季銨鹽化N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物 對表皮葡萄球菌的抗菌活性和生物相容性研究

朱佶鵬，周 敏，陳 勝，2，江偉男，宋恭華，劉潤輝，4

(1. 華東理工大學藥學院，上海 200237)

(2. 華東理工大學 超細材料制備與應用教育部重點實驗室，上海 200237)

(3. 華東理工大學材料科學與工程學院，上海 200237)

(4. 華東理工大學深圳研究院，深圳 518063)

1 前 言

細菌引起的微生物感染是困擾人類健康的嚴重問題[1]。為了解決這一問題，研究人員發(fā)現(xiàn)和開發(fā)了許多治療細菌感染的抗生素。然而，抗生素的大量和過度使用使某些細菌產(chǎn)生了嚴重的耐藥性，增加了感染患者并發(fā)癥和死亡的風險[2]。美國疾病控制和預防中心2021年的一份報告顯示，美國每年有280多萬感染患者表現(xiàn)出抗生素耐藥性，其中35 000人因感染耐藥菌而死亡。因此，急需發(fā)展在醫(yī)學和公共衛(wèi)生領域能有效對抗耐藥菌的抗感染藥物和高效的抗菌手段。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽[3，4]和陽離子化合物[5，6]通常不易使細菌產(chǎn)生耐藥性[7]。其中季銨鹽是最常用的陽離子抗菌劑之一。一般認為，季銨鹽的殺菌作用機制包括：① 化合物吸附和滲透至細菌細胞壁，② 化合物與細菌細胞質膜(主要是細胞膜上脂質或蛋白質)反應，導致膜破裂，③ 細菌細胞內低分子質量物質的泄漏以及蛋白質和核酸降解，④ 自溶酶引起的細菌細胞壁裂解[7，8]。在眾多季銨鹽類化合物中，季銨鹽化的聚合物具有無揮發(fā)性、高化學穩(wěn)定性、強抗菌性和低殘留毒性等優(yōu)點[9]。已有的研究結果表明，基于聚乙烯基吡啶[10]、聚丙烯酸酯[11]、聚丙烯酰胺[12]、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯[13]、聚苯撐乙炔[14]、聚噻吩[15]、聚硅氧烷[16]、聚乙烯亞胺[17]、甲基丙烯酸羧基甜菜堿[18]、聚降冰片烯[19]、聚乙烯基咪唑[20]、聚(N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺)[21]和改性天然多糖[22]為主體骨架結構的季銨鹽化的聚合物，在抗菌方面均表現(xiàn)出不錯的潛力。

自1960年代以來，聚噁唑啉類化合物的聚合及應用研究受到了廣泛關注[23-28]。有大量文獻報道了2-取代噁唑啉類化合物的開環(huán)聚合反應[29-32]。聚噁唑啉具有優(yōu)異的生物相容性，聚(2-乙基-2-噁唑啉)是被美國食品與藥品監(jiān)督管理局批準使用的間接食品添加劑[33]。通過側鏈或鏈末端的取代基R，可以很容易地把手性和功能性基團引入到聚噁唑啉中，其理化性質(親水性、疏水性、手性、生物功能性等)也可以通過側鏈的性質進行調整，從而為合成具有復雜層次結構的仿生自組裝材料開辟了新思路。

基于聚噁唑啉類化合物的生物相容性，早在2005年，Tiller課題組[34，35]制備了接枝不同鏈長季銨鹽末端基團的聚噁唑啉聚合物，該聚合物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌展現(xiàn)出了較好的抗菌效果。Liu課題組[36]以宿主防御肽為模型，發(fā)現(xiàn)基于聚2-噁唑啉的甘氨酸類肽聚合物可以模擬宿主防御肽，在體外和體內對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌均具有較好的抗菌活性。由于該聚合物具有與活性氧物種相關的抗菌機制，所以金黃色葡萄球菌不會對合成的聚合物產(chǎn)生耐藥性。經(jīng)該聚合物處理后的金黃色葡萄球菌對常用抗生素仍然敏感，表明在常用抗菌劑和聚2-噁唑啉的甘氨酸類肽聚合物之間沒有明顯的抗菌壓力或交叉耐藥性[37]。在此基礎上，受細胞穿透肽結構的啟發(fā)，2022年，Jiang等[38]又報道了側鏈為胍基的聚2-噁唑啉聚合物抗真菌劑，該抗真菌劑擁有較低的哺乳動物細胞毒性，且在治療局部和系統(tǒng)性真菌感染方面具有強療效。

如圖1所示，本文設計、合成了一系列側鏈為不同季銨鹽的N,N-二甲基-2-取代噁唑啉聚合物，并對該聚合物進行了一系列抗菌研究和生物相容性評價。該季銨鹽化的聚合物具有較好的抗菌活性，對血紅細胞溶血率較低，對多重耐藥菌菌株的抗菌活性略高于對標準菌株的抗菌活性。其中優(yōu)選化合物H-(OctylMe2NMeOx)18-Pip對表皮葡萄球菌多重耐藥菌菌株S.e0692的最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)為12.5 μg/mL，且針對人血紅細胞的10%溶血濃度(HC10)∶MBC>160∶1，顯示出良好的選擇性。

圖1 季銨鹽化的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物對表皮葡萄球菌和血紅細胞的選擇性

2 實 驗

2.1 原料與試劑

4-二甲氨基吡啶(DMAP)、超干N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N,N-二甲基甘氨酸、2-氯乙基異氰酸酯、四氫呋喃(THF)、叔丁醇鉀、三氟甲磺酸鈧(Sc(OTf)3)、溴丙烷、溴戊烷、溴庚烷、溴壬烷、哌啶、無水硫酸鎂、石油醚、甲醇均為分析純，購自上海泰坦科技股份有限公司。酵母提取物、胰蛋白胨、Mueller-Hinton(MH)肉湯固體、瓊脂、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、曲拉通(Triton)X-100均購自上海麥克林生化科技股份有限公司。細菌S.eATCC49134為表皮葡萄球菌標準菌株，購自ATCC。細菌S.e0692為耐氨芐西林、環(huán)丙沙星和四環(huán)素的多重耐藥表皮葡萄球菌菌株，自瑞金康復醫(yī)院臨床分離。

2.2 儀器與設備

Micromass LCT KC317型質譜分析儀(ESI)，美國Waters公司；Bruker Magnet System 400 MHz型核磁共振波譜儀(NMR)，德國Bruker公司；Super(1220/750/900)型超級凈化手套箱，米開羅那(中國)有限公司；SpectraMax M2型酶標儀，美國Molecular Devices公司。

2.3 實驗方法

2.3.1 單體N,N-二甲基-2-噁唑啉的合成

單體N,N-二甲基-2-噁唑啉(Me2NMeOx)的合成路線如圖2所示。0 ℃下在1 L的三口瓶中依次加入91.5 mg DMAP(0.75 mmol)、3.1 g N,N-二甲基甘氨酸(30 mmol)、500 mL二氯甲烷，進行磁力攪拌，待反應液攪拌均勻后，于30 min內緩慢滴加250 mL含有3.9 g 2-氯乙基異氰酸酯(0.375 mmol)的二氯甲烷稀釋液，滴加完成后移去冷卻裝置并將反應體系置于室溫下反應。反應12 h后，于1 h內再向三口燒瓶中分3批加入10.1 g叔丁醇鉀(90 mmol)，并繼續(xù)在室溫下攪拌12 h。反應結束后，使用二氯甲烷(3×500 mL)萃取，合并有機相用500 mL飽和食鹽水洗滌，二氯甲烷相用無水硫酸鎂干燥后濃縮除去，再減壓蒸餾得到無色油狀液體Me2NMeOx 2.5 g，分離產(chǎn)率為65%。

圖2 N,N-二甲基-2-噁唑啉的合成

2.3.2 N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物的合成

2.3.2.1 N,N-二甲基-2-噁唑啉的聚合

以三氟甲磺酸鈧為引發(fā)劑、Me2NMeOx為單體，合成不同鏈長的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物，合成路線如圖3所示。具體制備過程依照之前文獻報道的方法進行[39]，在高純N2保護的手套箱中，稱取256.4 mg Me2NMeOx(2 mmol)置于干燥、放有磁力攪拌子的反應瓶中，并加入4 mL超干DMAc溶解。然后加入適當比例的Sc(OTf)3作為引發(fā)劑(n引發(fā)劑∶n單體=1∶10或1∶20或1∶40，物質的量比)。將反應瓶從手套箱中取出，在N2保護下于130 ℃下進行反應(n引發(fā)劑∶n單體=1∶10，反應6 h；n引發(fā)劑∶n單體=1∶20，反應12 h；n引發(fā)劑∶n單體=1∶40，反應24 h)。反應完成后加入引發(fā)劑3倍當量的哌啶在室溫下攪拌12 h進行淬滅反應，之后加入2 mL THF，進一步將反應液倒入40 mL石油醚中混勻得到絮狀沉淀，體系經(jīng)過離心(4000 r/min，3 min)后收集固體并使用氮氣流進行干燥。再次向收集的固體中加入2 mL THF，溶解后將該溶液加入40 mL石油醚中混勻，得到的含絮狀沉淀混合物經(jīng)離心(4000 r/min，3 min)分離后收集固體。重復上述溶解—沉淀—離心操作6次，真空干燥后得到N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物H-(Me2NMeOx)n-Pip。

圖3 N,N-二甲基-2-噁唑啉的聚合

2.3.2.2 N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物的季銨鹽化

N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物H-(Me2NMeOx)n-Pip的季銨鹽化合成路線如圖4所示。稱量適當比例的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物H-(Me2NMeOx)n-Pip和烷基溴(n聚合物上的N,N二甲基∶n烷基溴=1∶2)，使用2 mL甲醇作為溶劑(烷基溴的反應濃度為0.2 mol/L)回流反應12 h。反應結束冷卻至室溫后，加入2 mL THF并將反應液倒入40 mL石油醚中混合均勻即可得到絮狀沉淀，體系經(jīng)過離心(4000 r/min，3 min)后收集固體或液體并使用氮氣流進行干燥(有部分樣品中的甲醇和烷基溴可能未能通過一次操作完全帶走，所以呈現(xiàn)液體)。再次加入2 mL THF溶解后將反應液加入40 mL石油醚中混勻，得到的含絮狀沉淀混合物經(jīng)離心(4000 r/min，3 min)分離后收集固體。重復上述溶解—沉淀—離心過程6次，真空干燥后得到側鏈季銨鹽化的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物產(chǎn)物(H-(ButylMe2NMeOx)n-Pip、H-(HexylMe2NMeOx)n-Pip、H-(OctylMe2NMeOx)n-Pip、H-(DecylMe2NMeOx)n-Pip)。

圖4 N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物的季銨鹽化

2.4 樣品檢測

2.4.1 凝膠滲透色譜測試

2.4.2 最低抑菌濃度測試

Luria-Bertani (LB)液體培養(yǎng)基的配制：依次稱量2.5 g酵母提取物、5.0 g胰蛋白胨和5.0 g NaCI，加入500 mL去離子水中混合均勻，在高壓滅菌鍋中110 ℃下滅菌15 min。MH液體培養(yǎng)基的配制：稱量10.5 g MH肉湯固體，加入500 mL去離子水混合均勻，在高壓滅菌鍋中110 ℃下滅菌15 min。

最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)測試操作規(guī)程：細菌用LB液體培養(yǎng)基在37 ℃的搖床中以200 r/min轉速培養(yǎng)10 h，培養(yǎng)所得的細菌通過離心收集并重新分散到MH培養(yǎng)基中。將菌液稀釋成為2×105cfu/mL備用。將待測樣品在96孔板中用MH培養(yǎng)基按兩倍率逐級稀釋，孔板中的待測樣品濃度范圍為1.56～200 μg/mL。在同一個96孔板中有4個孔只加入MH培養(yǎng)基作為陰性對照，4個孔加入MH培養(yǎng)基和菌液作為陽性對照(不含待測樣品)。向每個孔中加入50 μL之前稀釋好的菌液，全部加入后輕微搖晃10 s，并在37 ℃霉菌培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)9 h，然后再用酶標儀讀取波長設定為600 nm時樣品測定得到的光密度值(OD600)。在不同時間重復測試2次，每次測試都設置2個平行樣?？捎檬?1)計算每個孔細菌生長百分比，其中不同的A值為酶標儀測得的對應OD600讀數(shù)值：

(1)

把計算好的數(shù)據(jù)繪制成折線圖，MIC為待測樣品抑制細菌生長的最低濃度。

2.4.3 最低殺菌濃度測試

LB瓊脂培養(yǎng)基的配制：依次稱量2.5 g酵母提取物、7.5 g瓊脂、5.0 g胰蛋白胨和5.0 g NaCl，加入500 mL去離子水混合均勻，在高壓滅菌鍋中110 ℃滅菌15 min。LB固體培養(yǎng)皿的制備：當LB瓊脂培養(yǎng)基冷卻到70 ℃后，向直徑為150 mm的培養(yǎng)皿中倒入LB瓊脂培養(yǎng)基(約28 mL)，輕微晃動使液體鋪滿整個培養(yǎng)皿。自然冷卻后，蓋上培養(yǎng)皿蓋子并倒置，使用紫外滅菌30 min，最后密封保存。

細菌的MBC測試在完成MIC測試后進行。MIC測試結束后，從測試過MIC的96孔板的每個孔中取出2.5 μL菌液滴到LB瓊脂固體培養(yǎng)皿內，于37 ℃的霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大于12 h，MBC為可殺死大于99.9%細菌的最低聚合物或抗菌劑濃度。

2.4.4 溶血測試

TBS緩沖液的配制：稱取0.605 g三羥甲基氨基甲烷，4.385 g NaCI，加入500 mL去離子水，在高壓滅菌鍋中120 ℃滅菌15 min，所配置TBS緩沖液的pH值為7.2。Triton X-100溶液的配制：稱量51.2 mg Triton X-100置于20 mL離心管內，加入16 mL TBS緩沖液，震蕩混合均勻后，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將新鮮的人體血液按1∶19的體積比分散于pH值為7.2的TBS緩沖液中并離心清洗3次(4000 r/min，3 min)，最后用TBS緩沖液稀釋人血紅細胞得到體積分數(shù)為5%的人血紅細胞懸浮液。采用TBS緩沖液將待測聚合物配置成4 mg/mL的溶液，之后在96孔板中用TBS緩沖液將聚合物溶液按2倍率逐級稀釋，得到的聚合物濃度為15.6～2000 μg/mL。在同一平板上，將含有50 μL體積分數(shù)為0.1%的Triton X-100溶液和50 μL人血紅細胞體積分數(shù)為5%的人血紅細胞懸浮液的混合液作為陽性對照，將100 μL人血紅細胞體積分數(shù)為2.5%的人血紅細胞懸浮液作為陰性對照。向每個孔中加入50 μL稀釋好的血紅細胞懸浮液，全部加入后輕微搖晃10 s后，置于37 ℃霉菌培養(yǎng)箱中孵育1 h。將96孔板以3600 r/min轉速離心5 min后，從每個孔中取80 μL上清液平行轉移至新的96孔板中，轉移后若出現(xiàn)氣泡需用牙簽沾取異辛醇戳破，然后用酶標儀讀取每個孔的OD405值。采用式(2)計算每個孔中聚合物的溶血百分比：

(2)

把計算好的數(shù)據(jù)繪制成折線圖，HC50即為導致50%的人血紅細胞不裂解的最高濃度，HC10則為導致10%的人血紅細胞不裂解的最高濃度。每次測試設置2組平行樣，且在不同的時間重復測試3次。

3 結果與討論

3.1 N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物的表征

以Sc(OTf)3為引發(fā)劑、Me2NMeOx為單體，合成了一系列側鏈為N,N-二甲基的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物H-(Me2NMeOx)n-Pip，聚合物的GPC圖譜如圖5所示，表征數(shù)據(jù)如表1所示。3種噁唑啉聚合物的聚合物分散性指數(shù)在1.05～1.13之間。當引發(fā)劑和單體的物質的量比在1∶10和1∶20時，噁唑啉聚合物的Mn按照理論值成倍增加，增長趨勢明顯，符合規(guī)律。當引發(fā)劑和單體的物質的量比為1∶40時，噁唑啉聚合物的Mn和Mw增加不明顯，通過后期分析發(fā)現(xiàn)大量單體沒有參與聚合，仍以單體的形式留在反應體系內，且延長反應時間或提高反應溫度后情況依舊，說明應用于此反應體系單體的聚合度極限為18左右。季銨鹽化的N,N-二甲基-2-聚合物通過NMR進行表征，發(fā)現(xiàn)NMR表征的聚合物聚合度與GPC表征的聚合度基本一致。

表1 N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物的凝膠滲透色譜表征數(shù)據(jù)

3.2 季銨鹽化的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物的抗菌活性

3.2.1 季銨鹽化的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物對表皮葡萄球菌的最低抑菌濃度

季銨鹽化的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物對表皮葡萄球菌的MIC如表2所示，其中表皮葡萄球菌S.eATCC49134為標準菌株，表皮葡萄球菌S.e0692為多重耐藥菌。由表2可知，季銨鹽化的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物烷基鏈的增長有利于增強化合物的抗菌活性，聚合度較大的季銨鹽化的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物抗菌活性也較好。季銨鹽化的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物對于標準菌株和多重耐藥菌都表現(xiàn)出了一定的抗菌活性。其中優(yōu)選化合物H-(OctylMe2NMeOx)18-Pip對多重耐藥的表皮葡萄球菌S.e0692的MIC效果最好，為12.5 μg/mL，優(yōu)于對標準菌株S.eATCC49134的抗菌活性(MIC：50 μg/mL)，顯示了該化合物在多重耐藥菌抗菌方面的潛力。

表2 季銨鹽化的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物對表皮葡萄球菌的最低抑菌濃度

3.2.2 季銨鹽化的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物優(yōu)選化合物對表皮葡萄球菌的最低殺菌濃度

依據(jù)之前MIC測試結果，優(yōu)選了3種活性最好的化合物H-(DecylMe2NMeOx)10-Pip、H-(OctylMe2NMeOx)18-Pip和H-(DecylMe2NMeOx)18-Pip對表皮葡萄球菌的2個不同菌株進行了MBC測試，結果如圖6所示。圖中季銨鹽化的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物的濃度從下至上逐漸提高，依次為1.56，3.13，6.25，12.5，25和50 μg/mL。從左至右依次為H-(DecylMe2NMeOx)10-Pip對S.eATCC49134、H-(DecylMe2NMeOx)10-Pip對S.e0692、H-(OctylMe2NMeOx)18-Pip對S.eATCC49134、H-(OctylMe2NMeOx)18-Pip對S.e0692、H-(DecylMe2NMeOx)18-Pip對S.eATCC49134以及H-(DecylMe2NMeOx)18-Pip對S.e0692的MBC測試結果。測試結果表明，季銨鹽化的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物對各所測菌株的MBC和MIC基本一致，說明該類化合物的主要抗菌機理是殺死細菌而不僅僅是抑制細菌生長。

圖6 季銨鹽化的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物優(yōu)選化合物對表皮葡萄球菌S.e ATCC49134和S.e 0692的最低殺菌濃度測試結果

3.3 季銨鹽化的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物的溶血毒性

溶血毒性是評價生物材料生物相容性的重要指標，溶血毒性強的生物材料應用范圍將受到大大限制，高溶血毒性將限制抗菌劑直接用于全身給藥。季銨鹽化的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物的溶血毒性測試結果如表3所示?？傮w來說，測試所用的季銨鹽化的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物對人血紅細胞的毒性較低。對于所有被測季銨鹽化的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物而言，HC10均高于2000 μg/mL。其中化合物H-(OctylMe2NMeOx)18-Pip對多重耐藥的表皮葡萄球菌S.e0692的HC10值是其MIC和MBC值的160倍，顯示出優(yōu)異的選擇性。

表3 季銨鹽化的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物的半數(shù)溶血濃度和10%溶血濃度測試

4 結 論

本文設計、合成了一系列側鏈不同的季銨鹽化N,N-二甲基-2-取代噁唑啉聚合物，并針對表皮葡萄球菌進行了抗菌測試以及生物相容性評價。實驗結果表明，此類聚合物對于表皮葡萄球菌具有較好的抗菌活性，而對人體血紅細胞的溶血率較低。其中季銨鹽化的N,N-二甲基-2-噁唑啉聚合物H-(OctylMe2NMeOx)18-Pip對于多重耐藥的表皮葡萄球菌S.e0692的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度均為12.5 μg/mL，且其導致10%的人血紅細胞不裂解的最高濃度大于2000 μg/mL，表現(xiàn)出良好的選擇性。