咪達(dá)唑侖通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1 信號通路對宮頸癌細(xì)胞鐵死亡的作用及機(jī)制研究

張鵬 葛亮 孔令國 韓旭東

甘肅省婦幼保健院（甘肅省中心醫(yī)院）麻醉科（蘭州 730050）

宮頸癌是常見的婦科癌癥之一，發(fā)病率和病死率極高。雖然手術(shù)、化療、放療等治療方法已在臨床得到應(yīng)用，但預(yù)后并不令人滿意，總生存率仍較低［1］。因此，迫切需要探索新的治療靶點和療法。研究表明，靶向鐵死亡可能是治療宮頸癌的一種可行策略［2］。鐵死亡是一種鐵依賴的脂質(zhì)過氧化物積累達(dá)到致死水平的細(xì)胞死亡調(diào)控形式［3］。核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是調(diào)控鐵死亡的關(guān)鍵通路之一，該通路激活后可抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受鐵死亡［4］。咪達(dá)唑侖是一種吸收迅速、短效的苯二氮類衍生物，臨床中被廣泛用作鎮(zhèn)靜、催眠藥［5］。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)咪達(dá)唑侖可影響肝細(xì)胞癌［6］、肺癌［7］、乳腺癌［8］、神經(jīng)膠質(zhì)瘤［9］等多種腫瘤的發(fā)展，是一種潛在抗癌藥物。然而，但咪達(dá)唑侖在宮頸癌中的作用以及是否影響鐵死亡的發(fā)生仍鮮見報道。本研究旨在通過體外培養(yǎng)人宮頸癌HeLa 細(xì)胞，觀察咪達(dá)唑侖對HeLa 細(xì)胞鐵死亡的影響，并探究調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1 信號通路作為其分子機(jī)制的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料 HeLa細(xì)胞（貨號4613210，上海奧陸生物科技公司）；咪達(dá)唑侖（批號20210509，江蘇恩華藥業(yè)公司）；Nrf2 激活劑Bardoxolone（貨號HY-14909，Med Chem Express 公司）；CCK-8 試劑、0.1%結(jié)晶紫染液（貨號CA1210、G5500，北京Solarbio 公司）；碘化丙啶（propidium iodide，PI）（貨號P4170，上海玉博生物科技公司）；醋酸鈾（貨號ZCA-JPH534，上海甄準(zhǔn)生物科技公司）；檸檬酸鉛（貨號0002，武漢普洛夫生物科技公司）；鐵檢測試劑盒（貨號ab83366，Abcam 公司）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（貨號S0033S、S0052、S0131S，上海Beyotime 公司）；RIPA 裂解液、BCA 試劑盒、兔源一抗anti-GAPDH、山羊抗兔二抗（貨號WLA016a、WLA004a、WL01114、WLA023，沈陽Wanleibio 公司）；兔源一抗anti-Nrf2、anti-HO-1、anti-GSH 過氧化物酶4（GSH peroxidase 4，GPX4）、Lamin B1（貨號ab62352、ab68477、ab125066、ab133741，Abcam 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HeLa 細(xì)胞采用DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗），培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞密度達(dá)90%時收集。

1.3 CCK-8 實驗、克隆形成實驗檢測各組HeLa細(xì)胞增殖情況

1.3.1 CCK-8實驗 將HeLa細(xì)胞以5×103個/孔接種至96 孔板中，待貼壁后將其分為L-咪達(dá)唑侖組/M-咪達(dá)唑侖組/H-咪達(dá)唑侖組（5、10、20 μmol/L 咪達(dá)唑侖）［8］、H-咪達(dá)唑侖+Nrf2 激活劑組（20 μmol/L咪達(dá)唑侖+80 nmol/L Bardoxolone［10］），另設(shè)置正常培養(yǎng)的對照（Control）組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后加入CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育2 h，通過SKSW-KC 酶標(biāo)儀測定450 nm 波長處的吸光度（OD）。細(xì)胞活力與OD450值呈正比。

1.3.2 克隆形成實驗 將HeLa 細(xì)胞以1 × 103個/孔接種至6 孔板中，待貼壁后分組處理同上。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后置于4%多聚甲醛中固定20 min，而后置于0.1%結(jié)晶紫中染色10 min，于顯微鏡下計數(shù)≥50 個細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.4 PI 染色檢測各組HeLa 細(xì)胞死亡率 將HeLa細(xì)胞以1 × 106個/孔接種至6 孔板中，待貼壁后分組處理同1.3。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至流式管中，加入5 μL PI，4 ℃孵育5 min，通過BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞死亡率。

1.5 透射電鏡觀察各組HeLa 細(xì)胞線粒體形態(tài)變化 將HeLa細(xì)胞以1×106個/孔接種至6孔板中，待貼壁后分組處理同1.3。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞，加入2.5%戊二醛4 ℃固定過夜，次日PBS 清洗后加入1%鋨酸固定2 h，乙醇梯度脫水后進(jìn)行環(huán)氧樹脂包埋、超薄切片（60～80 nm），最后醋酸鈾、檸檬酸鉛各染色15 min，通過H-7650 透射電鏡捕獲圖像。

1.6 檢測各組HeLa 細(xì)胞中鐵、ROS、GSH、MDA水平 將HeLa 細(xì)胞以1 × 106個/孔接種至6 孔板中，待貼壁后分組處理同1.3。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞，利用鐵、ROS、GSH、MDA 檢測試劑盒分別檢測細(xì)胞裂解液中的鐵、ROS、GSH、MDA 水平。

1.7 Western blot檢測各組HeLa細(xì)胞中Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)蛋白及GPX4蛋白表達(dá)情況 將HeLa細(xì)胞以1 × 106個/孔接種至6 孔板中，待貼壁后分組處理同1.3。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞，利用RIPA 裂解液提取總蛋白，BCA 法測定濃度后進(jìn)行定量、變性處理，隨后進(jìn)行凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育兔源一抗anti-Nrf2、anti-HO-1、anti-GPX4、Lamin B、anti-GAPDH（4 ℃過夜），次日室溫孵育山羊抗兔二抗2 h，滴加ECL 發(fā)光液后置于Tan5200 凝膠成像分析系統(tǒng)中拍照，借助Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較行One-way ANOVA 分析，進(jìn)一步兩兩比較行SNK-q檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HeLa 細(xì)胞增殖情況 與Control 組比較，L-咪達(dá)唑侖組、M-咪達(dá)唑侖組、H-咪達(dá)唑侖組HeLa細(xì)胞活力下降，克隆數(shù)減少，且H-咪達(dá)唑侖組變化更明顯（P＜0.05）；與H-咪達(dá)唑侖組比較，H-咪達(dá)唑侖+Nrf2 激活劑組HeLa 細(xì)胞活力升高，克隆數(shù)增加（P＜0.05）。見圖1、表1。

表1 各組HeLa 細(xì)胞增殖情況Tab.1 Proliferation of HeLa cells in each group ±s

表1 各組HeLa 細(xì)胞增殖情況Tab.1 Proliferation of HeLa cells in each group ±s

注：與Control 組比較，*P ＜0.05；與L-咪達(dá)唑侖組比較，#P ＜0.05；與M-咪達(dá)唑侖組比較，△P ＜0.05；與H-咪達(dá)唑侖組比較，▲P ＜0.05

組別Control組L-咪達(dá)唑侖組M-咪達(dá)唑侖組H-咪達(dá)唑侖組H-咪達(dá)唑侖+Nrf2激活劑組F值P值n4 4 4 4 4細(xì)胞活力（OD450值）1.54±0.15 1.27±0.12*0.94±0.11*#0.61±0.08*#△0.97±0.12▲35.768＜0.001克隆數(shù)（個）132.45±10.93 107.28±9.41*81.45±6.52*#52.61±4.39*#△76.18±6.15▲61.159＜0.001

圖1 克隆形成實驗檢測HeLa 細(xì)胞克隆數(shù)Fig.1 Clonal formation experiment to detect the number of HeLa cell clones

2.2 各組HeLa 細(xì)胞死亡率 與Control 組比較，L-咪達(dá)唑侖組、M-咪達(dá)唑侖組、H-咪達(dá)唑侖組HeLa細(xì)胞死亡率增加，且H-咪達(dá)唑侖組變化更明顯（P＜0.05）；與H-咪達(dá)唑侖組比較，H-咪達(dá)唑侖+Nrf2 激活劑組HeLa 細(xì)胞死亡率減少（P＜0.05）。見圖2、表2。

表2 各組HeLa 細(xì)胞死亡率Tab.2 HeLa cell mortality in each group ±s，%

表2 各組HeLa 細(xì)胞死亡率Tab.2 HeLa cell mortality in each group ±s，%

注：與Control 組比較，*P ＜0.05；與L-咪達(dá)唑侖組比較，#P ＜0.05；與M-咪達(dá)唑侖組比較，△P ＜0.05；與H-咪達(dá)唑侖組比較，▲P ＜0.05

組別Control 組L-咪達(dá)唑侖組M-咪達(dá)唑侖組H-咪達(dá)唑侖組H-咪達(dá)唑侖+Nrf2 激活劑組F 值P 值n4 4 4 4 4死亡率9.16 ± 1.03 15.89 ± 2.15*26.53 ± 2.94*#39.46 ± 3.12*#△23.18 ± 2.57▲85.664＜0.001

2.3 各組HeLa 細(xì)胞線粒體形態(tài)變化 Control 組HeLa 細(xì)胞線粒體形態(tài)正常，經(jīng)L-咪達(dá)唑侖組、M-咪達(dá)唑侖、H-咪達(dá)唑侖處理后，線粒體呈現(xiàn)顯著的鐵死亡特征，體積縮小，膜密度增加，嵴減少，且H-咪達(dá)唑侖組變化更明顯；而在H-咪達(dá)唑侖處理的同時增加Nrf2 激活劑處理，線粒體鐵死亡損傷程度減輕。見圖3。

圖3 透射電鏡觀察HeLa 細(xì)胞線粒體形態(tài)變化（× 15 000）Fig.3 Morphological changes of mitochondria in HeLa cells observed by transmission electron microscopy（× 15 000）

2.4 各組HeLa 細(xì)胞中鐵、ROS、GSH、MDA 水平及GPX4 蛋白表達(dá)情況 與Control 組比較，L-咪達(dá)唑侖組、M-咪達(dá)唑侖組、H-咪達(dá)唑侖組HeLa 細(xì)胞中鐵、ROS、MDA 水平升高，GSH 水平及GPX4 蛋白表達(dá)下降，且H-咪達(dá)唑侖組變化更明顯（P＜0.05）；與H-咪達(dá)唑侖組比較，H-咪達(dá)唑侖+Nrf2 激活劑組HeLa 細(xì)胞中鐵、ROS、MDA 水平下降，GSH 水平及GPX4 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。見圖4、表3。

表3 各組HeLa 細(xì)胞中鐵、ROS、GSH、MDA 水平及GPX4 蛋白表達(dá)情況Tab.3 The levels of iron，ROS，GSH，MDA，and GPX4 protein expression in HeLa cells in each group ±s

表3 各組HeLa 細(xì)胞中鐵、ROS、GSH、MDA 水平及GPX4 蛋白表達(dá)情況Tab.3 The levels of iron，ROS，GSH，MDA，and GPX4 protein expression in HeLa cells in each group ±s

注：與Control 組比較，*P ＜0.05；與L-咪達(dá)唑侖組比較，#P ＜0.05；與M-咪達(dá)唑侖組比較，△P ＜0.05；與H-咪達(dá)唑侖組比較，▲P ＜0.05

組別Control 組L-咪達(dá)唑侖組M-咪達(dá)唑侖組H-咪達(dá)唑侖組H-咪達(dá)唑侖+Nrf2 激活劑組F 值P 值n4 4 4 4 4鐵（nmol/mg）0.46 ± 0.08 0.81 ± 0.10*1.52 ± 0.13*#2.14 ± 0.21*#△1.39 ± 0.15▲85.151＜0.001 ROS（%Control）1.05 ± 0.12 1.53 ± 0.16*2.18 ± 0.21*#2.93 ± 0.27*#△1.86 ± 0.19▲51.782＜0.001 GSH（nmol/mg）1.79 ± 0.16 1.45 ± 0.12*1.18 ± 0.10*#0.78 ± 0.09*#△1.06 ± 0.11▲42.271＜0.001 MDA（nmol/mg）7.15 ± 1.02 10.86 ± 1.23*14.31 ± 1.62*#18.06 ± 2.08*#△13.29 ± 1.71▲26.493＜0.001 GPX4/GAPDH 0.94 ± 0.09 0.78 ± 0.07*0.59 ± 0.07*#0.31 ± 0.04*#△0.53 ± 0.06▲50.346＜0.001

圖4 Western blot 檢測HeLa 細(xì)胞中GPX4 蛋白表達(dá)情況Fig.4 Western blot detection of GPX4 protein expression in HeLa cells

2.5 各組HeLa 細(xì)胞中Nrf2/HO-1 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 與Control 組比較，L-咪達(dá)唑侖組、M-咪達(dá)唑侖組、H-咪達(dá)唑侖組HeLa 細(xì)胞中核Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)下降，且H-咪達(dá)唑侖組變化更明顯（P＜0.05）；與H-咪達(dá)唑侖組比較，H-咪達(dá)唑侖+Nrf2 激活劑組HeLa 細(xì)胞中核Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。見圖5、表4。

表4 各組HeLa 細(xì)胞中Nrf2/HO-1 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況Tab.4 Expression of Nrf2/HO-1 signal pathway related proteins in HeLa cells of each group ±s

表4 各組HeLa 細(xì)胞中Nrf2/HO-1 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況Tab.4 Expression of Nrf2/HO-1 signal pathway related proteins in HeLa cells of each group ±s

注：與Control 組比較，*P ＜0.05；與L-咪達(dá)唑侖組比較，#P ＜0.05；與M-咪達(dá)唑侖組比較，△P ＜0.05；與H-咪達(dá)唑侖組比較，▲P ＜0.05

組別Control組L-咪達(dá)唑侖組M-咪達(dá)唑侖組H-咪達(dá)唑侖組H-咪達(dá)唑侖+Nrf2激活劑組F值P值例數(shù)4 4 4 4 4核Nrf2/Nrf2 0.61±0.07 0.50±0.05*0.37±0.03*#0.22±0.03*#△0.34±0.04▲41.982＜0.001 HO-1/GAPDH 1.13±0.12 0.94±0.08*0.71±0.06*#0.45±0.05*#△0.67±0.06▲44.918＜0.001

圖5 Western blot 檢測HeLa 細(xì)胞中Nrf2/HO-1 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.5 Western blot detection of Nrf2/HO-1 signal pathway related protein expression in HeLa cells

3 討論

宮頸癌是全球發(fā)病率和病死率極高的惡性腫瘤類型［11-12］。宮頸癌的主要治療策略是手術(shù)和化療，但化療易產(chǎn)生耐藥性，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率仍較高，預(yù)后不理想［13］。因此，迫切需要尋找新的機(jī)制或治療方案。

近年來，靶向鐵死亡已成為癌癥治療的熱門研究領(lǐng)域［14-15］。鐵死亡為一種鐵依賴的脂質(zhì)過氧化物積累引發(fā)的細(xì)胞死亡形式，伴有特征性的形態(tài)學(xué)變化，包括線粒體皺縮，膜密度增加，嵴數(shù)量減少或消失，生化表現(xiàn)主要有ROS 堆積，毒性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 大量產(chǎn)生［16-17］。GPX4 是一種抗鐵死亡介質(zhì)，GPX4 可催化還原型GSH 生成氧化型GSH，而在此過程中，毒性脂質(zhì)過氧化物被還原為反應(yīng)性較低的羥基化合物，也就是說，GPX4 可通過將GSH 作為底物終止鐵死亡的發(fā)生，故鐵死亡的生化表現(xiàn)亦伴隨GPX4、GSH 的耗竭［18］。目前，咪達(dá)唑侖已被證實具有潛在的抗腫瘤作用，例如，QI 等［6］發(fā)現(xiàn)咪達(dá)唑侖可通過上調(diào)miR-124-3p 抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；LU 等［8］發(fā)現(xiàn)咪達(dá)唑侖可通過抑制細(xì)胞增殖和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化對肺癌和乳腺癌發(fā)揮抗癌作用。此外，有報道稱咪達(dá)唑侖在婦科腫瘤（包括宮頸癌）患者的手術(shù)中具有較好的鎮(zhèn)靜作用［19-20］。但咪達(dá)唑侖在宮頸癌中的作用及鐵死亡是否參與目前尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)HeLa 細(xì)胞經(jīng)L-咪達(dá)唑侖、M-咪達(dá)唑侖、H-咪達(dá)唑侖處理后，細(xì)胞活力下降，克隆數(shù)減少，死亡率升高，表明咪達(dá)唑侖可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞死亡，具有抗宮頸癌作用。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，咪達(dá)唑侖在抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞死亡時伴隨著顯著的鐵死亡形態(tài)學(xué)特征和生化表現(xiàn)，即鐵、ROS、MDA 水平升高，GSH、GPX4 水平下降，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系，表明咪達(dá)唑侖不僅能夠抑制HeLa 細(xì)胞增殖，還可誘導(dǎo)其鐵死亡，高劑量效果更佳。

Nrf2 是抗氧化系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)因子，正常條件下，Nrf2 錨定于胞質(zhì)中，而在氧化條件下Nrf2 易位進(jìn)入細(xì)胞核，啟動HO-1 抗氧化基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)鐵代謝、脂質(zhì)代謝和谷胱肽合成等過程，保護(hù)細(xì)胞免受鐵死亡［21-22］。研究顯示，抑制Nrf2/HO-1 通路是誘導(dǎo)癌細(xì)胞鐵死亡的重要靶點［23-24］。高薇等［25］發(fā)現(xiàn)，鴉膽子苦醇可通過抑制Nrf2/HO-1 通路，誘導(dǎo)胃癌HGC-27 細(xì)胞鐵死亡，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。為了探究咪達(dá)唑侖誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞鐵死亡是否與抑制Nrf2/HO-1 信號通路有關(guān)，我們首先檢測了經(jīng)L-咪達(dá)唑侖、M-咪達(dá)唑侖、H-咪達(dá)唑侖處理后HeLa 細(xì)胞中核Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者表達(dá)均下調(diào)，且經(jīng)H-咪達(dá)唑侖處理后下調(diào)更明顯。然后我們在H-咪達(dá)唑侖處理的基礎(chǔ)上增加Nrf2 激活劑處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，咪達(dá)唑侖誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞鐵死亡的作用被減弱。這兩部分結(jié)果共同表明咪達(dá)唑侖誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞鐵死亡與抑制Nrf2/HO-1 信號通路有關(guān)。

綜上所述，咪達(dá)唑侖能以劑量依賴性方式抑制HeLa 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其鐵死亡，可能通過抑制Nrf2/HO-1 信號通路而實現(xiàn)。本研究可望為咪達(dá)唑侖的抗癌應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

【Author contributions】ZHANG Peng performed the experiments and wrote the article.HAN Xudong performed the experiments.GE Liang revised the article.KONG Lingguo designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.