維生素D 對辛酸高脂飲食引起的前列腺癌小鼠骨轉(zhuǎn)移的影響

趙海軍 李偉 魏瑜 張麗翠 張玉 王新敏 王翠喆

1石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院（新疆 石河子 832000）；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院（新疆 石河子 832000）

前列腺癌是前列腺上皮細(xì)胞惡性增生所引起的一種腫瘤，約八成患者是65 歲以上的男性，并具有一定的遺傳傾向。據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示［1-2］，前列腺癌是全球男性第二高發(fā)惡性腫瘤。中國國家癌癥中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示［3］，中國男性前列腺癌的發(fā)病率約為6.72/10 萬，每年前列腺癌新發(fā)人數(shù)約為7.8 萬。臨床資料調(diào)查顯示［4］：約75% ～80%的前列腺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，而前列腺癌患者高死亡率多歸因于骨轉(zhuǎn)移。此外，出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者常伴隨骨折、骨痛和脊髓壓縮等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和治療依從性。研究［5］表明，肥胖后血液中脂肪酸水平顯著增高，而作為脂肪的合成原料，脂肪酸可以促進(jìn)骨中脂肪細(xì)胞的分化。筆者前期比較了正常個體和前列腺癌患者血清37 種脂肪酸的水平［6］，發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者辛酸水平顯著高于正常個體。此外，王曉希等［7］的研究指出，前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者血清25 羥基維生素D（25 hydroxyvitamin D，25-OH-D）含量降低，并指出血清25-OH-D 含量降低是引起前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的原因之一。然而，維生素D、辛酸與前列腺癌骨轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系尚未被研究確認(rèn)，本研究設(shè)計(jì)研究維生素D 治療對辛酸高脂飲食引起的前列腺癌小鼠骨轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 40 只C57BL/6 小鼠（6 ～8 周，20 ～23 g）購買自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。所有小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行，參考畢永祥等［8］的研究，在小鼠膝關(guān)節(jié)股骨下端，順著股骨長軸注射106個RM-1 細(xì)胞/20 μL 以建立前列腺癌骨轉(zhuǎn)移模型。然后，將所有小鼠隨機(jī)分為Control 組、High fat 組、Bitter 組和Vitamin D 組，每組10 只。Control 組：正常給予正常飼料喂養(yǎng)；High fat 組：給予高脂肪飼料（010139-03，斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司）喂養(yǎng)；Bitter 組：給予添加2%辛酸（P5585，北京索萊寶科技有限公司）高脂肪飼料喂養(yǎng)；Vitamin 組：給予添加2%辛酸（P5585，北京索萊寶科技有限公司）高脂肪飼料喂養(yǎng)，并且每兩天按照2.5 μg/kg 灌胃給予維生素D（BD224107，杭州馨然生物科技有限公司）治療。本研究實(shí)驗(yàn)動物經(jīng)石河子大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（實(shí)驗(yàn)動物倫理編號：A2017-115-01）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 小鼠前列腺癌細(xì)胞RM-1（CRL-3310，美國典型培養(yǎng)物保藏中心）培養(yǎng)在DMEM 培養(yǎng)基（D6046，Sigma Aldrich，USA），培養(yǎng)條件為：37 ℃+5% CO2。RM-1 細(xì)胞根據(jù)處理方法不同分為Control 組、Bitter only 組和Vitamin D 組。Control 組：RM-1 細(xì)胞不進(jìn)行任何處理培養(yǎng)48 h；Bitter only 組：40 μmol/L 辛酸處理48 h；Vitamin D組：10 nmol/L維生素D和40 μmol/L辛酸處理48 h。

1.3 血清脂質(zhì)、鈣和25-OH-D 檢測 小鼠在完成30 d 對應(yīng)喂養(yǎng)后被安樂死，眼球摘取收集外周血，離心（1 000 ×g，室溫，10 min）以收集血清，使用全自動生化分析儀（AU5800，貝克曼）檢測血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和鈣含量；使用小鼠25 羥基維生素D（25 hydroxyvitamin D，25-OHD）ELISA 試劑盒（M176656，北京邁瑞達(dá)科技有限公司）檢測血清25-OH-D 含量。

1.418F-氟化鈉PET/CT 檢測 所有小鼠經(jīng)尾靜脈注射185 kBq/g 的18F-氟化鈉（18F-NaF），1 h 后使用小動物PET/CT 活體成像系統(tǒng)（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）進(jìn)行全身成像，并計(jì)算最小/最大/平均標(biāo)準(zhǔn)化攝取值（SUVmin、SUVmax和SUVmean）。

1.5 Transwell 小室檢測細(xì)胞遷移和侵襲 在評價細(xì)胞遷移能力時，transwell 上室不做任何處理；而在評價細(xì)胞侵襲能力時，在接種細(xì)胞前，Matrigel膠被預(yù)先鋪到transwell 上室中。取1 × 104個轉(zhuǎn)染后的RM-1 細(xì)胞接種到24 孔Transwell 的上室中，加無血清培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。24 h 后，取出并去除培養(yǎng)基，用PBS 洗滌2 次，然后加入甲醇固定30 min厚干燥。干燥后的膜片經(jīng)結(jié)晶紫染色20 min 后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)下室細(xì)胞數(shù)目。

1.6 蛋白免疫印跡法 使用RIPA 裂解液（R0010，Solarbio，中國）從細(xì)胞中提取總蛋白。然后使用BCA 試劑盒（C503021，Sangon Biotech，中國）檢測總蛋白質(zhì)的濃度。最后，在90 V 恒定電壓下，通過10% SDS-PAGE 分離50 μg 總蛋白。將蛋白從SDS-PAGE 凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。用PBS（135 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，1.5 mmol/L KH2PO4，8 mmol/L K2HPO4，用HCl和NaOH 將pH 調(diào)整到7.2）洗滌膜3 遍后，將膜與E-cadherin（ab231303，abcam）、p-p8（ab178867，abcam）和p38（ab170099，abcam）抗體在4 ℃孵育過夜。然后在室溫下添加二抗孵育2 h。用磷酸鹽緩沖液-洗滌3 次后，加入ECL 溶液（WBKLS0100，北京新晶科生物技術(shù)有限公司，中國）進(jìn)行檢測。所有本次研究的抗體均購買自ABCAM 公司。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 研究數(shù)據(jù)通過SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以Turkey 為事后檢驗(yàn)的單因素方法分析被用于比較多組間的差異；配對獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)被用于比較兩組間的差異。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 維生素D 改善辛酸高脂喂養(yǎng)小鼠血清脂質(zhì)與正常飼料喂養(yǎng)的Control 組小鼠相比，高脂飼料喂養(yǎng)的High fat 組小鼠和添加辛酸的高脂飼料喂養(yǎng)的Bitter 組小鼠血液中總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量均升高（P＜0.05）；并且Bitter 組小鼠顯著高于High fat 組（P＜0.05）。與Bitter 組相比，維生素D 治療的辛酸高脂飼料喂養(yǎng)的Vitamin D組小鼠血液中總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量均降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 維生素D 對辛酸高脂喂養(yǎng)的前列腺癌小鼠血清脂質(zhì)的影響Fig.1 Effect of vitamin D on serum lipids of prostate cancer mice fed with caprylic acid/high fat

2.2 各組前列腺癌小鼠骨轉(zhuǎn)移CT 指標(biāo)比較 與Control 組小鼠相比，Hight fat 組和Bitter 組小鼠18FNaF PET/CT 檢測結(jié)果中SUVmin、SUVmax和SUVmean均升高（P＜0.05）；并且Bitter 組小鼠顯著高于High fat組（P＜0.05）。與Bitter組相比，Vitamin D組小鼠18FNaF PET-CT 檢測結(jié)果中SUVmin、SUVmax和SUVmean均降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 維生素D 對辛酸高脂喂養(yǎng)的前列腺癌小鼠骨轉(zhuǎn)移指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of vitamin D on bone metastasis index of prostate cancer mice fed with caprylic acid/high fat

2.3 各組小鼠血鈣和25-OH-D 含量的比較 與Control 組小鼠相比，Hight fat 組和Bitter 組小鼠血液鈣含量均升高（P＜0.05）；并且Bitter 組小鼠顯著高于High fat 組（P＜0.05）。與Bitter 組相比，Vitamin D 組小鼠血液鈣含量降低（P＜0.05）。與Control 組小鼠相比，Hight fat 組和Bitter 組小鼠血液25-OH-D 含量均降低（P＜0.05）；并且Bitter 組小鼠顯著低于High fat 組（P＜0.05）。與Bitter 組相比，Vitamin D 組小鼠血液25-OH-D 含量升高（P＜0.05）。見圖3。

圖3 維生素D 對辛酸高脂喂養(yǎng)的前列腺癌小鼠血鈣和25-OH-D 的影響Fig.3 Effect of vitamin D on serum calcium and 25-OH-D in prostate cancer mice fed with caprylic acid / high fat

2.4 維生素D 抑制辛酸促進(jìn)的前列腺癌細(xì)胞體外轉(zhuǎn)移 在體外，與不進(jìn)行任何處理的Control 組相比，辛酸處理的Bitter only 組RM-1 細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目均升高（P＜0.05）；與Bitter only 組，Vitamin D 組RM-1 細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目均降低（P＜0.05）。見圖4、5。

圖4 維生素D 抑制辛酸促進(jìn)的前列腺癌細(xì)胞體外遷移（× 200）Fig.4 Vitamin D inhibits the migration of prostate cancer cells promoted by caprylic acid in vitro（× 200）

圖5 維生素D 抑制辛酸促進(jìn)的前列腺癌細(xì)胞體外侵襲（× 200）Fig.5 Vitamin D inhibits the invasion of prostate cancer cells promoted by caprylic acid in vitro（× 200）

2.5 維生素D 對辛酸高脂喂養(yǎng)前列腺癌小鼠腫瘤組織E-cadherin 和p38 表達(dá)的影響 與Control 組相比，Hight fat 組和Bitter 組前列腺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠腫瘤組織E-cadherin 和p-p38/p38 蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）；并且Bitter 組小鼠高于High fat 組（P＜0.05）。與Bitter 組相比，Vitamin D 組列腺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠腫瘤組織E-cadherin 和p-p38/p38 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05）。見圖6。

3 討論

前列腺癌是目前造成男性患者死亡的第二位惡性腫瘤［9］，其中骨轉(zhuǎn)移是前列腺癌最常見的轉(zhuǎn)移位置［10］。流行病學(xué)研究［11］發(fā)現(xiàn)，肥胖是前列腺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險因素，并且肥胖也對前列腺癌患者手術(shù)治療效果、放療生物表型重現(xiàn)、癌細(xì)胞復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及死亡率產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)［12］，對臨床分期一致的前列腺癌患者使用相同的臨床治療方案，肥胖患者骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率是正?；颊叩? ～3 倍。此外，我們團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)［6］，前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者血清辛酸含量增高。然而，肥胖和辛酸對前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的影響未被研究所證實(shí)。

本研究發(fā)現(xiàn)，高脂肪飲食可顯著提高實(shí)驗(yàn)動物血液中脂質(zhì)含量，并且添加辛酸后脂質(zhì)含量更高。此外，研究還發(fā)現(xiàn)辛酸/高脂飲食不僅在體內(nèi)增加前列腺癌骨轉(zhuǎn)移指標(biāo)，而且辛酸還在體外促進(jìn)小鼠前列腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移，這表明辛酸/高脂飲食促進(jìn)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步分析可知［13-14］：高脂肪飲食引起體內(nèi)脂肪細(xì)胞的增加，尤其是骨髓脂肪細(xì)胞增多，而富含脂肪細(xì)胞的代謝活躍紅骨髓對轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的克隆和生長都具有吸引力，并且研究指出骨髓脂肪細(xì)胞的增多所引起的骨髓微環(huán)境特征性變化可能對前列腺癌選擇性骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生具有特殊的作用。辛酸是含有8 個C 的飽和脂肪酸，在體內(nèi)對其他外源性脂肪酸和膽固醇的吸收有重大影響［15］。此外，筆者前期的研究也發(fā)現(xiàn)［6］，辛酸可通過影響骨髓腔中脂肪細(xì)胞與成骨細(xì)胞的構(gòu)成比而促進(jìn)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移。因此，結(jié)合本研究結(jié)果表明，辛酸、高脂肪飲食均促進(jìn)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移。

維生素D 是人體血液中鈣離子水平調(diào)控的重要物質(zhì)，其在血液中以25-OH-D 的形式存在。之前的研究表明，腫瘤細(xì)胞發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的必要物質(zhì)之一是血鈣，并且臨床數(shù)據(jù)顯示血鈣含量越高的晚期癌癥患者臨床預(yù)后一般較差［16-17］。王曉希等人［7］在比較正常人、前列腺癌無骨轉(zhuǎn)移和前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者血鈣和血25-OH-D 時發(fā)現(xiàn)，前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者血鈣含量最高，而血25-OH-D 含量最低。本研究通過灌胃給予維生素D 以研究維生素D 對辛酸/高脂飲食促進(jìn)的前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的影響，結(jié)果顯示：維生素D 治療不僅顯著降低辛酸/高脂飲食引起的血脂質(zhì)和血鈣升高，而且顯著降低前列腺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠骨轉(zhuǎn)移指標(biāo)和顯著提高血清25-OH-D 含量，并在體外抑制辛酸增高的前列腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。這表明維生素D 可以通過增加小鼠體內(nèi)25-OH-D 含量而降低辛酸/高脂飲食引起的前列腺癌骨轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步分析可知［18-19］：維生素D 不僅可以通過負(fù)調(diào)控血鈣濃度而抑制腫瘤細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移，而且對多種腫瘤細(xì)胞的增殖分化、血管形成和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移均具有重要的調(diào)控作用［20］。

上皮細(xì)胞鈣黏蛋白（E-cadherin）是一種細(xì)胞黏附蛋白，其表達(dá)水平與癌細(xì)胞侵襲遷移能力密切相關(guān)［21-22］。p38 蛋白的磷酸化已經(jīng)被多項(xiàng)研究證實(shí)與前列腺癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移有關(guān)［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，辛酸前列腺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠腫瘤組織促進(jìn)E-cadherin 和p-p38/p38 蛋白表達(dá)，而維生素D 則減弱/逆轉(zhuǎn)辛酸的這一作用，即維生素D 在辛酸/高脂喂養(yǎng)的前列腺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠腫瘤組織抑制E-cadherin和p-p38/p38 蛋白表達(dá)，這一結(jié)果與ZHANG 等［24］和ZHOU 等［25］的研究結(jié)果一致。ZHANG 等研究指出，維生素D 缺乏促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞E-cadherin，進(jìn)而增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的侵襲遷移能力；而ZHOU 等的研究則指出，維生素D 可顯著降低細(xì)胞中p38 蛋白的磷酸化。結(jié)合本研究結(jié)果表明，維生素D 抑制辛酸促進(jìn)的前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制可能與抑制E-cadherin 和p-p38/p38 蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜述所述，維生素D 治療抑制辛酸高脂飲食促進(jìn)的前列腺癌小鼠骨轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與增加血清25-OH-D 含量和抑制癌細(xì)胞中E-cadherin、pp38/p38 蛋白表達(dá)有關(guān)。

【Author contributions】ZHAO Haijun performed the experiments and wrote the article.LI Wei and WEI Yu performed the experiments.ZHANG Licui and ZHANG Yu revised the article.WANG Xinmin and WANG Cuizhe designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.