木霉菌配施有機(jī)肥對(duì)甜瓜果實(shí)糖及代謝酶活性的影響

李春霞，聶佳慧，陳錢(qián)廣，高佳怡，肖漫，王雨舒，熊亞男，靳亞忠

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)園藝園林學(xué)院，大慶 163319）

甜瓜以含豐富的維生素B、維生素C、胡蘿卜素、檸檬酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和口感甜脆在水果界享譽(yù)盛名，深受廣大消費(fèi)者青睞[1]。在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，設(shè)施甜瓜種植模式單一，農(nóng)藥化肥的大量使用，造成土壤連作障礙與可續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)發(fā)展矛盾突出[2]，導(dǎo)致甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì)明顯下降。有研究表明，有機(jī)肥可以促進(jìn)作物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，改善果實(shí)的品質(zhì)，如蘋(píng)果、檸檬上均有報(bào)道[3-4]。因此，合理配施有機(jī)肥，減少化肥施用量，提高甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì)，緩解土壤連作障礙，已成為設(shè)施甜瓜生產(chǎn)中亟待解決的重要問(wèn)題。

國(guó)內(nèi)外研究表明，適當(dāng)減少氮肥施入量能有效提高番茄、葡萄和辣椒等果蔬產(chǎn)量、可溶性糖和維生素C 含量[5-6]；在減少化肥施用的同時(shí)配施有機(jī)肥可提升園藝作物的品質(zhì)，在冬棗[7]、藍(lán)莓[8]、葡萄[9]、芒果[10]等作物中均有報(bào)道；施用木霉菌會(huì)促進(jìn)植株體內(nèi)物質(zhì)的代謝，提高甜瓜抗性和品質(zhì)[11]。但目前對(duì)有機(jī)肥與木霉菌配施提高甜瓜果實(shí)品質(zhì)的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，研究通過(guò)減施化肥配施有機(jī)肥和木霉菌，以甜瓜生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中糖分積累及蔗糖代謝關(guān)鍵酶活性的動(dòng)態(tài)指標(biāo)變化為依據(jù)，明確減施化肥配施有機(jī)肥和木霉菌對(duì)甜瓜品質(zhì)的影響，也為木霉菌在生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試甜瓜品種：薄皮甜瓜“CH7”（花后28～30 d成熟），為黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)園藝園林學(xué)院設(shè)施課題組提供的自交系。供試常規(guī)肥料：主要有商品有機(jī)肥、商品復(fù)合肥、磷酸二銨和硫酸鉀肥，均來(lái)自黑龍江田力保生物科技有限公司，其中各肥料氮磷鉀含量占比見(jiàn)表1。供試木霉菌：木霉菌菌劑為棘孢木霉菌，有效孢子量≥109CFU·g-1，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)園藝園林學(xué)院和黑龍江田力保生物科技有限公司共同研制而成。供試土壤類(lèi)型為黑鈣土，其基本理化性質(zhì)為：氨態(tài)氮含量為40.88 mg·kg-1，速效磷含量為76 mg·kg-1，速效鉀含量為140 mg·kg-1，pH 值為7.8。

表1 不同供試肥料中氮磷鉀含量占比Table 1 Ration of nitrogen，phosphorus and potassium content in different tested fertilizers

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)中共設(shè)有5 個(gè)處理，以不施肥和常規(guī)施用化學(xué)肥料為對(duì)照組，設(shè)置農(nóng)民常規(guī)施肥、有機(jī)肥全部替代化肥和半量替代化肥，同時(shí)配施木霉菌劑為處理組。各處理肥料施用量見(jiàn)表2。木霉菌施用量為30 kg·hm-2，分別在甜瓜植株定植和甜瓜定果期施用，具體做法是把50 g 木霉菌溶解在25 L 水中，平均施在小區(qū)內(nèi)每個(gè)甜瓜的根部。甜瓜在四葉一心期定植，每個(gè)小區(qū)種植6 行，每行8 株，3 次重復(fù)，小區(qū)面積約為30 m2。甜瓜按期進(jìn)行澆水，整枝打叉，采用吊蔓栽培，子蔓結(jié)瓜，每株保留第8、9、10 節(jié)位的子蔓用于結(jié)瓜。在花后第21（成熟前期）、28（成熟期）和35 d（成熟后期）收集甜瓜果實(shí)，采取果實(shí)赤道部位的果肉，每個(gè)樣品2 g，將果實(shí)樣本用錫箔紙包裝后迅速放入液氮進(jìn)行冷凍，置于-40 ℃冰箱中保存，用于果實(shí)含糖量及代謝相關(guān)酶指標(biāo)的測(cè)定。

表2 各處理肥料施用量Table 2 Fertilizer application amount of different treatments

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 糖含量的測(cè)定

可溶性糖：蔥酮試劑法[12]測(cè)定。取0.5 g 甜瓜果肉放入試管中，加入10 mL 蒸餾水后封口，沸水浴30 min，提取液過(guò)濾后定容至50 mL。吸取l mL 提取液和l mL 蒸餾水于試管中，加入0.5 mL 蒽酮乙酸乙酯試劑和5 mL 濃硫酸，充分振蕩后沸水浴l min 后取出，自然冷卻，以空白作參比，630 nm 測(cè)定吸光度。

果糖、葡萄糖、蔗糖含量的測(cè)定：參照楊樂(lè)[13]的方法。稱(chēng)取2 g 甜瓜果肉于液氮條件下研磨，加入5 mL 80%乙醇溶液，80 ℃水浴30 min，冷卻后3 000 g條件下離心10 min，取上清液定容至50 mL，以備果糖、葡萄糖和蔗糖的測(cè)定，采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定。

1.3.2 酶活性的測(cè)定

取1 g 甜瓜果肉于研缽中，加入少量的石英砂和10 mL HEPES 緩沖液，冰浴研磨成勻漿，4 ℃12 000 g離心20 min，收集上清液。上清液逐漸加硫酸銨至80%溶解度，冰上放置15 min，4 ℃12 000 g 離心30 min，棄上清液，用提取緩沖液3 mL 溶解沉淀，轉(zhuǎn)移到透析袋中，置于4 ℃冰箱中，20 小時(shí)后取出即為酶提取液。果實(shí)糖代謝相關(guān)酶活性的測(cè)定方法〔酸性轉(zhuǎn)化酶（AI），中性轉(zhuǎn)化酶（NI），蔗糖合成酶分解方向酶（SS-d），蔗糖磷酸合成酶（SPS），蔗糖合成酶合成方向酶（SS-s）〕，參照李合生[14]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 23.0（ANOVA）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，利用origin 9.0 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中糖分積累的動(dòng)態(tài)變化

2.1.1 化肥減施與有機(jī)肥及木霉菌劑配施對(duì)甜瓜果實(shí)可溶性糖含量的影響

由圖1 可以看出，隨著甜瓜果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育，果實(shí)中可溶性糖含量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，且在同一時(shí)期，各處理的甜瓜果實(shí)可溶性糖含量之間存在明顯差異。在甜瓜果實(shí)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期，各處理的甜瓜果實(shí)可溶性糖含量顯著高于CK（P＜0.05），而化肥減施與有機(jī)肥及木霉菌劑配施處理的甜瓜果實(shí)可溶性糖含量則顯著高于CK1 處理，且T3 處理甜瓜果實(shí)中可溶性糖含量始終高于T2 和T1 處理（P＜0.05）。

圖1 不同施肥處理對(duì)薄皮甜瓜果實(shí)可溶性糖含量的影響Fig.1 Effects of different fertilization treatments on soluble sugar content of muskmelon fruits

2.1.2 化肥減施與有機(jī)肥及木霉菌劑配施對(duì)甜瓜果實(shí)果糖、葡萄糖、蔗糖的影響

圖2 結(jié)果表明，隨著果實(shí)發(fā)育，果糖含量呈升高趨勢(shì)，且在甜瓜果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段，各處理甜瓜果實(shí)中的果糖含量變化不盡相同。在花后21 d 的薄皮甜瓜果實(shí)中，CK1 處理的甜瓜果實(shí)中果糖含量最高，顯著高于其它處理，而T1 和T2 處理之間無(wú)明顯差異，但果實(shí)的果糖含量顯著低于T3 處理（P＜0.05）。在花后28 d 時(shí)，T3 處理的甜瓜果實(shí)果糖含量最高，顯著高于其它處理，而T1 和T2 處理之間無(wú)明顯差異，但顯著低于CK1 和CK 處理（P＜0.05）。在花后35 d 時(shí)，T2 和T3 處理的甜瓜果實(shí)果糖的含量顯著高于CK1、CK 和T1 處理（P＜0.05），而T1 處理果糖含量最低，顯著低于CK 和CK1 處理，但T2和T3 處理之間無(wú)明顯差異（P＜0.05）。

圖2 不同施肥處理對(duì)薄皮甜瓜果實(shí)果糖含量的影響Fig.2 Effects of different fertilization treatments on fructose content of muskmelon fruits

由圖3 可以看出，隨著薄皮甜瓜果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育，果實(shí)中葡萄糖含量呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，在同一時(shí)期，各處理之間甜瓜果實(shí)葡萄糖含量存在明顯差異。在花后21 d 時(shí)，CK 甜瓜果實(shí)中葡萄糖含量最高，顯著高于其它處理，CK1、T1 和T2 處理間無(wú)差異，而T3 處理的葡萄糖含量最低，顯著低于其它處理（P＜0.05）；在花后28 d 時(shí)，T3 處理的甜瓜果實(shí)葡萄糖含量最高，顯著高于其它處理，與CK 相比，CK1、T1和T2 處理甜瓜果實(shí)葡萄糖含量顯著下降（P＜0.05）；在花后35 d 時(shí)，與CK 和CK1 處理相比，化肥減施與有機(jī)肥及木霉菌劑配施處理（T1、T2 和T3）的甜瓜果實(shí)中葡萄糖含量顯著升高，CK1 和CK 處理之間無(wú)顯著性差異（P＜0.05），且T3 處理果實(shí)中葡萄糖含量最高，達(dá)6.61 mg·g-1。

圖3 不同施肥處理對(duì)薄皮甜瓜果實(shí)葡萄糖含量的影響Fig.3 Effects of different fertilization treatments on glucose content of muskmelon fruits

圖4表明，隨著甜瓜果實(shí)生長(zhǎng)的發(fā)育，果實(shí)中蔗糖含量呈逐漸升高的趨勢(shì)；在花后21 d 的薄皮甜瓜果實(shí)中，T1 處理的甜瓜果實(shí)蔗糖含量最高，顯著高于其它處理，T3 處理的甜瓜果實(shí)中蔗糖含量最低，顯著低于其它處理，CK1、T1 和T2 處理的蔗糖含量顯著高于CK（P＜0.05）；在花后28 d 時(shí)，與CK 和CK1 相比，T1、T2 和T3 處理的蔗糖含量顯著升高，且T3 處理蔗糖的含量最高，高達(dá)2.98 mg·g-1，而CK1 中果實(shí)蔗糖含量則顯著低于CK 處理（P＜0.05）；在花后35 d時(shí)，與CK 相比較，各施肥處理果實(shí)蔗糖含量顯著升高，且T1、T2 和T3 處理果實(shí)的蔗糖含量顯著高于CK1處理，且T3 處理果實(shí)蔗糖含量最高，達(dá)4.04 mg·g-1。

圖4 不同施肥處理對(duì)薄皮甜瓜果實(shí)蔗糖含量的影響Fig.4 Effects of different fertilization treatments on sucrose content of muskmelon fruits

2.2 甜瓜果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中糖代謝相關(guān)酶活性的動(dòng)態(tài)變化

2.2.1 化肥減施與有機(jī)肥及木霉菌劑配施對(duì)果實(shí)蔗糖合成酶活性的影響

由圖5 可以看出，隨著甜瓜果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育，果實(shí)中蔗糖合成酶-合成方向的酶活性（SS-s）存在顯著差異，呈現(xiàn)逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)。在花后21 d，與CK 相比，各處理的甜瓜果實(shí)SS-s 酶活性顯著提高，且T1、T2和T3 處理SS-s 酶活性明顯高于CK1 處理，T2 處理酶活性最高（P＜0.05）；在花后28 d 時(shí)，與CK 和CK1處理相比較，T1、T2 和T3 處理SS-s 酶活性顯著升高，T2 和T3 處理顯著高于T1，但二者之間無(wú)差異，CK 與CK1 處理間則無(wú)差異（P＜0.05）。在花后35 d，各處理間SS-s 酶活性無(wú)顯著性差異（P＜0.05）。

圖5 不同施肥處理對(duì)薄皮甜瓜果實(shí)蔗糖合成酶（合成方向）活性的影響Fig.5 Effects of different fertilization treatments on sucrose synthase activity（synthesis direction）in muskmelon fruits

從圖6 可以看出，隨著甜瓜果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育，果實(shí)中蔗糖合成酶-分解方向酶活性（SS-d）呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。在花后21 d 時(shí)，T1 處SS-d 酶活性顯著高于其它處理，而CK1、T2 和T3 處理之間無(wú)明顯差異，但顯著高于CK（P＜0.05）；在花后28 d 時(shí)，CK 處理SS-d 酶活性顯著高于其它處理，CK1、T2 和T3 處理之間無(wú)明顯差異，且低于T1 處理（P＜0.05）；在花后35 d，各處理間SS-d 酶活性無(wú)顯著性差異（P＜0.05）。

圖6 不同施肥處理對(duì)薄皮甜瓜果實(shí)蔗糖合成酶（分解方向）活性的影響Fig.6 Effects of different fertilization treatments on sucrose synthase activity（decomposition direction）of muskmelon fruits

2.2.2 化肥減施與有機(jī)肥及木霉菌劑配施對(duì)果實(shí)蔗糖磷酸合成酶活性的影響

從圖7 中可以看出，在甜瓜果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的不同時(shí)期，各處理的甜瓜果實(shí)中蔗糖磷酸合成酶活性（SPS）存在明顯差異。在花后21 d 時(shí)，與CK1 和CK處理相比，各處理的甜瓜果實(shí)SPS 酶活性顯著升高，而T1 與T3 處理間無(wú)明顯差異，但都高于T2 處理，CK處理SPS 酶活性最低（P＜0.05）；在花后28 d 時(shí)，與CK 相比，T1 和T2 處理SPS 酶活性顯著升高，CK1處理的酶活性顯著下降，T3 則無(wú)顯著差異（P＜0.05）；在花后35 d 時(shí)，與CK 和CK1 處理相比較，T1、T2 及T3 處理SPS 酶活性顯著升高，而T1 和T3 處理之間無(wú)明顯差異（P＜0.05）。

圖7 不同施肥處理對(duì)薄皮甜瓜果實(shí)蔗糖磷酸合成酶活性的影響Fig.7 Effects of different fertilization treatments on sucrose phosphate synthase activity of muskmelon fruits

2.2.3 化肥減施與有機(jī)肥及木霉菌劑配施對(duì)果實(shí)酸性和中性轉(zhuǎn)化酶活性的影響

由圖8 可以看出，隨著甜瓜果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育，甜瓜果實(shí)中酸性轉(zhuǎn)化酶活性（AI）呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，且在同一時(shí)期，各處理之間AI 活性差異明顯。在花后21 d 時(shí)，T3 和CK1 處理的果實(shí)的AI 活性顯著高于CK 和T1、T2 處理，且T3 處理酶活性最大，而CK 和T1 處理之間無(wú)明顯差異，但明顯高于T2 處理（P＜0.05）；在花后28 d 時(shí)，T1 處理AI 活性顯著高于其它處理，CK1、T2 與T3 處理之間無(wú)明顯差異，且顯著低于CK 處理（P＜0.05）；在花后35 d 時(shí)，CK1 處理AI活性顯著高于其它處理，CK、T1 與T3 處理之間無(wú)明顯差異，且低于T2 處理（P＜0.05）。

圖8 不同施肥處理對(duì)薄皮甜瓜果實(shí)酸性轉(zhuǎn)化酶的影響Fig.8 Effects of different fertilization treatments on acid invertase of muskmelon fruits

圖9表明，隨著薄皮甜瓜果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育，甜瓜果實(shí)中中性轉(zhuǎn)化酶活性（NI）呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，且在同一時(shí)期，各處理NI 活性存在明顯的差異。在花后21 d 時(shí)，與CK 相比，CK1、T1，T3 處理NI 活性顯著升高，T2 無(wú)顯著差異；T3 處理顯著高于CK1 和T1，CK1 與T1 處理之間無(wú)明顯差異（P＜0.05）。在花后28 d 時(shí)，T2 處理NI 活性顯著高于其它處理，且T1 與T3 處理之間無(wú)明顯差異，但顯著高于CK 和CK1 處理（P＜0.05）。在花后35 d 時(shí)，與CK、CK1 相比，T2 和T3 處理NI 活性顯著升高，而T1 處理無(wú)明顯差異（P＜0.05）。

圖9 不同施肥處理對(duì)薄皮甜瓜果實(shí)中性轉(zhuǎn)化酶的影響Fig.9 Effects of different fertilization treatments on neutral invertase in muskmelon fruits

3 結(jié)論與討論

甜瓜因其口感清脆，香甜可口而被廣大消費(fèi)者所青睞。香甜是衡量甜瓜品質(zhì)的重要指標(biāo)，果實(shí)中糖分的含量及其組成種類(lèi)是影響果實(shí)品質(zhì)的重要因素之一[15]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著甜瓜果實(shí)生育期的增長(zhǎng)，甜瓜果實(shí)中可溶性糖、葡萄糖、果糖和蔗糖含量逐漸增加，尤其在花后35 d 達(dá)到最高，而且各處理的可溶性糖、果糖、葡萄糖和蔗糖的糖含量在花后28 d 和35 d積累較多，這可能與研究中所用的甜瓜品種有關(guān)，“CH7”品種在花后28～30 d 內(nèi)成熟。研究發(fā)現(xiàn)，配施木霉菌后，農(nóng)民常規(guī)施用化肥+木霉菌（T1）較農(nóng)民常規(guī)施用化肥處理（CK1）顯著增加了甜瓜各個(gè)時(shí)期的可溶性糖、葡萄糖和蔗糖含量，可能是由于木霉菌通過(guò)調(diào)控根系分泌物和土壤微生物的多樣性來(lái)提高植株的可溶性含糖量，這與前人的研究結(jié)果一致[16]。有機(jī)肥配施木霉菌（T2）和減施化肥配施木霉菌和有機(jī)肥處理（T3）各個(gè)時(shí)期的可溶性糖、葡萄糖和蔗糖的含量顯著高于CK1 和T1 處理，說(shuō)明木霉菌和有機(jī)肥是改善甜瓜品質(zhì)的有效途經(jīng)之一，這與前人在其它作物上研究結(jié)果一致[17-18]，尤其減施化肥配施有機(jī)肥和木霉菌效果更顯著，說(shuō)明減施化肥條件下配施木霉菌和有機(jī)肥是提高甜瓜品質(zhì)，促進(jìn)甜瓜可持續(xù)發(fā)展的有效手段之一。

國(guó)內(nèi)外研究表明，植物果實(shí)中糖分的變化與蔗糖代謝的關(guān)鍵酶活性有關(guān)[19-20]，主要包括蔗糖合成酶（合成與分解兩方向）、蔗糖磷酸合成酶和轉(zhuǎn)化酶（酸性轉(zhuǎn)化酶和中性轉(zhuǎn)化酶）[17]。研究發(fā)現(xiàn)各處理甜瓜果實(shí)的蔗糖、葡萄糖和可溶性總糖含量隨著生育期的生長(zhǎng)而增長(zhǎng)，SS-s 和SPS 酶活性相應(yīng)隨之升高，而AI 和NI 隨著蔗糖含量的增加而降低，這與刁倩楠[21]對(duì)甜瓜的研究結(jié)果一致。大量的試驗(yàn)結(jié)果表明，配施有機(jī)肥是改善土壤環(huán)境，提高作物品質(zhì)和產(chǎn)量的有效手段[22-23]。在研究中，配施木霉菌和有機(jī)肥的T1、T2和T3 處理都顯著增加了果實(shí)可溶性糖和蔗糖的含量，同時(shí)提高了果實(shí)成熟前期的SS-s 和SPS 活性，降低了果實(shí)成熟后期的SS-d、AI 和NI 酶活性，這與前人在甜菜和梨中的研究結(jié)果相類(lèi)似[24-25]。但是甜瓜果實(shí)中果糖含量較低且AI 和NI 活性逐漸下降，這與枸杞研究結(jié)果正好相反[26]，可能的原因是甜瓜果實(shí)以蔗糖為主，而枸杞則以果糖和葡萄糖為主，主要是因?yàn)樗鼈兊陌l(fā)揮合成和積累的酶之間的協(xié)調(diào)關(guān)系可能存在差異。大量的研究提出配施有機(jī)肥和木霉菌可以通過(guò)土壤微生物多樣性的調(diào)控、根際有益微生物的定殖以及激素信號(hào)的傳導(dǎo)等方式調(diào)控植物-微生物互作以及植株體內(nèi)糖的積累與運(yùn)輸以改變?cè)?庫(kù)關(guān)系，進(jìn)而影響植物體內(nèi)的糖代謝[27-28]，從而導(dǎo)致各類(lèi)糖組成和含量的差異，達(dá)到調(diào)控果實(shí)品質(zhì)的目的。木霉菌和有機(jī)肥配施調(diào)控甜瓜糖代謝的微生物學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)理還不清楚，需要進(jìn)一步分析研究。

綜上所述，與CK（不施肥處理）和CK1（農(nóng)民常規(guī)施肥）相比較，配合施用木霉菌或者木霉菌-化肥-有機(jī)肥配施（T1、T2、T3）處理通過(guò)促進(jìn)果實(shí)中SS-S酶、SPS 酶和成熟前期NI 酶的活性，抑制成熟和成熟后期甜瓜果實(shí)的SS-d 酶和AI 酶的活性，從而不同程度地提高了薄皮甜瓜果實(shí)中可溶性糖含量以及成熟果實(shí)中果糖、葡萄糖、蔗糖含量，尤其是T3 處理效果明顯。因此，減施化肥配施木霉菌和有機(jī)肥，通過(guò)調(diào)節(jié)糖代謝酶之間的協(xié)調(diào)性，進(jìn)而促進(jìn)成熟果實(shí)糖分合成和積累，從而達(dá)到提升甜瓜品質(zhì)和減肥的目的。