基于高通量測(cè)序的磷石膏上芒草內(nèi)部細(xì)菌多樣性分析

周 煬，李劍峰*，郭欣楊，張淑卿，倪明秀，張煜冕，郭金梅

[1.貴州省高等學(xué)校生物資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550018；2.貴州師范學(xué)院喀斯特生境土壤與環(huán)境生物修復(fù)研究所，貴州貴陽(yáng) 550018；3.貴州磷化(集團(tuán))有限責(zé)任公司，貴州貴陽(yáng)550000]

磷石膏是濕法磷酸生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)物，主要成分為二水硫酸鈣，除此之外還有部分重金屬元素、可溶性磷酸鹽及氟化物等雜質(zhì)[1]。經(jīng)計(jì)算每生產(chǎn)1 t 濕法磷酸，將排放出約5 t 的磷石膏廢渣[2]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于磷石膏利用率不足40%，大部分是通過(guò)堆存方式處理，這種處理方式不僅占據(jù)了大量的土地資源，而且其潛在的污染物泄露和垮堆風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)對(duì)當(dāng)?shù)鼐用竦纳眢w和生態(tài)環(huán)境造成威脅[3]。磷石膏的低成本處理與有效利用始終是我國(guó)磷化工業(yè)的一大難題。

芒草（Miscanthus Sinensis）為禾本科（Gramineae）芒屬植物[4]，通常分布在熱帶、亞熱帶及溫帶亞洲地區(qū)。芒草在我國(guó)分布較廣，其對(duì)于環(huán)境的適應(yīng)能力非常強(qiáng)，在各種惡劣環(huán)境下都能夠生存[5]。目前已有將芒草應(yīng)用于重金屬土壤修復(fù)的相關(guān)研究報(bào)道，并發(fā)現(xiàn)芒草能夠耐受一種甚至多種高濃度重金屬元素的脅迫[6]。貴州作為磷石膏生產(chǎn)排放的集中區(qū)域，且磷石膏的產(chǎn)出量在逐年增長(zhǎng)，對(duì)于磷石膏的有效處理已成為當(dāng)今貴州乃至全國(guó)的熱點(diǎn)問(wèn)題。目前，有關(guān)利用芒草植株修復(fù)磷石膏堆渣污染的相關(guān)研究報(bào)道還較為少見(jiàn)，因此具有較大的研究意義。

1 材料與方法

1.1 材料

2021 年7 月，在貴州省貴陽(yáng)市開(kāi)陽(yáng)縣龍景灣貴州磷化集團(tuán)開(kāi)陽(yáng)露天堆場(chǎng)（東經(jīng)106.852 3°，北緯27.151 3°）采集磷石膏上生長(zhǎng)的芒草植株和種子樣品，采集時(shí)芒草呈深綠色，群落單一，株高在0.4～1.2 m。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

將植株根系挖出，用無(wú)菌水清洗表面后放入陰涼通風(fēng)處自然風(fēng)干，待植株風(fēng)干后與種子一同裝入無(wú)菌自封袋內(nèi)放入4 ℃冰箱暫存。

1.2.2 DNA提取及測(cè)序

根據(jù)試劑盒要求提取樣本的DNA，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定DNA 純度。采用16SrDNA 對(duì)于V3-V4 引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為（上游引物338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，下游引物 806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT）PCR 反應(yīng)參數(shù)：a.1×（3 min at 95 ℃）b.循環(huán)數(shù)×30 s at 95 ℃；30 s at 55 ℃；45 s at 72 ℃）c.10 min at 72 ℃，10 ℃until halted by user。根據(jù)各樣品的測(cè)序量，將其配置成對(duì)應(yīng)的配比，送至生工（上海）生物工程有限公司，利用Illumina 公司的Miseq PE300，對(duì)其進(jìn)行高通量測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌多樣性分析

2.1.1 測(cè)序數(shù)據(jù)處理結(jié)果

如表1所示，樣品經(jīng)過(guò)高通量測(cè)序共獲得124 097條原始序列，經(jīng)對(duì)原始數(shù)據(jù)初步處理，獲得了123 363條有效的序列。供試樣本有效序列條數(shù)在51 383～71 980 條，其中phps（芒草種子）有效序列條數(shù)大于php（芒草植株）。通過(guò)聚類一共獲得274個(gè)OTUS，通常將相似性值≥97%的序列定義為同一個(gè)OTUS。為了比較直觀地分析和統(tǒng)計(jì)，對(duì)于測(cè)序樣本的共有OTUS和特有OTUS 進(jìn)行分析比較，結(jié)果顯示，php 與phps的共有OTUS 有138 個(gè)，php 特有OTUS 為66 個(gè)，phps特有OTUS 為70 個(gè)，即php 與phps 的微生物群落組成較為相似。

表1 芒草植株及種子有效序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.1.2 α多樣性

樣品稀釋曲線傾斜度在不斷降低逐漸趨于平緩（見(jiàn)圖1），同時(shí)樣品中測(cè)序覆蓋度均為1（見(jiàn)表2），說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量比較合理，基本上能夠反映出樣品細(xì)菌群落的組成情況[7]。通過(guò)計(jì)算Ace指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)等三個(gè)指標(biāo)結(jié)果表明，php細(xì)菌多樣性大于phps。

圖1 基于OTUS豐度的樣品微生物群落稀釋曲線

表2 芒草植株及種子的細(xì)菌α多樣性

Rank Abundance 曲線圖能夠直觀明確地展示各樣本中OTUS 的均勻度及豐富度，如圖2 所示，當(dāng)OTU數(shù)量小于100時(shí)，php與phps的物種相對(duì)豐度較高，但曲線下降速度比較快，說(shuō)明php 與phps 的分布均勻程度較低。當(dāng)OTU 數(shù)量超過(guò)100 的情況下，物種的相對(duì)豐度較低，但是曲線比較平坦，表明物種分布較為均衡。圖中php 與phps 樣本間的曲線寬度、平滑程度都比較一致，表明其物種豐度及均勻度都無(wú)顯著差異。

圖2 基于OTUS水平Rank Abundance曲線分析

2.1.3 樣本主成分

通過(guò)主成分(PCA)分析可知，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)貢獻(xiàn)率分別為58.23% 和40.5%，合計(jì)為98.73%。如圖3 所示，兩樣本點(diǎn)的距離十分接近，且位于第一象限有明顯的聚集，表明php 與phps 的細(xì)菌相似性較高。

圖3 芒草植株和種子OTU水平PCA圖

2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異分析

2.2.1 門水平下陳化磷石膏上生長(zhǎng)芒草植株及種子細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

在門水平下，一共鑒定出17 個(gè)門類細(xì)菌，如表3所示，豐度低于1%的細(xì)菌門合并為Others，其中，芒草植株(php)及種子(phps)共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為藍(lán)菌門(Cyanobacteria_Chloroplast)。如圖4 所示，藍(lán)菌門細(xì)菌在芒草植株、種子內(nèi)部的相對(duì)豐度分別為59%、79.3%，即藍(lán)菌門的相對(duì)豐度phps大于php。原因可能是：1）種子相對(duì)于植株而言，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累較多，較多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有利于藍(lán)菌門的生長(zhǎng)，所以種子內(nèi)部的藍(lán)菌門豐度較大；2）在細(xì)菌功能方面，藍(lán)菌門的菌類具有較強(qiáng)的抗紫外線輻射能力，在較強(qiáng)紫外線的輻射下能夠形成一種代謝響應(yīng)機(jī)制，使其適應(yīng)紫外輻射的脅迫[8]。

圖4 門水平下芒草植株及種子細(xì)菌相對(duì)豐度圖

表3 門水平下芒草植株及種子細(xì)菌相對(duì)豐度表

2.2.2 屬水平下陳化磷石膏上生長(zhǎng)芒草植株及種子細(xì)菌相對(duì)豐度

在屬水平下，共檢測(cè)出148 個(gè)屬的細(xì)菌，在芒草植株中鏈型植物（Streptophyta 59%）占比最大，其次是未知菌屬細(xì)菌（unclassified_Bacteria 39.5%）；鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas 0.07%）為植株菌群內(nèi)部的重要細(xì)菌群落，在芒草種子(phps)中占比最大的同樣為鏈型植物（Streptophyta 79.2%），其次為未知菌屬（unclassified_Bacteria 19.8%）。如表4、圖5 所示，在植株到種子過(guò)程中，其內(nèi)部鏈型植物、未知菌豐度逐漸增大，但鞘氨醇單胞菌屬、鏈霉菌屬等細(xì)菌豐度相對(duì)減少。鏈型植物占比較高的原因可能為芒草植株及種子內(nèi)部葉綠體信息沒(méi)有被排除，導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果中鏈型植物數(shù)據(jù)占了絕大部分。芒草植株之所以能夠在磷石膏上生長(zhǎng)，原因可能是鞘氨醇單胞菌屬、鏈霉菌屬細(xì)菌對(duì)植物的生長(zhǎng)也起著一定的促進(jìn)作用。鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌常被研究者用于修復(fù)重金屬污染土壤[9]。

圖5 屬水平下芒草植株及種子細(xì)菌相對(duì)豐度圖

表4 屬水平下芒草植株及種子細(xì)菌相對(duì)豐度表

2.3 16s功能預(yù)測(cè)分析

如圖6 所示，在php 與phps 中，其功能性強(qiáng)的前五類均為：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組氨酸激酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、由CheY 樣受體域和翼螺旋DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成的響應(yīng)調(diào)節(jié)劑、藍(lán)藻中保守的未表征蛋白質(zhì)、未表征的低復(fù)雜度蛋白質(zhì)，且種子內(nèi)部功能豐度值高于植株。其中植株與種子中功能性最強(qiáng)的均為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組氨酸激酶。組氨酸激酶可以作為細(xì)菌細(xì)胞中的重要信號(hào)感知分子，細(xì)菌可以利用組氨酸激酶來(lái)感受胞外環(huán)境的變化，作為一種自身具有激酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶和磷酸酶活性的多功能酶，組氨酸激酶能夠作為信號(hào)分子的細(xì)胞受體，且具有跨細(xì)胞膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。這種轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)在細(xì)菌、酵母菌和高等植物中都有發(fā)現(xiàn)[10-11]。

圖6 COG功能預(yù)測(cè)熱圖

3 討論與結(jié)論

本研究以磷石膏上芒草植株和種子為研究對(duì)象，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)微生物多樣性進(jìn)行細(xì)致研究，結(jié)果顯示：在門水平上，其共同的優(yōu)勢(shì)菌門是藍(lán)菌門。在屬水平上，鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌（Sphingomonas）、鏈霉菌屬細(xì)菌（Streptomyces）為優(yōu)勢(shì)菌屬，且php 中兩種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相對(duì)豐度高于phps。這兩種細(xì)菌在植物生長(zhǎng)及抗逆性方面都起著較為重要的作用。黃媛林等對(duì)一株紅樹(shù)林鏈霉菌所產(chǎn)抑菌活性化合物的分離及其生物合成基因簇的研究表明，鏈霉菌的次生代謝產(chǎn)物具有多種抗性的功效，且多被用作生物防治劑[12]。何曉紅等對(duì)鞘氨醇單胞菌的各項(xiàng)功能的綜述研究表明，鞘氨醇單胞菌能夠耐受惡劣環(huán)境及貧瘠營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，且能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)與抵抗多種植物病原菌[13]。

目前，鏈霉菌屬與鞘氨醇單胞菌屬已廣泛用于重金屬污染的土壤植物與植物促生菌的聯(lián)合修復(fù)研究[14]，微生物環(huán)境修復(fù)仍然是目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。然而現(xiàn)階段對(duì)于磷石膏的處理利用及其內(nèi)部元素對(duì)于環(huán)境污染的系統(tǒng)研究還比較缺乏，這些都將成為未來(lái)磷石膏堆渣污染研究的重要課題。芒草植株能夠在磷石膏堆渣上面生存的原因可能是由于鏈霉菌與鞘氨醇單胞菌的存在，這兩株細(xì)菌具備開(kāi)發(fā)成為磷石膏堆渣治理與利用的植物促生菌的潛在價(jià)值，值得進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與研究。