2022年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者帕博的研究方法初探

徐 寒,張洪雷

(南京中醫(yī)藥大學(xué):1.第一臨床醫(yī)學(xué)院;2.馬克思主義學(xué)院/醫(yī)學(xué)人文學(xué)院,江蘇 南京 210023)

2022年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者斯萬特·帕博的開創(chuàng)性研究,創(chuàng)造了一門全新的學(xué)科:古基因組學(xué)。通過不斷揭示現(xiàn)代人與古人類的基因差異,進(jìn)而展現(xiàn)人類進(jìn)化的真實(shí)歷程,為現(xiàn)代人類被稱為獨(dú)特人類這一現(xiàn)象提供了解釋基礎(chǔ),同時(shí)也回答了最偉大的哲學(xué)問題:我們從哪里來?

作為一名未知領(lǐng)域的開拓者,帕博及其團(tuán)隊(duì)?wèi){借其不屈不撓的精神,在不懈地探索與堅(jiān)持下,于2010年證明了現(xiàn)代人與古人類有基因交流,證明了除非洲之外的歐亞大陸的古人類們也對現(xiàn)代人的基因有所貢獻(xiàn),對學(xué)術(shù)界造成了巨大的沖擊;同時(shí),帕博在研究的過程中開創(chuàng)了研究古DNA的新方法,新技術(shù),對整個(gè)行業(yè)的繼續(xù)發(fā)展提供了寶貴的材料。

在翻涌的歷史潮流中,無數(shù)科學(xué)家們在思考著“我們從哪里來”這一問題,不懈地進(jìn)行著相關(guān)的研究,但只有帕博的研究從中脫穎而出。因此,我們設(shè)想,在他的科研歷程中一定存在著獨(dú)特的研究方法,使得他開辟出了一條前所未有的道路。

1 帕博的科研方法初探

1.1 問題意識與問題導(dǎo)向

習(xí)近平總書記曾說過:“理論創(chuàng)新只能從問題開始[1]。”同樣的思想不僅適用于理論創(chuàng)新,同樣也適用于科學(xué)研究,帕博便是這樣。

科學(xué)研究本意上就是對問題進(jìn)行研究,抓住了問題便是抓住了研究的核心與方向。帕博在把研究方向從埃及文物學(xué)轉(zhuǎn)向分子生物學(xué)領(lǐng)域的過程中第一次產(chǎn)生了關(guān)于古今人類DNA測序應(yīng)用的疑問:是否可以通過現(xiàn)代人的DNA測序推及古埃及人的DNA?是否DNA在木乃伊上仍然留存,并且甚至有可能在細(xì)菌中復(fù)制?是否可以利用此方法得出現(xiàn)代人類與古埃及人之間的DNA聯(lián)系[2]?為了解決這些問題,帕博開始分析法老們的DNA,并與現(xiàn)代人的DNA 進(jìn)行對比。1984年,帕博成功地利用化學(xué)方法提取到了DNA,并克隆出了DNA片段。在這一問題的引導(dǎo)下,帕博真正開啟了對古基因的研究。

我國當(dāng)前的醫(yī)學(xué)教育模式,教學(xué)多是灌輸醫(yī)學(xué)知識,并不考慮作為人的學(xué)生的整體性、發(fā)展性和獨(dú)立性特點(diǎn),以至于學(xué)生難于形成優(yōu)秀的專業(yè)素養(yǎng)[3]。因此完善教育指導(dǎo)體系,建立多元育人模式,為學(xué)生提供實(shí)踐教育的機(jī)會,激發(fā)學(xué)生的問題意識,鼓勵(lì)學(xué)生進(jìn)行自我探索迫在眉睫[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)教育的改革與人才培養(yǎng)模式的創(chuàng)新已成為大趨勢,作為更易接受新事物的當(dāng)代大學(xué)生,我們應(yīng)主動(dòng)培養(yǎng)自我的問題意識,并勇于嘗試。

1.2 跨學(xué)科方法

當(dāng)代科學(xué)研究與技術(shù)發(fā)明日趨復(fù)雜,僅靠單一學(xué)科研究已無法再取得突破,往往需要多門學(xué)科的融會貫通,才能解決問題[5]。帕博在研究古DNA的過程中以分子生物學(xué)為基礎(chǔ),橫跨考古學(xué),歷史學(xué),群體遺傳學(xué),古生物學(xué)等多門學(xué)科領(lǐng)域。

研究人類歷史的演化多歸屬于考古學(xué),帕博卻采用分子生物學(xué)的方法——通過研究古人類DNA 序列的變異來探尋人類歷史的演化。緊接著,帕博利用生物信息學(xué)在Illumina平臺上生成最大的數(shù)據(jù)集并進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析整合[6],利用人類遺傳學(xué)和語言學(xué)的關(guān)聯(lián)構(gòu)建來模擬人類歷史,發(fā)現(xiàn)尼安德特人與現(xiàn)代人在27萬～44萬年前分開。而后,帕博在對尼安德特人DNA進(jìn)行研究時(shí),繼續(xù)采用跨學(xué)科交叉的方法,將分子生物學(xué)與群體遺傳學(xué)、生物信息學(xué)等多學(xué)科融貫在一起,成功使帕博及其團(tuán)隊(duì)從DNA片段中獲得了可靠的序列,推動(dòng)了尼安德特人基因組草圖的完成。

教育部等部委于2018年10月提出了《關(guān)于加強(qiáng)醫(yī)教協(xié)同實(shí)施卓越醫(yī)生教育培養(yǎng)計(jì)劃 2.0的意見》,意見中指出要向“醫(yī)文、醫(yī)工、醫(yī)理、醫(yī)X交叉學(xué)科為支撐的醫(yī)學(xué)模式”轉(zhuǎn)變,將醫(yī)學(xué)知識與其他相關(guān)學(xué)科的先進(jìn)理論進(jìn)行有機(jī)整合,培養(yǎng)能夠解決醫(yī)學(xué)領(lǐng)域前沿問題的高層次復(fù)合型人才[7],而跨學(xué)科的研究探索需要耗費(fèi)大量時(shí)間,同時(shí)多個(gè)學(xué)科的通力協(xié)作需要我們具備活躍的思維以及靈活運(yùn)用方法的能力,作為當(dāng)代的中醫(yī)學(xué)子,我們要意識到跨學(xué)科的重要性,在臨床中要活化我們的思維,不能故步自封,只專注于中醫(yī)學(xué),更要學(xué)會結(jié)合諸如西醫(yī)學(xué),大數(shù)據(jù)學(xué),信息學(xué)等多學(xué)科的優(yōu)點(diǎn),以此得到創(chuàng)新性的成果。多學(xué)科結(jié)合治療的道路任重而道遠(yuǎn),當(dāng)代中醫(yī)學(xué)子應(yīng)肩負(fù)起大任,推動(dòng)我國醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)更上一層樓。

1.3 技術(shù)方法

分子克隆技術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一項(xiàng)技術(shù),帕博等人利用分子克隆儀分離并研究了一些從木乃伊表層組織上獲得的古DNA片段,成為將DNA技術(shù)應(yīng)用到考古學(xué)的第一人[8]。20世紀(jì)80年代,古代DNA的檢測新方式——PCR技術(shù)被研發(fā)出來,帕博等人利用PCR確定了尼安德特人的四個(gè)短基因序列:參與皮膚色素沉著的MC1R基因片段、參與語言中樞的FOX2基因片段、參與ABO血型位點(diǎn)的一部分基因片段、味覺受體基因[9]。此時(shí)的PCR雖然可以復(fù)制古DNA,但面對生物體的大部分基因仍無法擴(kuò)增。高通量DNA測序技術(shù)的發(fā)展使從古代標(biāo)本中隨機(jī)提取DNA片段進(jìn)行大規(guī)模的擴(kuò)增測序成為可能。利用454平臺上的高通量測序技術(shù),帕博等人直接測定出了來自尼安德特人骨的近40萬bp的核DNA序列和來自同一塊骨的另一個(gè)被克隆至質(zhì)粒載體的DNA片段,這些測量證明了生成尼安德特人mtDNA全序列和核基因組的可行性,也讓帕博意識到研究古DNA不僅是一門從無到有的學(xué)問,更是一項(xiàng)漫長的技術(shù)攻堅(jiān),于是帕博等人進(jìn)行了許多技術(shù)改進(jìn),終于在對技術(shù)地不斷升級后,以確鑿而精確的數(shù)據(jù)測序出了尼安德特人的全部基因組序列,也為丹尼索瓦人基因組序列的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。

在帕博的研究過程中,其對前沿技術(shù)的敏銳洞察力,使得他一直站在古DNA技術(shù)革新的前沿,正是得益于技術(shù)的不斷革新,帕博的古DNA研究才會取得如此巨大的結(jié)果?？茖W(xué)技術(shù)是第一生產(chǎn)力,我國的醫(yī)學(xué)教育起步較晚,科技在教育領(lǐng)域的應(yīng)用也較為落后,然而將先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)融入醫(yī)學(xué)教育中,為醫(yī)學(xué)教育提供有力的技術(shù)支持是培養(yǎng)既有知識又有技術(shù)的復(fù)合型醫(yī)學(xué)人才的重要手段。人工智能技術(shù)作為計(jì)算機(jī)領(lǐng)域最具有潛力的技術(shù),在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中也獲得了廣泛的應(yīng)用,因此,醫(yī)學(xué)院校應(yīng)有意識地在兼顧理論授課時(shí)長的同時(shí),增加人工智能技術(shù)的相關(guān)教學(xué)課程,讓醫(yī)學(xué)生們接觸最為先進(jìn)的新興技術(shù),培養(yǎng)具備人工智能相關(guān)技術(shù)的醫(yī)學(xué)人才[10]。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

科學(xué)實(shí)驗(yàn)是科學(xué)研究的重要方法和過程,脫離了科學(xué)實(shí)驗(yàn),便不會有如今的這些科學(xué)成果。實(shí)驗(yàn)室作為科學(xué)家的研究空間,對科學(xué)家的科研工作起到了巨大的作用,尤其是在研究古DNA的這個(gè)領(lǐng)域,實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)是最為常用的方法,實(shí)驗(yàn)室的污染往往會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成嚴(yán)重的影響。

尼安德特人中的大多數(shù)DNA片段與現(xiàn)代人類相同,因此現(xiàn)代人類的DNA污染實(shí)驗(yàn)后可能會被誤認(rèn)成內(nèi)源性古代DNA序列。對測定的尼安德特人DNA數(shù)據(jù)集進(jìn)一步分析表明,其被現(xiàn)代人類DNA污染的程度已達(dá)40%～41%[11]。面對嚴(yán)重的DNA污染問題,帕博等人采用了許多技術(shù)改進(jìn),發(fā)現(xiàn)唯一能夠積極消除污染的方法是將所研究的生物體與潛在的污染源分離開,即建立一個(gè)潔凈安全,完全隔離的潔凈室[12],這是一個(gè)將提取DNA和處理老舊組織的實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)室的其他實(shí)驗(yàn)進(jìn)行物理隔離并專門用于古DNA提取和擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)室。為了根除污染現(xiàn)象,該實(shí)驗(yàn)室還伴有一些列極為嚴(yán)苛得到規(guī)定:進(jìn)實(shí)驗(yàn)室必須經(jīng)過一個(gè)前廳,并在那里穿戴整齊;其次,所有的儀器和試劑需無接觸地直接送到實(shí)驗(yàn)室中且進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室禁止帶入任何物品;最后,當(dāng)天進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的人不被允許二次進(jìn)入[13]。帕博開發(fā)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)室解決了古DNA提取和制備過程中的污染問題,克服了古DNA樣本測序中序列錯(cuò)誤的問題,經(jīng)過多年的積累,形成了一套被古DNA研究領(lǐng)域廣為借鑒的規(guī)范與標(biāo)準(zhǔn)。

帕博的科研成就離不開他在實(shí)驗(yàn)室科學(xué)上的成功,潔凈室的建造在整個(gè)研究環(huán)節(jié)中看起來微小,卻是決定性的。這種對營造實(shí)驗(yàn)外部環(huán)境的重視,值得我們國內(nèi)的科研團(tuán)隊(duì)學(xué)習(xí)。此外,在科研過程中,研究者的主觀因素必須與外部的客觀因素相結(jié)合才能產(chǎn)出優(yōu)秀的科研成果,作為醫(yī)學(xué)生,我們不能忽視實(shí)驗(yàn)環(huán)境的影響,片面地強(qiáng)調(diào)自身的能力提升,必須要重視科學(xué)實(shí)驗(yàn),只有這樣,才能最大化利用當(dāng)今中國逐漸進(jìn)步的物質(zhì)條件,同步提升我國的科研實(shí)力。

1.5 經(jīng)驗(yàn)方法

在對骨骼中DNA的提取過程中,帕博等人發(fā)現(xiàn)在DNA提取過程中可能發(fā)生短分子的丟失以至于古代DNA測序文庫中短于40bp的分子明顯不足,于是他們系統(tǒng)查閱了大量的文獻(xiàn),特別關(guān)注有關(guān)DNA提取的線索,發(fā)現(xiàn)了一種利用二氧化硅提取微生物DNA的方法,帕博等人結(jié)合單鏈DNA的制備對此方法進(jìn)行改進(jìn)與試驗(yàn),成功從洞穴熊骨骼[14]和牙齒中重建并提取了線粒體基因組序列[15],直至今日這種改進(jìn)的古DNA提取技術(shù)仍被用于大多數(shù)古DNA的提取。緊接著,帕博等人開啟了對少量DNA的測序,一直以來采用的桑格測序法較為煩瑣緩慢,于是帕博等人根據(jù)桑格測序法的原理進(jìn)行方法改進(jìn),開發(fā)了一種基于PCR生成的DNA模板高度平行焦磷酸測序的DNA測序方法,使短時(shí)間內(nèi)確定數(shù)十萬個(gè)長度為100或250nt的DNA序列成為可能,成功應(yīng)用于確定更新世物種遺骸的DNA序列,改變了傳統(tǒng)的DNA研究方式,推動(dòng)了“第二代測序法”的開始,為焦磷酸測序儀的產(chǎn)生提供了理論基礎(chǔ),促進(jìn)了帕博的研究進(jìn)程。

帕博的技術(shù)方法不是憑空產(chǎn)生的,或是依據(jù)大量的文獻(xiàn)閱讀以及豐富的知識積累,或是通過在前人技術(shù)上的改進(jìn)而產(chǎn)生的新方法。正如屠呦呦在古籍中發(fā)現(xiàn)青蒿素的廣泛用途一樣,新思維,新技術(shù)方法的產(chǎn)生離不開前人的經(jīng)驗(yàn)積累,中醫(yī)藥歷史悠久,無數(shù)的瑰寶等著我們?nèi)グl(fā)現(xiàn),作為醫(yī)藥研究者,我們應(yīng)意識到閱讀古籍文獻(xiàn)的重要性。

1.6 數(shù)學(xué)方法

在古DNA的研究過程中,通過建立和求解數(shù)學(xué)模型是帕博最為常用的方法之一。在利用高通量技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增DNA的過程中,帕博等人面臨的最大困難之一是DNA的序列問題,建立受損傷DNA模型成為帕博解決此類問題的首選。通過建立模型用給定的每個(gè)堿基頻率、單鏈懸垂端的平均長度、雙鏈DNA的脫氧胞嘧啶殘基頻率以及單鏈DNA的脫氧胞嘧啶殘基頻率模擬假設(shè)的尼安德特人序列的預(yù)期錯(cuò)誤序列,帕博等人發(fā)現(xiàn)結(jié)果與觀察到的數(shù)據(jù)相吻合,證實(shí)了假設(shè)的正確性,為后來的評估高通量測序技術(shù)的序列錯(cuò)誤概率提供了一個(gè)框架,解決了基因組測序過程中的序列問題。

建立模型模擬其實(shí)是邏輯思維中“假設(shè)”推理類型在科學(xué)研究中的應(yīng)用。通過建立模型以模擬某種現(xiàn)象或過程,能夠推理各個(gè)變量之間的關(guān)系,可以有效驗(yàn)證研究的先期猜想。建立數(shù)學(xué)模型雖然已經(jīng)在各種領(lǐng)域得到過廣泛應(yīng)用,但是在中醫(yī)藥領(lǐng)域,通過模型模擬來驗(yàn)證某種猜想或假設(shè)的研究構(gòu)思方法還沒有被運(yùn)用到和自然科學(xué)、工程技術(shù)、社會科學(xué)等一樣成熟的地步。我們應(yīng)該更多地重視這種一般科學(xué)的基本研究框架的構(gòu)思方法,使學(xué)科更加科學(xué)化、正規(guī)化、標(biāo)準(zhǔn)化。

2 結(jié)語

法國科學(xué)家拉普拉斯說過:“認(rèn)識一位天才的研究方法,對于科學(xué)的進(jìn)步,甚至于對他本人的榮譽(yù),并不比發(fā)現(xiàn)本身更少用處。”探索人類自身是所有學(xué)者為之努力的問題。帕博為這個(gè)問題開辟了一條研究道路,不僅給現(xiàn)今的古基因研究帶來了巨大的啟示,也為無數(shù)的科研工作者們提供了嶄新的方法道路。作為大學(xué)生,為了將來能夠更好地踏上科研道路,應(yīng)追隨帕博,回顧他的研究歷程,探索他的研究方法,從中學(xué)習(xí)。習(xí)近平總書記在《加快建設(shè)科技強(qiáng)國》一文中,呼吁國內(nèi)科研重視學(xué)科交叉融合大勢,同時(shí)指出了萬物智能互聯(lián)時(shí)代的到來,增強(qiáng)了科研精度,利用這些技術(shù)進(jìn)步,未來的科研工作者仍然大有可為。作為醫(yī)藥研究的一分子,我們應(yīng)當(dāng)看到新冠疫情對醫(yī)藥研究的推動(dòng)和圍繞疫情展開的搶占科技制高點(diǎn)的競爭博弈。習(xí)近平總書記在二十大報(bào)告中指出:“雖然我國科技獨(dú)立自主性增強(qiáng),經(jīng)費(fèi)和科研人員數(shù)呈上升趨勢,但是科技創(chuàng)新仍舊是短板,科技強(qiáng)國仍將作為長久發(fā)展戰(zhàn)略。”因此,對科技創(chuàng)新方法進(jìn)行探究,刻不容緩。