畜禽糞便有機(jī)肥對(duì)黑土農(nóng)田土壤抗生素抗性基因的影響

姚欽，朱玥晗，宋潔，郭永霞，2，王光華

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北平原農(nóng)業(yè)綠色低碳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所）

東北黑土是我國(guó)重要的土壤資源，在維持國(guó)家糧食安全和生態(tài)安全上具有重要的地位。近年來(lái)由于生產(chǎn)過(guò)程中過(guò)度的開(kāi)發(fā)和粗放的管理，導(dǎo)致土壤肥力下降，黑土退化日益嚴(yán)重[1-2]。目前，普遍公認(rèn)有機(jī)肥添加能夠有效提高黑土土壤肥力，改善黑土土壤理化性質(zhì)[3-6]。然而，施用有機(jī)肥也會(huì)帶來(lái)一些負(fù)面效應(yīng)，其中之一就是在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中抗生素的定期使用，直接導(dǎo)致畜禽糞便中蘊(yùn)藏了大量的抗性細(xì)菌和抗性基因[7-8]，從而最大程度驅(qū)動(dòng)了農(nóng)業(yè)土壤中抗性基因的積累[9]。由于抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）具有較高的移動(dòng)性，它們能通過(guò)食物鏈的傳遞到達(dá)人類餐桌，進(jìn)入人類體內(nèi)，威脅人類身體健康，已被世界衛(wèi)生組織列為21 世紀(jì)威脅公共健康的最重大挑戰(zhàn)之一[10-11]。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)生態(tài)環(huán)境中抗生素抗性基因的積累和傳播已經(jīng)開(kāi)展了廣泛研究。

目前，在國(guó)際抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)（Antibiotic Resistance Genes Database，ARDB） 中已經(jīng)包含了13 293 個(gè)基因、933 個(gè)物種和124 個(gè)屬的耐藥信息，其中常見(jiàn)的抗生素抗性基因主要有四環(huán)素類（tetracycline）、β-內(nèi)酰胺類（beta Lactam）、喹諾酮類（FCA）、大環(huán)內(nèi)酯類（MLSB）、磺胺類（sulfonamide）和整合子類（Integrin-integrase）6 大類[12]。研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類是畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中治療疾病和促進(jìn)生長(zhǎng)普遍常用的抗生素，磺胺類和β-內(nèi)酰胺類等其他抗生素在家禽、生豬和生牛養(yǎng)殖中也會(huì)大量使用，造成了畜禽糞便中不同種類的抗性基因污染[13]。另外，由于不同種類畜禽（如豬、雞、牛）的生理生活特性和養(yǎng)殖習(xí)慣不同，導(dǎo)致使用的抗生素種類、頻次及用量不同，使不同畜禽糞便中抗生素抗性基因多樣性和豐度存在著顯著差異[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，雞糞和豬糞中的抗生素種類和豐度遠(yuǎn)高于牛糞，主要是因?yàn)槲覈?guó)生產(chǎn)生活對(duì)雞肉和豬肉的需求量較高，使得家禽和生豬的養(yǎng)殖密度大且銷售期短，抗生素使用量較高，同時(shí)消化功能弱于生牛，導(dǎo)致家禽和生豬糞便中抗生素的殘留量較高，造成ARGs 污染程度較高[13，15]。所以，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有必要探討分析不同種類畜禽糞便有機(jī)肥施用后農(nóng)田土壤中抗生素抗性基因種類及豐度差異，可以為評(píng)價(jià)畜禽糞便的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供參考。

因此，作為農(nóng)業(yè)大省和畜牧業(yè)大省的黑龍江省，在關(guān)注黑土農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中施用禽畜糞便有機(jī)肥提高土壤肥力和改善黑土退化問(wèn)題的同時(shí)，由其帶來(lái)的抗生素抗性基因潛在危險(xiǎn)以及對(duì)農(nóng)產(chǎn)品和人類健康的威脅也不容忽視。為明確有機(jī)肥施用對(duì)黑土農(nóng)田ARGs 的影響，研究通過(guò)熒光定量分析不同畜禽糞便有機(jī)肥對(duì)黑土農(nóng)田土壤中AGRs 數(shù)量、種類和豐度的影響程度，以期為黑土農(nóng)田退化管理和土壤肥力提升，以及減緩AGRs 在農(nóng)黑土農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中積累策略提供理論依據(jù)，為黑土農(nóng)田生產(chǎn)中有機(jī)肥的施用提供指導(dǎo)建議。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤樣品采集自黑龍江省哈爾濱市雙城區(qū)，該區(qū)域?qū)儆谥袦貛Т箨懶约撅L(fēng)氣候，年平均氣溫4.4 ℃，年均降水量481 mm，土壤類型為典型黑土。

玉米收獲期選擇長(zhǎng)期施用（5 年以上）有機(jī)肥的農(nóng)田土壤，分別采集不同類型有機(jī)肥（牛糞N、豬糞Z和雞糞J）施用土壤樣品，同時(shí)采集施用無(wú)機(jī)肥農(nóng)田土壤作為對(duì)照（CF）。土樣采集深度為0～20 cm，隨機(jī)多點(diǎn)采集玉米根圍土后混勻作為一個(gè)重復(fù)樣品，每個(gè)樣地采集3 次重復(fù)，共12 個(gè)土壤樣品。所有樣品現(xiàn)場(chǎng)采集后過(guò)2 mm 土壤篩，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室用于DNA 提取。

1.2 樣品DNA 提取

準(zhǔn)確稱取0.5 g 土壤樣品，采用Fast DNARSpin Kit for Soil（MP Biomedicals，美國(guó)）試劑盒，按照操作說(shuō)明提取農(nóng)田土壤總DNA。提取完成后總DNA 用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)提取結(jié)果，并使用NanoDrop 2000核酸分析儀（Thermo Scientific，美國(guó)）測(cè)定濃度及純度。最后，DNA 保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 抗生素抗性基因定性檢測(cè)

研究選擇了6 類34 種抗生素抗性基因（ARGs），包括15 種四環(huán)素類（tetracycline）抗性基因tetA、tetB1、tetB2、tetC、tetG1、tetG2、tetL1、tetL2、tetM、tetO、tetQ、tetT、tetW、tetX1、tetX2，3 種磺胺類（sulfonamide）抗性基因sul1、sul2、sul3，4 種整合子類（Integrin-integrase）抗性基因intl1、intl2、intl3、intl4，4 種大環(huán)內(nèi)脂類（MLSB） 抗性基因ermB、ermC、ermE、ermF，5 種β-內(nèi)酰胺類（beta Lactam）抗性基因blaOXA-F、blaTEM、blaCTX-M、blaSHV、blaNDM，3 種喹諾酮類（FCA）抗性基因qnrA、qnrB、qnrS。利用各抗性基因常用引物進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增[16]，定性檢測(cè)不同糞便有機(jī)肥施用土壤中不同抗生素抗性基因分布情況。

1.4 抗生素抗性基因定量檢測(cè)

在普通PCR 定性檢測(cè)結(jié)果基礎(chǔ)上，以細(xì)菌16S rRNA 基因作為參照標(biāo)記基因，在LightCycler 480 平臺(tái)（Roche Applied Science，瑞士）進(jìn)行ARGs 熒光定量檢測(cè)。20 μL 反應(yīng)體系包含10 μL SYBR Premix Ex TaqTM，7 μL ddH2O，1 μL 土壤總DNA，上下游引物各1 μL。每個(gè)樣本3 次重復(fù)，反應(yīng)基本程序?yàn)椋撼踝冃?5 ℃30 秒；變性95 ℃5 秒，退火延伸60 ℃30 秒，共40 個(gè)循環(huán)；最后冷卻50 ℃30 秒。根據(jù)所得數(shù)據(jù)對(duì)ARGs 進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)分析。

相對(duì)定量的統(tǒng)計(jì)方法如下[12]：

公式中，ARGs 是所要測(cè)定的34 種抗生素抗性基因，16S 是指待測(cè)樣品的16S rRNA 基因，CT 是熒光定量所測(cè)定的循環(huán)閾值，△CT是某樣品的目標(biāo)基因CT值與16S rRNA 基因CT值的差值，△△CT是指待測(cè)（test）樣品的目標(biāo)基因△CT值與對(duì)照（control）樣品的△CT值的差值，F(xiàn)C 值是指待測(cè)樣品的目的基因相對(duì)于對(duì)照樣品的富集倍數(shù)，獲得的數(shù)據(jù)用于后續(xù)不同處理間抗性基因分布特征分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

結(jié)合抗性基因定性檢測(cè)和定量檢測(cè)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)不同畜禽糞便有機(jī)肥施用的土壤中不同類型抗生素抗性基因檢出個(gè)數(shù)、不同抗性機(jī)制的檢出比例以及不同種類抗性基因的檢出情況，并采用Excel 2016和SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)前期處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；采用R 語(yǔ)言v 3.3.1 vegan 數(shù)據(jù)包和heatmap 數(shù)據(jù)包分別進(jìn)行不同有機(jī)肥處理下不同種類抗生素抗性基因分布的PCA 分析和熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 施用不同有機(jī)肥對(duì)抗性基因抗性機(jī)制和種類的影響

以不同有機(jī)肥施用土壤中提取的DNA 作為模板，分別擴(kuò)增四環(huán)素類（tetracycline）、β-內(nèi)酰胺類（beta Lactam）、喹諾酮類（FCA）、大環(huán)內(nèi)酯類（MLSB）、磺胺類（sulfonamide）、整合子類（Integrinintegrase）6 大類34 種抗性基因，施用雞糞、豬糞、牛糞不同糞便有機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥的土壤中分別檢測(cè)到9、10、5 和9 種抗生素抗性基因。

所有土壤樣品中檢測(cè)到了4 種抗性機(jī)制的抗性基因，包括轉(zhuǎn)座子移動(dòng)原件（transposon）、細(xì)胞核糖體保護(hù)（protection）、抗生素失活（deactivate）和抗生素外排泵（efflux），各自檢出個(gè)數(shù)占總檢出個(gè)數(shù)的比例分別為13.33%、73.33%、6.67%和6.67%（圖1 A）。由此表明，細(xì)胞核糖體保護(hù)為4 種不同施肥措施土壤中ARGs 的主要抗性機(jī)制，其次轉(zhuǎn)座子移動(dòng)原件，最后是抗生素失活和抗生素外排泵。將不同種類有機(jī)肥施用的土壤中抗生素抗性基因檢出結(jié)果按抗性基因種類分析看出（圖1 B），四環(huán)素類（tetracycline）、磺胺類（sulfonamide）、大環(huán)內(nèi)酯類（MLSB）、β-內(nèi)酰胺類（beat Lactam）分別占總檢出個(gè)數(shù)的50%、11.54%、15.38%和11.54%，其中檢出種類最多的為四環(huán)素類，其次為大環(huán)內(nèi)酯類。喹諾酮類（FCA）和整合子類（Integrin-integrase）檢出比例較小，合并記為other efflux，檢出比例合計(jì)11.54%。

圖1 不同抗性機(jī)制抗性基因檢出比例（A）和不同種類抗性基因檢出比例（B）Fig.1 Proportion of resistance genes with different resistance mechanisms（A）and different types of resistance genes（B）

各類抗性基因所占百分比如圖2 所示，在檢測(cè)的6 大類抗性基因中，施加不同類型糞便有機(jī)肥土壤中均檢測(cè)到四環(huán)素類、磺胺類以及遺傳元件類的抗生素抗性基因。其中，各個(gè)處理中四環(huán)素類（tetracycline）抗生素抗性基因檢出比例均為最高，高達(dá)55.6%以上。施加豬糞Z、牛糞N 與無(wú)機(jī)肥CF 土壤抗性基因的分布類型基本沒(méi)有區(qū)別，而施加雞糞的土壤中（J）檢測(cè)到了兩大類新的抗生素抗性基因，即大環(huán)內(nèi)酯類（MLSB）和β-內(nèi)酰胺類（beta Lactam），并且比例和磺胺類（sulfonamide）抗性基因基本一致，約11.1%。

圖2 不同類型肥料施用土壤中各類抗性基因檢出比例Fig.2 The proportion of various resistance genes detected in soils applied with different fertilizers

2.2 不同施肥措施下抗生素抗性基因的分布特征

如圖3 所示，施用不同畜禽糞便有機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥土壤的抗生素抗性基因豐度和多樣性均發(fā)生了明顯變化。施加牛糞（N）的土壤中抗性基因類型較少，豐度較低，與施用無(wú)機(jī)肥土壤樣品類似，而施用雞糞（J）和豬糞（Z）土壤中的抗生素抗性基因的種類和豐度顯著增加。其中，施用豬糞有機(jī)肥顯著增加了土壤中β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因blaTEM和四環(huán)素類抗生素抗性基因tetG2豐度，四環(huán)素類抗生素tetG1和tetM豐度增加幅度較小，但也均有別于施用無(wú)機(jī)肥土壤。施用雞糞有機(jī)肥對(duì)土壤中抗生素抗性基因類型和豐度影響最大，尤其是四環(huán)素類抗生素抗性基因tetX1的豐度顯著高于所有土壤樣品中檢測(cè)到的其他抗性基因；其次是整合子類Integrin-integrase抗性基因intl1。并且，由熱圖分析發(fā)現(xiàn)施用雞糞有機(jī)肥土壤中除tetX2外，檢測(cè)到的其他四環(huán)素類抗性基因豐度均較高，如tetC、tetL1、tetG2、tetG1和tetM，說(shuō)明施用雞糞有機(jī)肥的土壤中四環(huán)素類抗生素抗性基因污染嚴(yán)重。而施用雞糞有機(jī)肥土壤中β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因blaTEM豐度較低，與施用豬糞有機(jī)肥結(jié)果相反?？傊?，由抗性基因類型和豐度熱圖的UPGMA cluster 顯示四種不同施肥制度分別形成四個(gè)簇，施用牛糞有機(jī)肥土壤和無(wú)機(jī)肥距離較近，施用雞糞和豬糞的土壤中形成了新的抗生素抗性基因分布格局，明顯區(qū)別于施用牛糞有機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥土壤，說(shuō)明施用不同糞肥有機(jī)肥明顯影響了土壤中抗生素抗性基因分布特征。

圖3 不同類型肥料施用土壤中ARGs 分布熱圖Fig 3 Heatmap of ARGs distribution in soils applied with different fertilizers

2.3 不同施肥措施下抗生素抗性基因的主成分分析

不同畜禽糞便有機(jī)肥施用土壤中抗生素抗性基因主成分分析如圖4 所示，施用豬糞、雞糞、牛糞有機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥四個(gè)處理的土壤樣品分別位于四個(gè)不同的象限，說(shuō)明施加不同糞便有機(jī)肥顯著改變了土壤中抗生素抗性基因的結(jié)構(gòu)。主成分PC1 和PC2 分別解釋了抗性基因結(jié)構(gòu)變化56.6%和16.9%，施用不同糞便有機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥的土壤樣品各自的3 個(gè)重復(fù)聚集在一起，四個(gè)處理沿橫軸PC1 分為四個(gè)簇，牛糞有機(jī)肥處理與無(wú)機(jī)肥處理距離較近，而施用雞糞有機(jī)肥的樣點(diǎn)獨(dú)成一簇，與其他三個(gè)處理明顯區(qū)分，同樣說(shuō)明抗生素抗性基因在施用豬糞、牛糞、雞糞和無(wú)機(jī)肥土壤中存在不同的結(jié)構(gòu)特征。另外，施加畜禽糞便有機(jī)肥的土壤相對(duì)于施用無(wú)機(jī)肥土壤具有更復(fù)雜的抗生素抗性基因多樣性，施用牛糞有機(jī)肥樣點(diǎn)與四環(huán)素類抗生素抗性基因tetX2結(jié)合緊密，與其他抗性基因距離較遠(yuǎn)；同樣，豬糞有機(jī)肥樣點(diǎn)與β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因blaTEM密切相關(guān)；而施用雞糞有機(jī)肥的土壤樣點(diǎn)與大部分豐度較高的被測(cè)抗性基因緊密結(jié)合，尤其與四環(huán)素類抗生素抗性基因tetX1密切相關(guān)，與上述熱圖結(jié)果基本一致，說(shuō)明農(nóng)業(yè)生產(chǎn)施加禽畜糞便有機(jī)肥顯著改變了環(huán)境土壤中的抗性基因種類組成。

圖4 不同類型肥料施用土壤中ARGs 主成分分析Fig.4 Principal component analysis of ARGs in soils applied with different fertilizers

3 討論

農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，添加有機(jī)肥能夠有效提高土壤有機(jī)質(zhì)含量和土壤微生物多樣性，對(duì)維持農(nóng)田土壤質(zhì)量有著至關(guān)重要的作用[17-18]。然而，畜禽生產(chǎn)中抗生素的使用，增加了對(duì)農(nóng)田土壤環(huán)境中微生物的選擇壓力，導(dǎo)致攜帶抗生素抗性基因的細(xì)菌大量出現(xiàn)[19-20]。因此，作為一種土壤改良措施，畜禽糞便有機(jī)肥在施用的同時(shí)也會(huì)成為ARGs 進(jìn)入到農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的主要媒介之一[7，21]。研究結(jié)果表明，施用有機(jī)肥的黑土農(nóng)田土壤中ARGs 的多樣性和豐度顯著增加，與他人研究結(jié)果較為一致。Zheng 等[9]基于宏基因組學(xué)報(bào)道的全球首張土壤抗生素抗性基因空間與豐度分布圖研究結(jié)果顯示全球農(nóng)業(yè)土壤的ARGs 豐度顯著高于非農(nóng)業(yè)土壤，并且畜禽養(yǎng)殖是最主要的驅(qū)動(dòng)因素。這可能是由于有機(jī)肥的添加，一方面引入大量ARGs 的同時(shí)，也增加了土壤有機(jī)碳的含量，促進(jìn)了土壤中耐藥菌和有機(jī)肥攜帶耐藥菌的生長(zhǎng)繁殖[22]，也有可能是有機(jī)肥中的抗性細(xì)菌遷移定殖到土壤中，抗性基因通過(guò)水平轉(zhuǎn)運(yùn)作用機(jī)制轉(zhuǎn)移到土壤微生物中[23]，導(dǎo)致有機(jī)肥施用后土壤中AGRs 多樣性和豐度的提高。

有機(jī)肥施用土壤中抗生素抗性基因的豐度和多樣性也會(huì)因畜禽種類的不同而存在差異[14]。研究中不同畜禽糞便有機(jī)肥施用形成了不同的抗生素抗性基因分布格局，由AGRs 分布熱圖看出，施用雞糞的土壤中AGRs 豐度和種類高于施用豬糞的土壤樣品，而施用牛糞有機(jī)肥的土壤樣品中抗性基因積累最少。這可能與不同畜禽動(dòng)物的生活習(xí)性和養(yǎng)殖習(xí)慣有關(guān)，一方面，相對(duì)于生牛養(yǎng)殖，雞和豬的養(yǎng)殖密度大，出欄期短，養(yǎng)殖過(guò)程中需要頻繁使用抗生素（如多肽類的桿菌肽鋅、恩拉霉素；多粘菌素類的硫酸粘桿菌素）來(lái)防治疾病和促進(jìn)生長(zhǎng)，導(dǎo)致雞糞和豬糞中抗生素殘留量大，施入土壤中后AGRs 種類多且豐度相對(duì)較高[15，24]。另一方面，生豬和家禽養(yǎng)殖多采用圈養(yǎng)方式，動(dòng)物流動(dòng)性較差，封閉式環(huán)境不利于堆積糞便中抗生素的降解，且它們的消化功能差，導(dǎo)致生豬和家禽糞便有機(jī)肥中抗生素抗性基因積累較多[14]。此外，除了不同糞便有機(jī)肥土壤樣品間抗性基因特征存在差異之外，研究還發(fā)現(xiàn)施用無(wú)機(jī)肥的土壤中也檢測(cè)到一定數(shù)量的抗生素抗性基因，并且AGRs 多樣性分布特征類似于施用牛糞有機(jī)肥土壤樣品，這一結(jié)果與他人研究報(bào)道基本相符。Su 等[25]在未施糞肥和堆肥的水稻土樣品中檢測(cè)到了豐度較低的抗性基因，說(shuō)明土壤本身是一個(gè)豐富的抗性基因儲(chǔ)藏庫(kù)，在未受畜禽糞便污染的土壤環(huán)境中也能檢測(cè)到具有內(nèi)在抗性的抗生素抗性基因。

畜禽養(yǎng)殖業(yè)中四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類和整合子類是主要的抗生素類型。研究發(fā)現(xiàn)所有土壤樣品中均檢測(cè)到高達(dá)55%的四環(huán)素類抗生素抗性基因，并且檢出的抗性基因種類也較多，由熱圖也看出豐度較高且變化明顯的大部分抗性基因?qū)儆谒沫h(huán)素類，這與他人研究結(jié)果一致[26]，主要原因可能是因?yàn)樗沫h(huán)素類抗生素是畜禽養(yǎng)殖業(yè)中使用量最大的一類抗生素，并且它們?nèi)菀妆晃皆谕寥李w粒上造成在土壤中殘留積累。對(duì)于AGRs 的傳播來(lái)說(shuō)，雖然在自然條件下本來(lái)就存在少量的AGRs，但是人類活動(dòng)仍然被認(rèn)識(shí)是AGRs 的主要傳播方式[27]。ARGs 的水平傳播方式下，主要是借助整合子、轉(zhuǎn)座子、基金盒、質(zhì)粒和噬菌體等可移動(dòng)遺傳元件（Mobile genetic elements，MGEs）的水平轉(zhuǎn)移機(jī)制，通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)ARGs 在不同微生物之間的水平傳遞[28-29]。研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)期施用雞糞的農(nóng)田土壤（J）中轉(zhuǎn)座子類（intl1）數(shù)量顯著高于檢測(cè)到的其他抗生素抗性基因（P＜0.05），說(shuō)明長(zhǎng)期施加雞糞可以增加土壤中轉(zhuǎn)座子水平遺傳元件的富集倍數(shù)，容易造成周邊土壤進(jìn)行抗生素抗性基因水平傳播。這種基因的水平傳播，可能對(duì)施用有機(jī)肥后土壤中的抗生素濃度以及對(duì)土壤中耐藥菌的生長(zhǎng)速度和衰亡速度都存在影響[30-31]。同時(shí)，土壤中抗生素抗性基因的水平轉(zhuǎn)移對(duì)于ARGs 在微生物間的傳遞起著重要作用，也是導(dǎo)致農(nóng)田土壤中ARGs 豐度改變的關(guān)鍵因素[32]。

東北黑土區(qū)是我國(guó)重要的糧食生產(chǎn)基地，有機(jī)肥施用是黑土區(qū)土壤肥力提升，緩解黑土退化常用的有效措施。但有機(jī)肥中禽畜糞便是農(nóng)田土壤中抗生素抗性基因的重要來(lái)源，由于其對(duì)抗生素和耐藥菌的引入，給人類和動(dòng)物帶來(lái)的健康安全問(wèn)題不容忽視。研究初步明確了有機(jī)肥施用對(duì)黑土農(nóng)田土壤抗生素抗性基因的影響，雞糞、牛糞和豬糞均能明顯增加土壤中抗生素抗性基因，尤其施用雞糞有機(jī)肥帶來(lái)的污染威脅最嚴(yán)重。今后在黑土農(nóng)田有機(jī)肥施用過(guò)程中，要充分考慮農(nóng)田土壤中施用不同種類有機(jī)肥導(dǎo)致ARGs 積累的影響因素，可以通過(guò)堆肥、日曬或高溫處理等方法降低有機(jī)肥中抗生素和抗性基因的數(shù)量和豐度。未來(lái)針對(duì)黑土農(nóng)田由于有機(jī)肥施用導(dǎo)致的抗生素及ARGs 的影響機(jī)制，以及根據(jù)目前東北黑土農(nóng)田抗生素抗性基因的污染現(xiàn)狀及調(diào)控措施和ARGs 消減技術(shù)的應(yīng)用開(kāi)發(fā)也有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

（1）研究施用不同糞肥的所有土壤中主要的抗性基因?yàn)樗沫h(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類和磺胺類，其中四環(huán)素類檢出率最高（55%以上）。

（2）農(nóng)業(yè)生產(chǎn)施用畜禽糞便有機(jī)肥明顯增加了土壤中抗性基因的種類和豐度，并且顯著改變了土壤中抗生素抗性基因的結(jié)構(gòu)，施用雞糞有機(jī)肥污染風(fēng)險(xiǎn)更大。