A25Δ43K OMP 基因缺失株和親本株對壞死桿菌生物被膜和耐藥性影響的比較與分析

蔣凱，趙鵬宇，賀顯晶，郭東華

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319）

壞死桿菌（Fusobacterium necrophorum，F(xiàn).necrophorum）是一種無鞭毛、無芽孢、嚴(yán)格厭氧的革蘭陰性細(xì)菌，多以長桿狀存在于自然界中[1]。壞死桿菌感染動物可造成反芻動物腐蹄病、犢牛白喉、牛肝膿腫、奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎等疾病，并在宿主體內(nèi)長期存在造成持續(xù)性感染[2-4]。壞死桿菌感染對肉牛和奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

多種證據(jù)表明，持續(xù)的微生物感染多是以生物被膜（Biofilm）形式存在的細(xì)菌所引起的[5]。生物被膜是細(xì)菌的一種特殊存在形式，由細(xì)菌和自身產(chǎn)生的胞外多糖、胞外DNA 和胞外蛋白共同組成，常附著在生物或非生物載體表面[6]。生物被膜的存在為細(xì)菌生長提供穩(wěn)定的環(huán)境，使細(xì)菌免受干燥、免疫系統(tǒng)攻擊、原生動物攝取和抗菌劑等環(huán)境壓力的影響[7]。生物被膜的形成主要包括細(xì)菌不可逆的表面黏附、細(xì)菌增殖與胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和細(xì)菌的分離三個連續(xù)階段[8]。細(xì)菌的黏附因子在生物被膜形成過程中起著重要作用[9]。對具核梭桿菌使用黏附素RadD 血清孵育后，顯著減弱了生物被膜的形成[10]。使用外膜蛋白FomA疫苗接種后，顯著降低了口腔生物被膜的形成[11]。

43K OMP 是壞死桿菌的一個重要外膜蛋白，由Sun 等[12]首次在壞死桿菌中鑒定發(fā)現(xiàn)。隨后的研究顯示43K OMP 與壞死桿菌黏附宿主細(xì)胞的能力有關(guān)，是壞死桿菌重要的黏附因子之一[13-15]。43K OMP 在壞死桿菌生物被膜形成過程中是否發(fā)揮作用，尚未有人研究。因此，通過對壞死桿菌親本株A25 和缺失株A25Δ43K OMP 生物被膜成熟時間、生物被膜不可逆附著階段菌量、生物被膜形態(tài)和對臨床常見藥物耐藥性進(jìn)行研究，確定43K OMP 基因與生物被膜形成特性的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 菌株

壞死桿菌親本株A25 株購自美國ATCC（Fusobacterium necrophorum，F(xiàn)nn亞種，ATCC 25286），壞死桿菌43K OMP 基因缺失株（A25Δ43K OMP）由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)獸醫(yī)分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.2 主要試劑儀器

主要試劑：苛養(yǎng)厭氧菌肉湯培養(yǎng)基（FAB）和腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（BHI）購自山東托普生物工程有限公司；瓊脂購自廣州賽國生物科技有限公司；結(jié)晶紫、碘化丙啶（PI）和熒光素-伴刀豆凝集素標(biāo)記物（ConA-FITC）購自上海Sigma-Aldrich 貿(mào)易有限公司；甲砜霉素、氨芐青霉素、紅霉素、諾氟沙星、鹽酸林可霉素、四環(huán)素、磺胺嘧啶、慶大霉素、卡那霉素、安普霉素和氯霉素購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

主要儀器：厭氧培養(yǎng)箱（YQX-Ⅱ）購自上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；分光光度計(jì)（T6 新悅）購自北京普析通用儀器有限公司；酶標(biāo)儀（Infinite 200 PRO）購自瑞士TECAN 公司；熒光顯微鏡（INTENSILIGHT C-HGFI）購自株式會社尼康。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)

取出存放于-80 ℃冰箱的壞死桿菌A25 與A25Δ43K OMP 菌液，用接菌環(huán)蘸取菌液于FAB 固體平板劃線，在37 ℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種于5 mL FAB 培養(yǎng)基試管中（缺失株培養(yǎng)基中加入甲砜霉素），37 ℃厭氧培養(yǎng)，連續(xù)傳菌至3 代后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 生物被膜測定

取無菌12 孔板，每孔加入2 mL 制備好的菌液（OD600nm=0.01），陰性對照為BHI 培養(yǎng)基，每組重復(fù)4 孔。37 ℃厭氧培養(yǎng)后，移除孔內(nèi)液體，用無菌PBS溶液洗3 次；每孔加入1 mL 甲醇固定15 min，無菌PBS 溶液洗3 次；待孔內(nèi)干燥后，每孔加入1 mL 結(jié)晶紫溶液染色5 min，無菌PBS 溶液洗3 次；待自然干燥后，每孔加入1 mL 95%乙醇溶液，靜置30 min后用酶標(biāo)儀測OD570nm值。

1.3.3 生物被膜成熟時間測定

取無菌12 孔板，每孔加入2 mL 制備好的菌液（OD600nm=0.01），陰性對照為BHI 培養(yǎng)基，每組重復(fù)4 孔。37 ℃厭氧培養(yǎng)，每24 h 更換BHI 培養(yǎng)基。分別在接種0.5、1、2、3、4 和5 d 用無菌PBS 溶液洗去浮游細(xì)菌，根據(jù)1.3.2 節(jié)方法進(jìn)行結(jié)晶紫染色并測量OD570nm值，根據(jù)OD570nm值繪制生物被膜生長曲線。

1.3.4 不可逆附著菌量計(jì)數(shù)

取無菌12 孔板，每孔加入2 mL 制備好的菌液（OD600nm=0.01），陰性對照為BHI 培養(yǎng)基，每組重復(fù)4 孔。37 ℃厭氧培養(yǎng)，每24 h 更換BHI 培養(yǎng)基。分別在接種6、12、18 和24 h 用無菌PBS 溶液洗去浮游細(xì)菌，每孔加入1 mL 2%戊二醛固定1.5 h，無菌PBS溶液洗3 次；每孔加入1 mL PI 避光染色15 min，無菌PBS 溶液沖洗3 次，加入1 mL 40%甘油封頂后，通過熒光顯微鏡觀察并隨機(jī)選取3 個視野進(jìn)行拍照，對每個視野隨機(jī)選取3 個200 μm2區(qū)域進(jìn)行菌量計(jì)數(shù)。

1.3.5 生物被膜形態(tài)觀察

取無菌12 孔板，每孔加入2 mL 制備好的菌液（OD600nm=0.01），陰性對照為BHI 培養(yǎng)基，每組重復(fù)4 孔。37 ℃厭氧培養(yǎng)，每24 h 更換BHI 培養(yǎng)基。分別在接種2、3 和4 d 用無菌PBS 溶液洗去浮游細(xì)菌，每孔加入1 mL 2%戊二醛固定1.5 h，無菌PBS 溶液洗3 次；每孔加入1 mL ConA-FITC 避光染色30 min，無菌PBS 溶液沖洗3 次；每孔加入1 mL PI 避光染色15 min，無菌PBS 溶液沖洗3 次，加入1 mL 40%甘油封頂后，通過熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.6 耐藥性檢測

根據(jù)CLSI 標(biāo)準(zhǔn)，通過肉湯微量稀釋法檢測壞死桿菌對10 種抗生素的最小抑菌濃度（MIC）。取無菌96 孔板，前10 列作為試驗(yàn)組，第11 列作為陽性對照，第12 列作為陰性對照。將待測藥物配制為256 μg·mL-1，加入第一孔，用BHI 培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋。試驗(yàn)組及陽性對照組每孔加入100 μL 壞死桿菌菌液（OD600nm=0.01），陰性對照組加入等體積BHI 培養(yǎng)基，每組4 個重復(fù)。37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h 后，觀察細(xì)菌生長情況并記錄結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 生物被膜成熟時間

為研究43K OMP 基因缺失對壞死桿菌生物被膜成熟時間是否產(chǎn)生影響，對接種親本株A25 和缺失株A25Δ43K OMP 所產(chǎn)生的生物被膜進(jìn)行結(jié)晶紫染色，測定OD570nm值。結(jié)果如圖1 所示，親本株A25與缺失株A25Δ43K OMP 生物被膜形成時間無顯著差異，接種1 d 生物被膜無顯著增長現(xiàn)象，接種2 d開始形成生物被膜，接種4 d 生物被膜成熟。壞死桿菌缺失43K OMP 基因后，壞死桿菌成熟生物被膜含量顯著升高。由此可見，43K OMP 基因缺失不影響壞死桿菌生物被膜成熟時間，但對生物被膜含量造成影響。

圖1 生物被膜成熟時間測定Fig.1 Determination of maturation time of biofilm

2.2 生物被膜不可逆附著菌量

為研究缺失43K OMP 基因?qū)ι锉荒げ豢赡娓街A段細(xì)菌附著數(shù)量的影響，根據(jù)生物被膜成熟時間選定接種24 h 以內(nèi)為不可逆附著階段，對接種6、12、18 和24 h 生物被膜進(jìn)行PI 染色，熒光染料PI特異性與細(xì)菌DNA 進(jìn)行結(jié)合發(fā)出紅色熒光，通過熒光顯微鏡對200 μm2內(nèi)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果如表1和圖2 所示。在接種6～18 h，親本株A25 與缺失株A25Δ43K OMP 含量均無顯著差異，接種24 h，缺失株A25Δ43K OMP 細(xì)菌含量顯著下降。結(jié)果表明：缺失43K OMP 基因?qū)乃罈U菌生物被膜形成早期的不可逆附著階段有一定影響。

表1 生物被膜不可逆附著階段細(xì)菌含量Table 1 Bacterial content in the irreversible attachment stage of biofilm

圖2 生物被膜不可逆附著階段細(xì)菌含量Fig.2 Bacterial content in the irreversible attachment stage of biofilm

2.3 生物被膜形態(tài)

為研究43K OMP 基因缺失對壞死桿菌生物被膜形態(tài)是否產(chǎn)生影響，用熒光染料ConA-FITC 特異性結(jié)合生物被膜內(nèi)胞外多糖并發(fā)出綠色熒光，用熒光染料PI 復(fù)染特異性結(jié)合生物被膜內(nèi)細(xì)菌DNA 分子并發(fā)出紅色熒光，在熒光顯微鏡下觀察壞死桿菌親本株A25 和缺失株A25Δ43K OMP 的生物被膜形態(tài)。結(jié)果如圖3 所示，壞死桿菌親本株A25 和缺失株A25Δ43K OMP 均檢測到生物被膜的形成。親本株A25 接種3 d 出現(xiàn)聚集性小菌落；缺失株A25Δ43K OMP 接種2 d 出現(xiàn)聚集性菌落，接種4 d 出現(xiàn)溝壑狀結(jié)構(gòu)。43K OMP 基因的缺失對壞死桿菌生物被膜形態(tài)未產(chǎn)生影響，但對生物被膜菌落形成時間產(chǎn)生影響。

圖3 生物被膜的熒光顯微鏡圖像（200×）Fig.3 Fluorescence microscope image of biofilm（200×）

2.4 最小抑菌濃度（MIC）檢測

為研究43K OMP 基因缺失對壞死桿菌耐藥性的變化，檢測親本株A25 和缺失株A25Δ43K OMP對10 種抗菌藥的MIC 值。結(jié)果如表2 所示，缺失43K OMP 基因后，壞死桿菌對磺胺嘧啶、慶大霉素、卡那霉素和安普霉素的耐藥性減弱。結(jié)果表明，缺失43K OMP 基因?qū)乃罈U菌耐藥性產(chǎn)生影響。

表2 親本株A25 和缺失株A25Δ43K OMP 對10 種抗菌藥的MICTable 2 MIC of A25 and A25Δ43K OMP against 10 antibiotics

3 討論

檢測生物被膜的方法有很多種，主要包括剛果紅瓊脂培養(yǎng)基法、結(jié)晶紫染色法、掃描電子顯微鏡法、激光共聚焦掃描顯微鏡法、質(zhì)譜分析和PCR 檢測法[16]。研究采用結(jié)晶紫染色法對壞死桿菌生物被膜進(jìn)行定量研究。結(jié)果顯示，壞死桿菌親本株A25 和缺失株A25Δ43K OMP 接種2 d 開始形成生物被膜，接種4 d 生物被膜含量不再增加，生物被膜成熟。缺失株A25Δ43K OMP 所產(chǎn)生的生物被膜含量顯著高于親本株A25 所產(chǎn)生的生物被膜含量。由此可見，43K OMP 基因在壞死桿菌生物被膜形成過程中起到一定作用。在坂崎腸桿菌（Cronobacter sakazakii）的研究中，坂崎腸桿菌在NaCl 脅迫下缺失外膜蛋白OmpW的菌株形成的生物被膜含量顯著高于親本株，這可能是缺失突變株通過促進(jìn)生物被膜的形成來適應(yīng)NaCl 脅迫[17]。43K OMP 基因的缺失導(dǎo)致壞死桿菌對外界環(huán)境感知降低，從而增強(qiáng)生物被膜形成促進(jìn)自身存活。

壞死桿菌43K OMP 由Sun 等[12-13，18]首次發(fā)現(xiàn)，在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)其能夠介導(dǎo)壞死桿菌黏附宿主細(xì)胞。利用重組43K OMP 制備的血清與壞死桿菌共孵育后可抑制壞死桿菌與倉鼠腎細(xì)胞（BHK）細(xì)胞的結(jié)合[14，19]。2022 年He 等[15]研究發(fā)現(xiàn)43K OMP 可與纖連蛋白結(jié)合介導(dǎo)壞死桿菌與BHK 細(xì)胞黏附。43K OMP是壞死桿菌重要的黏附因子之一。在生物被膜形成初期，細(xì)菌的黏附因子在不可逆附著階段起重要作用。在艱難梭菌生物被膜研究中，其表面蛋白及大分子如鞭毛、Ⅳ型菌毛和S 層均參與生物被膜的形成[20]。在糞腸球菌黏附素ace 基因的研究中，存在ace基因的腸球菌生物被膜平均厚度、細(xì)菌密度及活菌比例均高于無ace 基因的腸球菌[21]。43K OMP 基因的缺失導(dǎo)致接種24 h 壞死桿菌生物被膜含菌量顯著降低，這說明43K OMP 基因?qū)ι锉荒ば纬删哂幸欢ㄓ绊憽?/p>

生物被膜的結(jié)構(gòu)形態(tài)與細(xì)菌的菌種相關(guān)，小菌落是大多數(shù)生物被膜的基本單位，但是其結(jié)構(gòu)因細(xì)菌種類而差異巨大。在流動培養(yǎng)室相同條件下培養(yǎng)，惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）形成松散突出的小菌落，而假單胞菌（Pseudomonas knackmussii）則形成球形小菌落[22]。此外，當(dāng)兩種假單胞菌在生物膜中一起生長時，其菌落特征互不影響[22]。生物被膜形態(tài)結(jié)構(gòu)不僅與細(xì)菌種類有關(guān)，也與細(xì)菌所處的環(huán)境有關(guān)。Klausen 等[23]證明當(dāng)銅綠假單胞菌用葡萄糖培養(yǎng)基培育時，所形成的生物被膜則為蘑菇狀的小菌落，而在用檸檬酸鹽培養(yǎng)基培育時，則形成平坦的生物被膜。在研究中，通過熒光顯微鏡觀察壞死桿菌親本株A25 和缺失株A25Δ43K OMP 的生物被膜形態(tài)。結(jié)果顯示親本株A25 和缺失株A25Δ43K OMP 均產(chǎn)生溝壑狀生物被膜，缺失株A25Δ43K OMP 的溝壑結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的更早。生物被膜形成后期，生物被膜內(nèi)形成部分通道，這些通道可輸送營養(yǎng)物質(zhì)和分布氧氣并能去除廢棄產(chǎn)物[24]。43K OMP 基因的缺失使得壞死桿菌更早的出現(xiàn)溝壑結(jié)構(gòu)，43K OMP 基因可能介導(dǎo)壞死桿菌營養(yǎng)輸送。

生物被膜的形成使得細(xì)菌的耐藥性增加，其耐藥性比游離細(xì)菌提高了甚至1 000 倍，給疾病治療帶來了嚴(yán)重的挑戰(zhàn)[25]。研究中，缺失43K OMP 基因使得壞死桿菌對慶大霉素、卡那霉素和安普霉素的耐藥性減弱。該三類藥物均屬于氨基糖苷類藥物，主要用于治療革蘭陰性需氧菌、葡萄球菌和其他革蘭陽性菌引起的感染，革蘭陰性厭氧菌對氨基糖苷類藥物具有一定耐藥性[26]。氨基糖苷類抗生素耐藥主要通過突變16S rRNA、甲基化16S rRNA、改變細(xì)胞膜通透性、外排泵泵出細(xì)胞內(nèi)抗生素和低活性乙酰轉(zhuǎn)移酶螯合抗生素[27]。有研究預(yù)測，壞死桿菌43K OMP 結(jié)構(gòu)更傾向于孔蛋白[28]。那么43K OMP 在壞死桿菌外膜上是否調(diào)控細(xì)胞膜的通透性直接影響到壞死桿菌對營養(yǎng)攝取、胞外基質(zhì)酶排出和藥物排出等功能，43K OMP 是否作為外排泵使得壞死桿菌對氨基糖苷類藥物產(chǎn)生耐藥，還需進(jìn)一步研究，對43K OMP 結(jié)構(gòu)的揭示將有助于對43K OMP 功能的研究。因此，壞死桿菌43K OMP 基因缺失促進(jìn)壞死桿菌生物被膜的形成，抑制壞死桿菌對氨基糖苷類藥物的耐藥。