水痘-帶狀皰疹病毒特異性細胞免疫及其預測帶狀皰疹后遺神經痛的價值

袁峰 馮丹 李少軍 張書力 李敏 胡焓 童勝雄 田佳玉

武漢市第一醫(yī)院疼痛科（武漢 430022）

水痘-帶狀皰疹病毒（Varicella-zoster virus，VZV）感染神經節(jié)是帶狀皰疹（Herpes zoster，HZ）發(fā)生的病因，而其潛伏于神經節(jié)內是導致帶狀皰疹后遺神經痛（Post-herpetic neuralgia，PHN）的重要機制之一［1］。雖然目前對于PHN 的發(fā)生機制尚未完全闡明，但VZV 所誘導的特異性細胞免疫在其中扮演著重要角色［2］。眾所周知，病毒感染后的細胞免疫是機體清除病毒的關鍵步驟，且各類型病毒所引起的細胞免疫具有特異性，故其對于疾病的發(fā)生及發(fā)展都具有較好的反應作用［3-4］。因此本研究擬對VZV 感染后的特異性免疫反應進行分析，并根據分析結果建立PHN 發(fā)生的預測模型，旨在為指導臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 健康人群 選擇2021 年1 月至2022 年6 月于我院體檢中心明確為健康的成年人10 例作為PBMC 提取對象，所有人在既往均有明確的水痘病史，且已經治愈。

1.1.2 HZ 患者 選擇2021 年1 月至2022 年6 月于我院就診的HZ 患者。納入標準：（1）符合HZ 的診斷標準，且為初次診斷［5］；（2）年齡≥18 周歲；（3）患者或家屬充分知情同意。排除標準：（1）病原學檢查明確合并其他病原體感染；（2）嚴重肝腎功能不全；（3）合并其他自身免疫性疾病；（4）合并其他惡性腫瘤疾??；（5）嚴重的基礎疾??；（6）經評估后可能對實驗結果產生影響的其他因素。符合上述條件，并報我院倫理委員會審核通過后（編號：2100010305）共計納入患者70例。

1.2 方法

1.2.1 PBMC 提取 抽取樣本（HZ 患者取開始治療前）清晨空腹外周靜脈血3 mL，置于EDTA 管內保存，采用密度梯度離心法分離PBMC，置于-80 ℃冰箱凍存。

1.2.2 VZV 特異性細胞免疫模型構建 參照文獻［6］中方案構建VZV 特異性細胞免疫模型，具體如下：將健康人群樣本PBMC 分為兩組，分別在含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素、1% L-谷氨酰胺的完全1640 培養(yǎng)基（PRMI 公司生產）中解凍，并制備成1 × 107cells/mL 的PBMC 細胞液。將3 種VZV特異性肽庫（gE、IE62、IE63）（由德國JPT Peptide Technologies 公司提供）混合后制備病毒濃度為10 μg/mL 的病毒液，并在96 孔U 型板（100 μL/孔，廣州潔特生物過濾股份有限公司提供）加入病毒液20 μL 及PBMC 細胞液80 μL 混合作為VZV 組；1%二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO；Sigma 公司提供）20 μL 及PBMC 細胞液80 μL 混合作為對照組。兩組細胞均于37 ℃下反應24 h 后，收集上清液并儲存在-80 ℃下用于細胞因子檢測，U 型板孔底含有細胞的懸液用于流式細胞檢測。

1.2.3 流式細胞檢測 采用賽默飛世爾公司提供的Attune NxT 流式細胞儀完成本次實驗，主要對所有樣本的T 細胞（CD3+、CD4+、CD8+）及PD-1+的CD4+T 淋巴細胞占比進行檢測，結果以陽性率（%）表示。

1.2.4 VZV 特異性細胞因子檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）（試劑盒均由武漢塞培生物科技公司提供）測定所有樣本PBMC 上清液中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白細胞介素2（interleukin 2，IL-2）水平。

1.2.5 HZ患者PBMC內細胞因子檢測 采用1.2.2中的方式對納入研究的70 例HZ 患者進行PBMC細胞液制備，于37 ℃下靜置24 h 后，根據VZV 特異性細胞因子檢測結果，對具有差異的細胞因子進行檢測。

1.3 隨訪方案 所有入組的HZ 患者均按照文獻［5］當中的標準進行為期半年的隨訪，而后根據文獻［7］當中對于PHN 診斷標準，統(tǒng)計隨訪期間PHN發(fā)生情況，并根據隨訪結果將所有患者分為PHN組及非PHN 組。

1.4 統(tǒng)計學方法 數據處理采用SPSS 25.0 軟件。計數資料以例表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；采用COX 回歸分析PHN 發(fā)生的危險因素；建立ROC曲線分析VZV 特異性細胞因子對PHN 發(fā)生的預測價值，曲線下面積（area under the curve，AUC）比較采用Z檢驗；P＜0.05 時差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 VZV 組及對照組流式細胞結果比較 VZV 組患者CD4+T 細胞占比低于對照組，而CD8+T 細胞及PD-1+CD4+T 細胞占比高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 VZV 組及對照組流式細胞結果比較Fig.1 Comparison of flow cytometry results in VZV group and control group

2.2 VZV 組及對照組細胞因子情況比較 兩組患者PBMC 上清液中IFN-γ、IL-2 水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），VZV 組患者PBMC 上清液中TNF-α 水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 VZV 組及對照組細胞因子情況比較Fig.2 Comparison of cytokines level between VZV group and control group

2.3 PHN組與非PHN組TNF-α、CD4+T比較 截至2022 年12 月31 日隨訪結束，共計6 例患者因失訪視為脫落，剩余64 例帶狀皰疹患者中，共計17 例患者發(fā)生PHN，PHN 發(fā)生率為26.56%。兩組患者臨床資料比較結果提示：PHN 組患者合并前區(qū)疼痛占比、多階段發(fā)病占比、發(fā)病至開始治療時間及PBMC 上清液的TNF-α 水平均高于非PHN 組，CD4+T 細胞百分比低于非PHN 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 PHN 組與非PHN 組TNF-α、CD4+T 比較Tab.1 Comparison of TNF-α and CD4+T between the two groups例（%）

2.4 HZ 患者PHN 發(fā)生風險的COX 回歸分析COX 回歸分析結果顯示：PBMC 上清液TNF-α 水平（HR= 1.148）是HZ 患者PHN 發(fā)生風險的獨立危險因素（P＜0.05），見表2。

表2 HZ 患者PHN 發(fā)生風險的COX 回歸分析Tab.2 COX regression analysis of PHN risk in patients with herpes zoster ±s

表2 HZ 患者PHN 發(fā)生風險的COX 回歸分析Tab.2 COX regression analysis of PHN risk in patients with herpes zoster ±s

因素發(fā)病至開始治療時間CD4+T PBMC 上清液TNF-α合并前驅疼痛多階段發(fā)病常量β 值0.429-0.024 0.138 0.902 1.356-10.737標準誤0.342 0.024 0.045 1.069 0.972 3.827 Wald χ2 95%CI 1.574 0.934 9.383 0.712 1.946 7.873 P 值0.212 0.334 0.002 0.399 0.163 0.005 HR 1.536 0.977 1.148 2.464 3.882＜0.001下限0.786 0.931 1.051 0.303 0.577上限3.004 1.025 1.254 20.032 26.112

2.5 PBMC 內TNF-α 預測HZ 患者PHN 發(fā)生的ROC 分析 以PBMC 內TNF-α 指標建立預測PHN的ROC 曲線，結果顯示：PBMC 上清液中TNF-α 對于PHN 發(fā)生具有較好的預測效果（AUC = 0.902，P＜0.001，95%CI：0.821 ～0.981），見圖3。預測的截斷值為＞54.36 pg/mL，預測敏感度為82.35%，特異度為85.11%，陽性預測值為66.67%，陰性預測值為93.02%。

圖3 PBMC 內TNF-α 預測HZ 患者PHN 發(fā)生的ROC 分析Fig.3 ROC analysis of TNF-α in PBMC to predict PHN occurrence in patients with herpes zoster

3 討論

PHN 的治療一直以來是臨床上HZ 相關性疼痛治療中的難點，目前雖然通過神經阻斷、富血小板血漿、中西醫(yī)結合等各種治療方式可以取得較好的療效，但治療不可能一蹴而就，在此過程中部分患者仍需要承受較大的痛苦［8］。早期發(fā)現(xiàn)危險因素較高的HZ 患者并采取多學科干預治療方案能夠減少PHN 的發(fā)病率，從源頭上解決PHN發(fā)病的可能性，是目前臨床上干預PHN 較好的方案之一［9］。

目前在國內針對PHN 發(fā)生的相關因素研究中，關鍵指標主要集中于一般臨床資料。結合國外文獻進行分析后，筆者認為由于臨床常用的實驗室檢查指標中混合有多種血液細胞，會對結果產生影響［10］。本研究在設計之初經過反復驗證后發(fā)現(xiàn)，PBMC 種類相對單一，且其中包含的淋巴細胞是參與到PHN 發(fā)生的重要因素，故作為預測因子特異性相對較好。而通過基礎研究對指標進行驗證后開展臨床研究更具有針對性，故在臨床研究前還對VZV 感染后的特異性指標進行了檢測。

針對VZV 感染后的PMBC 細胞的檢測結果中，各類型淋巴細胞占比差異均有統(tǒng)計學意義。首先，絕大部分HZ 患者是由于體內潛伏的VZV 再次活化，而CD4+T 細胞分化的記憶性CD4+T 細胞在被VZV 激活后會立即活化并啟動免疫反應，從而達到抗病毒的效果［11-12］。但由于VZV 會通過抑制細胞凋亡抑制蛋白的表達并激活Fas 信號途徑，從而誘導CD4+細胞的凋亡，從而達到免疫逃逸的效果，故PHN 組CD4+T 細胞會明顯降低。在MERCAN等［13］的研究中指出，在VZV 病毒感染程中，CD8+T細胞會受到激活從而大量浸潤到HZ 患者神經節(jié)中，從而導致疼痛的發(fā)生，這一結果與本次研究相符?？梢姡珻D4+T 功能下降是導致VZV 再激活及發(fā)病的重要因素。在一項針對淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV）的研究中指出，當PD-1/PD-L1 軸被抑制后，LCMV載量會明顯下降，說明PD-1+CD4+T 細胞會與PD-L1結合并導致細胞功能抑制，從而導致病毒復制［14］。

本研究中VZV 感染后PD-1 陽性表達的PD-1+CD4+T 細胞明顯升高，再次證實了VZV 可能與LCMV 病毒類似，會導致CD4+T 細胞功能抑制，從而達到促進病毒復制的作用。在選擇細胞因子指標的考量上，本研究所納入的IFN-γ、IL-2 及TNF-α均是在之前研究中被證實與PHN 之間可能存在相關性的因子［15］。而需要補充說明的是，白細胞介素中與PHN 相關的因素相對較多，但我們通過總結既往研究中PHN 患者與普通患者實驗室檢查指標之間的差異結果發(fā)現(xiàn)，IL-2 可能是導致其他白細胞介素改變的關鍵因素，故僅采用IL-2 代表白細胞介素加入研究［16］。通過實驗結果表明，兩組患者中IFN-γ、IL-2 并無明顯差異，考慮可能是因為本次研究所納入的患者均為急性期HZ 患者，上述兩個指標可能受到病情的影響，故并無顯著差異。TNF-α 是機體對于腫瘤細胞進行殺傷炎性細胞因子，但在VZV 感染的患者中，反而會因為TNF-α 激活導致感染的神經局部炎性反應加重的情況發(fā)生，從而會導致患者發(fā)生疼痛等并發(fā)癥，而其激活受到CD4+T 及CD8+T 細胞的影響［17］。

本研究PHN 發(fā)生率為26.56%，與共識當中的數據相符［6］。針對后續(xù)存在差異的指標進行分析：（1）兩組患者合并前屈疼痛存在差異，主要是由于VZV 病毒多數潛伏于神經中，血液中分布較少，故檢出率較低，往往等到后期出現(xiàn)皮疹以后才能明確HZ 診斷并對癥治療，但VZV 再發(fā)后疼痛發(fā)生的時間可能相對較早，病程相對較長，故發(fā)生PHN 的可能性也會增大；（2）開始治療時間預示著病毒復制的時間，在未開始治療期間，病毒復制控制相對更差，故此類患者局部病毒載量往往更高，清除相對難度更大，故PHN 發(fā)生率較高；（3）發(fā)病階段指標差異也相對容易理解，由于發(fā)病節(jié)段多預示著神經損傷更嚴重，故后續(xù)發(fā)生PHN 概率也會增加；（4）TNF-α 是由PBMC 中的淋巴細胞介導所釋放，且有研究［18］指出，TNF-α 相對集中于CD4+T 及CD8+T 細胞周圍，故在PHN 患者PBMC 上清液中的TNF-α 含量也會相對升高。需要特別指出的是，針對外周血中的TNF-α 對比結果不存在差異，分析原因可能由于外周血中組成成分更多，且更復雜，會稀釋TNF-α 的含量，從而外周血中的TNF-α 水平低于PBMC 上清液當中的TNF-α 水平，且兩組之間比較并無顯著差異。

隨后的多因素分析結果再次說明了PBMC 上清液當中的TNF-α 水平是影響PHN 發(fā)病的獨立因素，再次說明TNF-α 是影響PHN 發(fā)生的特異性細胞免疫因子，且對于PBMC 上清液當中的TNF-α 水平對于PHN 發(fā)生預測的ROC 結果進一步說明具有較好的預測效果，可以作為HZ 患者PHN 發(fā)生的預測因子之一。

本研究的局限性為，樣本量相對較小，可能導致實驗結果產生偏差，同時PMBC 提取相對復雜，對于臨床實用性有限。結果提示TNF-α 是影響PHN 發(fā)生的VZV 特異性細胞免疫因子，故今后可以進一步增加樣本量，同時開展多中心研究評估外周血TNF-α 水平與HZ 患者發(fā)生PHN 之間的關系，對本次研究進行補充，同時為臨床治療提供指導。

【Author contributions】YUAN Feng conceptualized，methodized and wrote original draft.FENG Dan supervised，wrote review and edited.LI Shaojun，ZHANG Shuli and LI Min investigated and validated the data.HU Han，TONG Shengxiong and TIAN Jiayu investigated and TIAN Jiayu investigated and contributed to formal analysis.All authors read and approved the final manuscript as submitted.