UPLC-MS/MS法測(cè)定米拉貝隆中EDCI

王玉如,盧忠秋,蘭公劍

(南京正大天晴制藥有限公司,江蘇 南京 210046)

米拉貝隆是首個(gè)治療膀胱過(guò)度活動(dòng)癥(OAB)的β3-腎上腺素受體激動(dòng)劑類藥物,與治療OAB的一線藥物抗膽堿能藥相比,該藥安全性較高,具有良好的應(yīng)用前景[1]。2011年9月在日本首次上市,2012年6月美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市[2-4]。米拉貝隆的合成工藝是以2-氨基噻唑-4-乙酸、對(duì)硝基苯乙胺鹽酸鹽和R-扁桃酸為起始物料,經(jīng)縮合、還原和縮合等反應(yīng)生成,在縮合工藝中用到1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亞胺(EDCI)縮合劑,含有碳二亞胺類遺傳毒性警示結(jié)構(gòu)[5]。遺傳毒性雜質(zhì)是指在微量的水平下能誘導(dǎo)DNA發(fā)生突變的雜質(zhì),具有潛在的致癌性,威脅人類的健康[5-8],已被廣泛關(guān)注及嚴(yán)格控制。因此有必要建立一種米拉貝隆中EDCI的檢測(cè)方法。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于EDCI檢測(cè)的研究較少,對(duì)米拉貝隆中EDCI的測(cè)定未見報(bào)道[9-10]。根據(jù)國(guó)際藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)議(ICH)M7、美國(guó)FDA、歐洲EMA和中華人民共和國(guó)藥典(四部)關(guān)于基因毒性雜質(zhì)的指導(dǎo)原則等要求[11-13],遺傳毒性雜質(zhì)的毒理學(xué)關(guān)注閾值(Threshold of Toxicological Concern,TTC)為1.5 μg/d。米拉貝隆緩釋片最大日劑量為50 mg,所以米拉貝隆中EDCI的限度為30 mg/kg,限度較低,且該雜質(zhì)紫外吸收較弱,采用普通液相色譜方法滿足不了靈敏度要求。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有靈敏度高、分析速度快及結(jié)果準(zhǔn)確可靠等特點(diǎn)[14-16],可以滿足痕量雜質(zhì)檢測(cè)的要求。本研究首次建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(Ultra High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,UPLC-MS/MS),可準(zhǔn)確、靈敏地測(cè)定米拉貝隆原料藥中基因毒性雜質(zhì)EDCI的殘留量。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

1290超高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);6470三重四極桿質(zhì)譜儀(安捷倫科技有限公司);MSA6.6S電子分析天平(賽多利斯-上海貿(mào)易有限公司);ME802E電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);XSE205DU 電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

1.2 試藥

乙酸銨(LC/MS級(jí)別,上海安譜科技有限公司);乙腈(HPLC級(jí),默克股份有限公司);EDCI對(duì)照品(批號(hào):MB20060501,純度:99.8%,蘇州昊帆生物股份有限公司);米拉貝隆原料藥(批號(hào):144190601、144190602、144190603,南京正大天晴制藥有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法條件

2.1.1 色譜條件

液相色譜柱Agilent ZORBAX Bonus-RP(150×4.6 mm,3.5 μm);流動(dòng)相A為10 mmol/L乙酸銨溶液,流動(dòng)相B為乙腈;流速1.0 mL/min;柱溫35 ℃;進(jìn)樣體積10 μL;流動(dòng)相梯度見表1,六通閥切換設(shè)置:6 min設(shè)置進(jìn)入廢液。

表1 流動(dòng)相梯度

2.1.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(Electrospray Ionization Source,ESI); 采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Multiple Reaction Monitoring,MRM)模式,正離子模式檢測(cè);EDCI離子對(duì)及相關(guān)參數(shù)見表2。離子源參數(shù):干燥氣溫度300 ℃;干燥氣流速5 L/min;鞘氣溫度250 ℃;鞘氣流速11 L/min;霧化器壓力45 psi;噴嘴電壓500 V;毛細(xì)管電壓3 500 V。

表2 EDCI離子對(duì)及相關(guān)參數(shù)

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品貯備液

取EDCI對(duì)照品適量,精密稱定,置量瓶中,用溶劑[V(乙腈)∶V(水)=50∶50]溶解并定量稀釋制成每1 mL約含300 ng的溶液,作為對(duì)照品貯備液。

2.2.2 對(duì)照品溶液

精密量取對(duì)照品貯備液適量,用溶劑[V(乙腈)∶V(水)=50∶50] 定量稀釋制成每1 mL約含30 ng的溶液,作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液

取米拉貝隆約10 mg,精密稱定,置10 mL量瓶中,用溶劑[V(乙腈)∶V(水)=90∶10]溶解并定量稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn)

分別精密量取溶劑[V(乙腈)∶V(水)=50∶50]、對(duì)照品溶液和供試品溶液(批號(hào):144190601)各10 μL,按照上述色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行試驗(yàn),記錄色譜圖,試驗(yàn)結(jié)果見圖1。溶劑和供試品溶液均不干擾EDCI的測(cè)定,表明本方法的專屬性良好。

圖1 專屬性試驗(yàn)TIC色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)對(duì)照品貯備液適量,分別用溶劑[V(乙腈)∶V(水)=50∶50]溶解并定量稀釋制成每1 mL約含3.0,15,24,30,45,60 ng(10%～200%限度濃度)的系列濃度的線性溶液,取各濃度的線性溶液,按“2.1”項(xiàng)下方法條件進(jìn)樣,以EDCI的濃度為橫坐標(biāo)(x),以EDCI的峰面積為縱坐標(biāo)(y),進(jìn)行線性回歸。回歸方程為:y=2 291.027 6x+1 295.825 1,r= 0.999 8。結(jié)果表明,EDCI在質(zhì)量濃度3.03～60.56 ng/mL范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。

2.3.3 定量限與檢測(cè)限試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)對(duì)照品貯備液適量,用溶劑[V(乙腈)∶V(水)=50∶50]逐步稀釋,分別稀釋至信噪比S/N≥10為定量限溶液;至信噪比S/N≥3為檢測(cè)限溶液。結(jié)果該方法下EDCI的定量限質(zhì)量濃度為0.18 ng/mL(相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.18×10-6);平行測(cè)定6次峰面積RSD為5.2%(n=6);檢測(cè)限質(zhì)量濃度為0.06 ng/mL(相當(dāng)于供試品濃度的0.06×10-6),結(jié)果表明,定量限濃度明顯低于限度濃度的10%(3.00×10-6),方法靈敏度較好,符合檢測(cè)要求。

2.3.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取米拉貝隆樣品(批號(hào):144190601)10 mg,精密稱定9份,置10 mL量瓶中,用溶劑[V(乙腈)∶V(水)=50∶50]溶解,精密加入“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液各0.50,1.00和1.50 mL,分別用溶劑稀釋至刻度,搖勻,作為50%回收率溶液、100%回收率溶液和150%回收率溶液;每個(gè)濃度水平平行配制3份。按“2.1”項(xiàng)下方法條件檢測(cè),結(jié)果表明,采用外標(biāo)法計(jì)算,不同濃度水平,EDCID的回收率在83.43%～90.62%,滿足70%～130%的驗(yàn)證要求,RSD為3.2%(n=9),表明該方法的準(zhǔn)確度良好,見表3。

表3 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

2.3.5 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6針,記錄峰面積,結(jié)果峰面積的RSD為1.0%(n=6),保留時(shí)間RSD為0.1%(n=6),表明該儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取米拉貝隆樣品(批號(hào):144190601)10 mg,精密稱定6份,置20 mL量瓶中,用溶劑[V(乙腈)∶V(水)=50∶50]溶解,分別精密加入“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液1.00 mL,用溶劑稀釋至刻度,搖勻,作為重復(fù)性溶液。依法測(cè)定,結(jié)果EDCI含量的RSD為2.2%<10%(n=6),表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 中間精密度試驗(yàn)

不同的分析人員在不同日期進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn),照“2.3.6重復(fù)性”項(xiàng)下方法重新配制對(duì)照品溶液和6份加標(biāo)供試品溶液,測(cè)定加標(biāo)供試品溶液中雜質(zhì)的含量,與重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算12次測(cè)量結(jié)果的RSD。結(jié)果EDCI含量的RSD為3.8%(n=12),表明該方法中間精密度良好。

2.3.8 溶液穩(wěn)定性

按照“2.2.2”和“2.2.3”項(xiàng)下溶液配制方法,分別配制對(duì)照品溶液和供試品溶液,在室溫條件放置0,4,10,14,16和19 h后測(cè)定,結(jié)果對(duì)照品溶液峰面積與0 h比值均介于79.5%～94.0%,供試品溶液中均未檢測(cè)出EDCI,結(jié)果對(duì)照品溶液和供試品溶液室溫放置19 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 樣品測(cè)定

取3批樣品(批號(hào):144190601、144190602、144190603),按“2.2.3”項(xiàng)下溶液配制方法配制供試品溶液,按“2.1”方法條件進(jìn)樣測(cè)定,采用外標(biāo)法以峰面積進(jìn)行計(jì)算,3批米拉貝隆中均未檢測(cè)出EDCI。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用了不同流速(0.9,1.0,1.1 mL/min),不同的柱溫(30,35,40 ℃)及不同的有機(jī)相比例(3%,5%,7%),結(jié)果表明,適當(dāng)微調(diào)系統(tǒng)參數(shù),對(duì)EDCI的測(cè)定均無(wú)影響。本方法具有專屬性良好、線性范圍寬、準(zhǔn)確度良好和靈敏度高等特點(diǎn),可用于米拉貝隆中EDCI的測(cè)定。