵裂數(shù)×100%,優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN卵裂數(shù)×100%,囊胚形成率=2期及2期以上囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)的卵裂期胚胎總數(shù)×100%,種植率=B超下見孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%,臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%,活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)對(duì)定量資料進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的定量資料以中位數(shù)(第25百分位數(shù),第75百分位數(shù))[M(P25,P75)]表示,組間定量資料比較采用秩和檢驗(yàn)。定性資料采用構(gòu)成比或率(%)表示,組間定性資料比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。采用多重線性回歸及二分類logistic回歸分析校正混雜因素,以低孕酮組為參照,計(jì)算高孕酮組校正后的偏回歸系數(shù)/比值比(partial regression coefficient/adjusted odds ratio,β/aOR)及95%置信區(qū)間(confidence interval,CI)。與P水平上升的相關(guān)因素分析采用logistic多元逐步回歸。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者的一般資料比較 高孕酮組的年齡、不孕年限及繼發(fā)不孕占比顯著高于低孕酮組,而AFC、AMH及患多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)占比則顯著低于低孕酮組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)(表1)。

表1 低孕酮組與高孕酮組的一般資料比較[M(P25,P75),%]

2.2 兩組患者的促排卵情況及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 高孕酮組的Gn總量、Gn天數(shù)、HCG日E2水平、HCG日P水平及獲卵數(shù)顯著高于低孕酮組,而HCG日黃體生成素(luteinizing hormone,LH)水平則顯著低于低孕酮組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)(表2)。采用多重線性回歸校正混雜因素,結(jié)果顯示高孕酮組的可利用胚胎率與囊胚形成率顯著低于低孕酮組(P均<0.05)(表3)。

表2 低孕酮組與高孕酮組的促排卵情況比較[M(P25,P75)]

表3 高孕酮組與低孕酮組的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較(n/N)

2.3 兩組患者首個(gè)胚胎移植周期臨床結(jié)局和累積活產(chǎn)率的比較 高孕酮組首個(gè)胚胎移植周期的移植胚胎數(shù)及移植日內(nèi)膜厚度顯著低于低孕酮組,移植囊胚占比顯著高于低孕酮組(P均<0.05)(表4)。采用多重線性回歸及多因素logistic回歸校正混雜因素,結(jié)果顯示,高孕酮組首個(gè)胚胎移植周期的種植率、臨床妊娠率、多胎妊娠率、活產(chǎn)率和累積活產(chǎn)率均顯著低于低孕酮組,而早期流產(chǎn)率與晚期流產(chǎn)率則顯著高于低孕酮組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)(表5)。

表4 低孕酮組與高孕酮組首個(gè)胚胎移植周期相關(guān)指標(biāo)比較[M(P25,P75),%(n/N)]

表5 兩組患者首個(gè)胚胎移植周期臨床結(jié)局及累積活產(chǎn)率比較[%(n/N)]

2.4 HCG注射日P水平的相關(guān)因素分析 采用最大似然法進(jìn)行多因素逐步logistic回歸分析HCG日P水平的影響因素,結(jié)果顯示,年齡、AMH、Gn總量、獲卵數(shù)、HCG日LH水平和HCG日E2水平為HCG日孕酮水平提前上升的相關(guān)因素,見表6。

表6 logistic逐步回歸分析結(jié)果HCG日P影響因素

3 討 論

HCG日孕酮升高對(duì)新鮮胚胎移植患者的妊娠結(jié)局產(chǎn)生不良影響已在臨床達(dá)成共識(shí)[16]。晚卵泡期血清孕酮升高可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜組織學(xué)成熟[17]和顯著的子宮內(nèi)膜表觀遺傳表達(dá)變化,進(jìn)而影響子宮內(nèi)膜容受性[18]及其免疫耐受[19]。然而,HCG日孕酮升高是否對(duì)患者的胚胎質(zhì)量造成影響尚有爭(zhēng)議。研究表明,HCG日孕酮升高未對(duì)凍胚復(fù)蘇周期及贈(zèng)卵周期結(jié)局產(chǎn)生不利影響,即HCG日孕酮升高不影響卵母細(xì)胞及胚胎質(zhì)量[20-21]。但也有學(xué)者認(rèn)為,HCG日孕酮升高會(huì)影響卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量,降低周期優(yōu)質(zhì)胚胎率和可利用胚胎率[10,22],對(duì)CLBR不利[11]。本研究結(jié)果顯示,高孕酮組患者的可利用胚胎率與囊胚形成率均顯著低于低孕酮組,這表明晚卵泡期孕酮升高可能對(duì)患者的胚胎質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。

Shimada等[23]對(duì)敲除孕酮受體基因小鼠的顆粒細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),在卵丘細(xì)胞的擴(kuò)張中發(fā)揮關(guān)鍵作用的表皮生長(zhǎng)因子樣因子的mRNA和蛋白水平降低,表明孕酮在卵母細(xì)胞的成熟中發(fā)揮著重要作用。Urrego等[24]研究則表明,在牛卵母細(xì)胞的體外成熟過(guò)程中,孕酮水平較低的卵母細(xì)胞發(fā)育潛力更好。本研究發(fā)現(xiàn),晚卵泡期孕酮水平升高與患者胚胎質(zhì)量的下降相關(guān)。然而,是孕酮水平的升高影響了卵母細(xì)胞質(zhì)量還是卵母細(xì)胞提前成熟導(dǎo)致孕酮水平的提前升高,尚待進(jìn)一步研究。

隨著玻璃化冷凍的引入,凍存人類胚胎的能力較程序化冷凍有了顯著的改善,既往有研究表明玻璃化冷凍并不會(huì)對(duì)患者的胚胎質(zhì)量造成影響[25]。為了避免不同移植周期胚胎選擇帶來(lái)的偏差,本研究對(duì)低孕酮組和高孕酮組的患者均選擇首次胚胎移植進(jìn)行研究,即高孕酮組的首個(gè)凍胚移植周期和低孕酮組的鮮胚移植周期。采用二分類logistic回歸校正混雜因素后,發(fā)現(xiàn)高孕酮組首個(gè)凍胚移植周期的種植率、臨床妊娠率、多胎妊娠率及活產(chǎn)率均顯著低于低孕酮組的鮮胚移植周期,而早期流產(chǎn)率與晚期流產(chǎn)率則顯著高于低孕酮組,高孕酮組的累積活產(chǎn)率亦顯著低于低孕酮組。這也間接支持晚卵泡期孕酮升高可能對(duì)患者胚胎質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響,進(jìn)而影響其隨后的臨床結(jié)局。

既往研究認(rèn)為,晚卵泡期血清孕酮的升高可能與成熟卵泡數(shù)多、高劑量Gn以及卵巢刺激時(shí)間延長(zhǎng)相關(guān),HCG日孕酮升高時(shí),HCG日E2和獲卵數(shù)隨之增加[11,26-27]。本研究結(jié)果顯示,Gn總量、獲卵數(shù)和HCG日E2與HCG日孕酮升高呈正相關(guān),與上述研究相一致,這提示在臨床促排卵過(guò)程中可通過(guò)控制患者的促排卵藥物劑量及獲卵數(shù)來(lái)預(yù)防晚卵泡期孕酮升高。

綜上所述,長(zhǎng)方案促排卵晚卵泡期孕酮升高可能對(duì)患者的胚胎質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響,進(jìn)而影響其累積活產(chǎn)率。Gn總量及獲卵數(shù)與晚卵泡期孕酮升高呈正相關(guān)。在臨床上,應(yīng)在患者的COH過(guò)程中加以關(guān)注,控制患者的促排卵藥物劑量及獲卵數(shù),減少因孕酮升高而取消移植的幾率,增加患者的鮮胚移植機(jī)會(huì),提高卵母細(xì)胞質(zhì)量,以增加累積活產(chǎn)率。然而,晚卵泡期孕酮水平升高導(dǎo)致不良臨床結(jié)局的機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。