淚液成分檢測在眼部疾病診治中的應用及相關研究進展

劉北安，張詠鑫，葉 琳*

（1.暨南大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 深圳 518020 ；2.深圳市眼科醫(yī)院，暨南大學附屬深圳眼科醫(yī)院，深圳市眼病防治研究所，廣東 深圳 518040）

淚液是由淚腺分泌的水樣液體，由多種成分構成，如蛋白質、糖類、脂類、水和電解質等[1]。淚液成分的相對穩(wěn)定是眼部健康的基本前提，而其成分顯著變化會引起一系列眼部疾病。近年來，關于淚液的研究逐漸成為熱點。有學者認為，可以此為突破口進一步探究眼科相關疾病的診斷及治療。本文從淚液采集、淚液成分檢測方法和淚液成分檢測在眼部疾病診治中的應用三個方面闡述淚液檢測的相關研究進展，為眼科臨床工作提供參考。

1 淚液采集和保存

研究發(fā)現(xiàn)，淚液收集方法的選擇關系著樣本質量，因此需要采用合適的收集方法。為了保證樣本質量以及研究結果的可信度，應在無刺激、麻醉的條件下收集。目前收集的方法有以下幾種：玻璃微毛細管采集法、Schimer 試紙收集法和纖維素海綿收集法。進行大量淚液成分的檢測時，主要是采用玻璃微毛細管收集樣本，且此法比較利于后期成分的分析[2]。干眼癥患者由于眼淚少，用玻璃微毛細管難以收集。對于干眼癥患者、敏感患者和兒童，Schirmer 試紙收集是一種較為簡便而快捷的方法。但是，試紙條離心后所得樣本量較少，離心操作還會引起強烈反應，引起不必要的分析物稀釋[3]。纖維素海綿是從眼外收集眼淚，對患者刺激小，但某些細胞因子容易與海綿結合，在提取過程中造成困難，且這種方法也可能刺激眼淚分泌反射，引起不必要的稀釋。

除了上述收集淚液方法外，王東華教授提出，在淚液采集過程中可使用淚小管吻合術中的硅膠管，此方法對眼表的刺激最小、淚液采集量較大；但是，尚有不少問題有待解決，如在顯微鏡下采集眼淚時硅膠管的最佳傾斜角度、硅膠管的重復利用率以及成本問題等。隨著相關研究的不斷深入，研究人員開始使用眼前接觸尖端（PCT）來獲取樣本。研究人員指出，此方法與使用玻璃毛細管相比，安全性更高，患者易于接受。除了收集方法的影響，標本的保存方法也同樣干擾淚液成分，目前研究認為，淚液標本的保存溫度包括4℃、-20℃、-70℃以及-80℃（具體根據(jù)用途確定）。

2 淚液成分檢測

淚液成分檢測包括免疫組分檢測、蛋白質組學檢測及其他分子的檢測。淚液中的免疫組分較為復雜，比如有腫瘤標志物、自身抗體等。而在這些組分中，腫瘤標志物、自身抗體、IgE 有較強的特異性，對疾病的治療起著非常關鍵的作用。需要指出的是，細胞因子的檢測不能直接診斷疾病，然而臨床醫(yī)師可基于檢測結果評估患者的免疫狀態(tài)，有助于病因分析，為干預方案的制定提供支持。免疫組分主要成分為蛋白質，檢驗與蛋白組學檢測手段類似。隨著質譜技術及蛋白質組學的發(fā)展，淚液的蛋白質檢測也起著越來越重要的作用，為人類研究眼部疾患發(fā)病機制、進行疾病的診治提供依據(jù)。據(jù)文獻報道，淚液中含1543 種蛋白質。蛋白質對眼部功能的維持具有重要作用，如殺菌保護作用、參與免疫反應、清除脂質穩(wěn)定淚膜、濕潤角膜以及為結膜角膜等提供營養(yǎng)，并可加快眼表上皮愈合?，F(xiàn)階段，醫(yī)學界已經(jīng)提出了眾多檢測淚液蛋白的方法，其中比較常用的是液相多重珠陣列、固相芯片膜微陣列、同位素標記相對和絕對定量等[4]。

3 淚液成分檢測在眼部疾病診治中的應用

3.1 干眼癥

干眼癥是最常見的一種眼部疾病。本病是多種因素共同作用的結果，病理特征為淚膜不穩(wěn)定，并伴有多種眼部癥狀。其病因包括淚膜不穩(wěn)定、高滲透性、眼表炎癥損傷以及神經(jīng)感覺異常等。目前已有許多關于干眼癥的淚液蛋白組學研究，據(jù)文獻報道干眼癥患者的淚液中蛋白比健康人群多，并指出本病的形成主要與異常蛋白質引起的免疫炎癥反應有關。迄今為止，許多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種干眼癥患者淚液中差異表達的蛋白質。Perumal 等[5]利用蛋白組學研究方法對健康組和患者組的淚液樣本進行對比，發(fā)現(xiàn)患者組淚液中S100-A8 蛋白顯著增加，且含有大量的蛋白4、蛋白3 等；同時，與健康組相比，該組樣本中細胞外糖蛋白、α- 烯醇化酶等含量較少。Zhou 等[6]在干眼癥患者淚液中發(fā)現(xiàn)了多種下調的蛋白質，比如載脂蛋白-1、乳鐵蛋白等，以及6 種表達呈上升趨勢的蛋白質，其中包括α1酸性糖蛋白1、S100A8/ 鈣粒蛋白、S100A9/ 鈣粒蛋白B。其他研究也證實這些下降的蛋白在干眼癥患者淚液中的含量越少，疾病越嚴重[7]。Versura 等[8]在總結前人研究經(jīng)驗的基礎上，對比蒸發(fā)過強型干眼患者和正常人淚液蛋白質的差異，發(fā)現(xiàn)脂質轉運蛋白-1、乳鐵蛋白和親脂蛋白A-C 含量均降低，清蛋白含量上升，而鋅-α2糖蛋白水平維持在恒定狀態(tài)。干眼癥患者淚液中涉及的蛋白質改變復雜多樣，目前尚未有統(tǒng)一的結論，但不可否認的是大部分蛋白質的變化與免疫炎癥反應有關。因此，這提示我們，臨床上關于干眼癥的治療可集中于抗炎及免疫調節(jié)。

3.2 過敏性結膜炎

過敏性結膜炎是一種常見病和多發(fā)病，從本質上看，屬于變態(tài)反應性疾病。本病的形成與眾多因素有關，一般呈季節(jié)性發(fā)作?？蓪⑵溥M一步細分為巨乳頭性結膜炎、春季角結膜炎等。已有多位學者發(fā)現(xiàn)，此病患者的淚液成分會發(fā)生變化。其中比較具有代表性的研究是，Li 等[9]發(fā)現(xiàn)患者淚液樣本中總蛋白濃度及部分淚液蛋白含量增多，其中脂蛋白相關磷脂酶A2的含量增加較明顯。Leonardi 等[10]發(fā)現(xiàn)春季角結膜炎患者淚液樣本的組分也會發(fā)生顯著變化，其中血清白蛋白、轉鐵蛋白含量較健康組多，且差異顯著；由此得出的結論是，淚液蛋白升高的程度與眼病嚴重程度相關，同時其轉鐵蛋白、血紅素、乳球蛋白β 表達明顯增加。研究發(fā)現(xiàn)，過敏性結膜炎患者淚液樣本中組分較正常人更高的還有嗜酸細胞陽離子蛋白、IgE等[11]。許多研究還顯示，過敏性結膜炎患者淚液樣本中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、γ 干擾素、TFN-α 的濃度均有不同程度的增高[12]。有人發(fā)現(xiàn)，春季角結膜炎患者淚液中MMP-1、MMP-9 的水平和活性明顯增加[13]。總而言之，大量實驗表明過敏性結膜炎患者淚液中促炎細胞因子的數(shù)量較正常人更多，故而在干預時要以遠離變應原和抗炎治療為主。

3.3 甲狀腺相關性眼?。═AO）

甲狀腺相關性眼病（thyroid associated ophthal mopathy，TAO）是由甲狀腺功能障礙引起的自身免疫性疾病，是成人常見的眼眶病。近年來，為更好地評估TAO 的活動性及分層，許多學者對TAO 患者的淚液進行分析。有人經(jīng)過一系列檢測發(fā)現(xiàn)在TAO患者的淚液樣本中有多種細胞因子的表達升高，如IL-1β、IL-2、IL-6、IL-18 和TFN-α。Huang 等[14]在研究中發(fā)現(xiàn)，活動期TAO 組淚液中IL-6、IL-8 的水平明顯高于靜止期TAO 組及正常對照組；活動期TAO 組與靜止期TAO 組TNF-α 的水平均明顯高于正常對照組；與正常對照組相比，活動期TAO 組的IL-17 水平更高，靜止期TAO 組的IL-2 水平更高。Song 等研究發(fā)現(xiàn)，TAO 患者淚液中CD40、CD40 配體、IL-21、IL-6 和巨噬細胞炎癥蛋白3α 的表達增加，而GM-CSF、IL-1SRI 和IL-13 表達下降。Chen等研究發(fā)現(xiàn)TAO 患者眼淚樣本中含量較正常人更高的組分有IL-15 和IL-17。Cai 等也展開了類似研究，并發(fā)現(xiàn)靜止期IL-7 的含量最高，活動期則恰好相反。由此得出的結論是，IL-7 在眼表免疫平衡中扮演著重要角色。以上研究表明，炎癥損傷是TAO 眼表病變的主要誘發(fā)因素。此外，江利紅等[15]發(fā)現(xiàn)TAO 患者淚液中的溶菌酶數(shù)量較正常人更多，同時乳鐵蛋白水平上調。由此得出，它們可能參與了TAO 的炎癥反應。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，氧化應激反應可引起組織損傷，加速炎癥的進展。Aass 顯示，TAO 患者淚液中有多種蛋白的水平失調，這些蛋白可能有助于更好地了解TAO。尤其是溶菌酶C、催淚蛋白、抗白蛋白酶和鋅結合α2- 糖蛋白1 的上調提示淚腺會參與TAO 的發(fā)病。以上研究結果提示，TAO 患者的淚液成分可以幫助人們更好地揭示本病的形成原理、可作為早期疾病診斷的生物標志物，并啟發(fā)我們探索新的TAO 治療方案。

3.4 圓錐角膜

圓錐角膜（keratoconus，KC）是我國重要的致盲性眼病之一，危害性較大。該病的病因復雜，治療困難，預后效果差。有研究指出，探討用于KC 早期診斷的生物標志物將對臨床干預本病有重要意義。You 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，KC 患者淚液中糖蛋白類分泌型卷曲相關蛋白-1（secreted frizzled-related-protein-1，SFRP-1）的水平顯著降低。Jun 等[17]發(fā)現(xiàn)KC 患者淚液中IL-6 的水平升高，而IL-12、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-13 和CCL5 的 水 平 降 低。Yenihayat 等[18]發(fā)現(xiàn)KC 患者淚液中角蛋白Ⅱ型細胞骨架1、血清清蛋白、免疫球蛋白γ-1、載脂蛋白A1 等的表達減少，與此同時，樣本中溶菌酶C、脂蛋白的表達增加，因此推測這些蛋白與KC 的形成有關。Pannebaker 等[19]做了更進一步的研究，結果表明，KC 患者MMP-1 的表達增加，推測一些特征性蛋白質也參與了KC 的發(fā)生和發(fā)展，但是這些蛋白如何作用于KC 的發(fā)生和發(fā)展仍需要進一步探討。Balasubramanian 等研究發(fā)現(xiàn)，KC 患者眼淚中組織蛋白酶B 的水平會升高3 倍多，而聚合免疫球蛋白受體的數(shù)量則明顯減少，纖維蛋白原α 鏈的水平明顯下降，抑素s 和胱抑素SN 的含量也顯著降低。有研究人員指出，角蛋白1 型細胞骨架14 僅存在于KC 患者的眼淚中。他們認為淚液中蛋白質的變化（即蛋白酶抑制劑含量的降低以及蛋白酶含量增多）可反映KC 所涉及的分子機制，為KC 的治療及預防提供指導。Shetty 等發(fā)現(xiàn)KC 患者淚液中MMP-9 和IL-6 水平較高，并提出環(huán)孢素A 可用于治療KC。Sorkhabi 等發(fā)現(xiàn)KC 患者淚液中IL-10 的水平明顯低于對照組，而IL-6、IL-1β、IFN-γ 則明顯增加，表明KC 的發(fā)病機制可能涉及復雜的慢性炎癥事件。以上關于KC 淚液分析的研究都為KC 的診斷和治療提供了新的思路，但是具體的治療方案仍需要大量的實驗論證。

3.5 青光眼

青光眼是不可逆性失明的重要影響因素，早期診斷仍缺乏有效途徑。Pieragostino 等[20]在研究中發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，未接受治療原發(fā)性開角型青光眼（POAG）患者的淚液中有25 種上調蛋白。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，這些蛋白直接參與了炎癥反應、自由基清除等過程。經(jīng)前列腺素類似物（PGA）治療后，POAG 患者的淚液中有12 種上調蛋白被下調。Roedl等[21]發(fā)現(xiàn)，POAG 患者淚液中同型半胱氨酸含量較正常人更多，這表明淚液中同型半胱氨酸含量較高可能是青光眼發(fā)生的危險因素。Ghaffariyeh 等[22]對正常眼壓性青光眼（normal-tension glaucoma，NTG）和健康對照組淚液中的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）進行測定發(fā)現(xiàn)，相比于健康對照組，NTG 患者淚液中BDNF 的含量較低，且差異具有統(tǒng)計學意義；由此可見，眼淚中的BDNF 可能是早期檢測NTG 的有效生化標志物。Wong 等通過鑒定124 種淚液蛋白發(fā)現(xiàn)，長期使用抗青光眼藥物的患者（藥物治療組）與非藥物治療組比較，S100-A9、S100-A8 的水平顯著增加，干預時間不足一年患者的淚液樣本中脯氨酸豐富蛋白4 的含量較少。此外還發(fā)現(xiàn)，患者若使用局部抗青光眼藥物1年以上，其眼表發(fā)生炎癥反應的概率更高，這一研究結論對青光眼的干預具有重要意義。

4 總結

綜上所述，淚液成分檢測可用于多種眼部疾病的病因研究、輔助診斷、治療和治療監(jiān)測，進而改善患者的生活質量。需要指出的是，盡管目前部分眼科疾病的淚液成分檢測仍缺乏統(tǒng)一的標準，但隨著蛋白質組學、脂質組學與代謝組學的進一步發(fā)展以及相關研究的不斷深入，淚液成分檢測有望成為眼科疾病診療的重要步驟。淚液成分檢測有著許多優(yōu)點，如淚液標本采集無創(chuàng)、所需淚液樣本少、檢測準確性高、檢測速度快、操作簡便、經(jīng)濟可靠等。因此，淚液成分檢測有良好的臨床應用前景，值得在臨床上大力推廣。