綠豆GR 基因生物信息學分析及其CRISPR/Cas9重組載體的構建與轉(zhuǎn)化

李曉駒，方淑梅，王慶燕，梁喜龍，鄭殿峰，3

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院；3 廣東海洋大學）

綠豆（Vigna radiataL.）是蛋白質(zhì)、膳食纖維、礦物質(zhì)、維生素和大量生物活性化合物（包括多酚、多糖和肽）的極好來源[1-4]，因其生育期短、適應性廣泛和固氮性能[5]，在種植產(chǎn)業(yè)結構調(diào)整和優(yōu)質(zhì)高效農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及經(jīng)濟發(fā)展中具有重要作用[6]。近年來，由于其產(chǎn)量低且價格不穩(wěn)定，我國綠豆種植面積及其在國際市場中的競爭力受到嚴重影響[7]。此外，由于其特殊的花結構，嚴格閉花授粉，雜交不易成功。加之我國綠豆的品種改良工作起步較晚，種植面積相對較小，所以在一定程度上限制了綠豆轉(zhuǎn)基因育種的發(fā)展。為此綠豆經(jīng)常被農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者種植在貧瘠的土地上，產(chǎn)量遠遠沒有到達自給自足，進口量逐年增加，且由于多年連續(xù)種植，常存在著連作障礙現(xiàn)象[7-9]?，F(xiàn)有的綠豆品種已不能滿足當下種植需求，綠豆的育種方式也亟待拓展?；蚓庉嬘N因其育種效率高、育種周期短、且能定向改良某一個或多個目標性狀，能解決多種自交不親和性及不易雜交等問題，被廣泛用于作物育種，但因綠豆遺傳轉(zhuǎn)化體系尚不完善，直至目前為止，國內(nèi)外對綠豆基因編輯育種的研究鮮見報道。

所在團隊經(jīng)甲基化測序研究發(fā)現(xiàn)，大豆谷胱甘肽還原酶基因（GR）在大豆抗（耐）連作方面具有積極作用。谷胱甘肽還原酶（GR）是抗壞血酸—谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)中的關鍵抗氧化酶，其主要的生理功能是將氧化型谷胱甘肽（GSSG）還原為還原型谷胱甘肽（GSH），從而為活性氧（ROS）的清除提供還原力，保護植物免受傷害[10]。再加之前人研究發(fā)現(xiàn)GR基因可在多種環(huán)境脅迫中發(fā)揮作用，所以對GR基因的功能展開研究具有重要意義。因此，論文將在生物信息分析的基礎上，利用綠豆GR基因構建CRISPR/Cas9 重組載體，初步揭示遺傳轉(zhuǎn)化體系在綠豆中的應用潛力。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)是一些細菌和古生菌用于抵抗外來質(zhì)?；蛘呤删w入侵的免疫系統(tǒng)[11]。一般來說，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對外來DNA 的作用可分為三步：一是免疫獲得；二是免疫表達；三是免疫反應。具體表現(xiàn)為其通過堿基配對方式與sgRNA（single guide RNA）形成Cas9 蛋白復合物，參與靶雙鏈DNA 的切割。經(jīng)過人工改造后，CRISPR/Cas 技術現(xiàn)已成為一項能對基因組完成精確修飾的基因編輯技術，具有操作簡單、效率高、脫靶效率低等特點。隨著CRISPR/Cas 系統(tǒng)的發(fā)展，其在越來越多的領域中得到廣泛應用，包括人[12]、小鼠[13]、擬南芥[14]、玉米[15]、大豆[16]，以及傳染病的診斷和治療等[17-18]。尤其是在“十四五”期間作物育種工作中，CRISPR/Cas9 早已成為主流的基因編輯技術和手段[16]。

基于上述分析，以期通過生物信息學分析了解GR基因及其相應蛋白產(chǎn)物特點，構建CRISPR/Cas9-GR-gRNA 敲除載體，同時利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化綠豆子葉節(jié)，獲取陽性毛狀根，從而為構建綠豆CRISPR/Cas9 基因編輯體系及獲取優(yōu)質(zhì)的突變體遺傳材料奠定前期基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株、載體、試劑及儀器

試驗中用于基因遺傳轉(zhuǎn)化的綠豆品種“綠豐2號”，由實驗室保存。大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α 和DNA 回收試劑盒購于北京全式金生物技術有限公司。發(fā)根農(nóng)桿菌K599、CRISPR/Cas9 載體pYLCRISPR/Cas9 -DB 及gRNA 載體pYLgRNA -AtU3d、pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU6 -1、pYLgRNA-AtU6-29 由廣州大學孔凡江教授饋贈。質(zhì)粒提取試劑盒購自康為公司；2×Taq Master Mix、T4 連接酶購自TaKaRa 公司；限制性內(nèi)切酶AscI、BsaI 購自NEB 公司；PCR 試劑KOD plus 購自Toyopo 公司；蔗糖、瓊脂、各種抗生素、用于培養(yǎng)基配制的試劑以及其他化學試劑購自Solarbio 公司。

1.2 綠豆GR 生物信息學分析

利用NCBI 網(wǎng)站獲取大豆GR基因（Glyma.02G141800）的蛋白質(zhì)序列，再使用BLASTp 工具對大豆GR基因的蛋白質(zhì)序列在綠豆基因數(shù)據(jù)庫進行BLAST 比對到綠豆的GR基因（LOC106772498）序列，接著使用ExPASy ProtParam 在線軟件對綠豆GR基因編碼的氨基酸序列進行理化性質(zhì)（分子量、等電點、氨基酸組成、不穩(wěn)定系數(shù)等）分析，采用Netphos3.1Server 在線軟件對綠豆GR 蛋白進行磷酸化位點預測，利用Protscale 在線軟件進行疏水性或親水性預測與分析，運用TMHMM Server v.2.0 預測蛋白的跨膜結構域。通過SignalP5.0 在線軟件預測GR蛋白的信號肽，根據(jù)ProtComp9.0 在線軟件進行亞細胞定位預測，通過SMART 在線軟件分析GR 的保守結構域，利用Phyre2 在線軟件預測該蛋白的三級結構模型。

1.3 同源比對及進化樹分析

通過NCBI 網(wǎng)站中的blastp （protein-protein BLAST）與CD- Search 在線比對工具對綠豆GR基因編碼氨基酸序列進行同源比對，在其中選取相似性較高的物種， 包括綠豆（Vigna radiata，XP_014514412.1）、赤豆（Vigna angularis，XP_017415 276.1）、菜豆（Phaseolus vulgaris，XP_007144694.1）、大豆（Glycine max，KAG5002780.1）、豌豆（Pisum sativum，P27456.1）、粳稻（Oryza sativa subsp.JaponicaGRoup，XP_015627860.1）、大麥（Hordeum vulgare，BAF80308.1）、小麥（Triticum aestivum，KAF7041206.1）、玉米（Zea mays，NP_001292747.1）、高粱（Sor-ghum bicolor，XP_002468457.1）、西紅柿（Solanum lycopersicum，NP_001234243.2）、馬鈴薯（Solanum tu-berosum，KAH0636848.1）、 辣椒（Capsicum chinense，PHU22703.1）、煙草（Nicotiana tabacum，P80461.1）、山荊子（Malus baccata，TQE13711.1）、蘋果（Malus domestica，XP_028958518.1）、桃（Prunus perosica，XP_0 07199772.1）、扁桃（Prunus dulcis，XP_034228289.1）、櫻桃（Prunus avium，XP_021821920.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，NP_191026.1）、甘藍（Brassica oleracea，VDD57363.1）、蕪菁（Brassica rapa，RID47097.1）、芥菜（Brassica juncea，AAD28177.1）。

（1）利用DNAMAN 軟件做氨基酸多重序列比對；

（2）利用MEGA_X 軟件對作物中的氨基酸序列進行同源比對；

（3）利用Jalview 軟件對氨基酸序列進行同源比對和可視化分析；

（4）利用iTOL（https：//itol.embl.de/tree/）在線分析軟件基于鄰接法構建綠豆GR 蛋白與其他22 個物種GR 蛋白的系統(tǒng)進化樹，分析其親緣關系。

1.4 靶點選擇及sgRNA 引物設計

利用CRISPOR 網(wǎng)站（http：//crispor.tefor.net/）在線工具對綠豆GR基因序列進行gRNA 靶位點設計。選擇4 個長度為20 bp 的靶位點序列（圖1），4 個靶位點，能同時敲除綠豆GR基因，分別為GR-AtU3d-T1-F1/GR-AtU3d-T1-R1、GR-AtU3b-T2-F2/GRAtU3b-T2-R2、GR-AtU6-1-T3-F3/GR-AtU6-1-T3-R3、GR-AtU6-29-T4-F4/GR-AtU6-29-T4-R4，同時設計CRISPR 鑒定引物GR-CasF-Test/GR-Cas R-Test（表1）。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

圖1 靶點在GR 基因內(nèi)的位置Fig.1 Location of the target in the GR gene

1.5 四靶點CRISPR/Cas9-GR-gRNA 載體的構建

構建CRISPR /Cas9 載體步驟如下：（1）靶點接頭制備，將靶點引物放置PCR 儀中90 ℃退火30 s。（2）gRNA 載體的酶切、連接與擴增反應，使用T4 DNA Ligase 酶和BsaⅠ酶將靶點引物與對應的gRNA 連接起來，進行兩輪巢式PCR 反應后使用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，按此方法分別獲得四個靶點的gRNA表達盒，各取3 μL 電泳檢查產(chǎn)物長度是否符合。（3）四靶點pYLCRIS PR/Cas9-GR-gRNA 載體（圖2）的酶切、連接及測序，將四個靶點gRNA 表達盒按一定濃度比例混合，加入未切割的pYLCRISPR/Cas9 質(zhì)粒，BsaⅠ37 ℃酶切10 min，加入T4 DNA ligase，設置兩個循環(huán)溫度實現(xiàn)先酶切后連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞后，挑取單克隆接種培養(yǎng)，并使用Cas9 載體上的特異引物SP1/3 進行菌落PCR，成功篩選出單克隆后抽提質(zhì)粒后將酶切鑒定正確的進行測序，測序正確的菌株甘油保存?zhèn)溆谩?/p>

圖2 載體構建信息Fig.2 Vector construction information

1.6 綠豆子葉外植體的遺傳轉(zhuǎn)化

（1）侵染液的制備。取出備用質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌K599 感受態(tài)細胞中，挑單克隆到YEP 液體培養(yǎng)基，搖至OD600=0.6 左右，吸取5 mL 菌液，離心棄上清，加入1 mL 10 mM MgCl2溶液重懸，做侵染液。

（2）外植體的獲得。選取籽粒均勻、飽滿的綠豆種子，消毒滅菌后用無菌水清洗4～5 次，均勻放置在綠豆培養(yǎng)基中，5 d 后選取子葉肥厚無病斑的外植體以及粗壯的下胚軸備用。

（3）外植體的侵染與培養(yǎng)。將外植體放置滅菌紙上，用無菌刀水平切割頂端（未切離），用無菌毛筆或棉簽沾取含有重組體的K599 菌液，均勻涂抹在切面，放置在含有特美丁、頭孢、芐基霉素的發(fā)根培養(yǎng)基中，放到培養(yǎng)室，暗光培養(yǎng)，直到傷口長出毛狀根。

1.7 毛狀根檢測

收集綠豆毛狀根，提取綠豆毛狀根DNA，利用SP1/3 引物進行PCR 擴增，檢測陽性植株。根據(jù)侵染后統(tǒng)計PCR 擴增陽性毛狀根數(shù)量計算得出毛狀根轉(zhuǎn)化率。

計算方法：毛狀根轉(zhuǎn)化率=轉(zhuǎn)化陽性毛狀根外植體數(shù)量/染總外植體數(shù)量×100%。

2 結果與分析

2.1 綠豆GR 基因及相關蛋白的一般特性分析

（1）理化性質(zhì)分析

使用ExPASy ProtParam 在線軟件對綠豆GR基因進行分析，結果顯示綠豆GR基因編碼蛋白的相對分子量為58.38 kDa，其分子式為C2612H4132N716O775S13，原子總數(shù)為8 248，氨基酸數(shù)為544，由19 種氨基酸組成，其中高含量氨基酸為丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）和絲氨酸（Ser），其比例分別為9.7%、9.6%和8.1%；有59 個帶正電荷的氨基酸（Arg 和Lys），有54個帶負電荷的氨基酸（Asp 和Glu），其理論等電點為8.69，屬于弱堿性蛋白；預測半衰期為30 h，屬于一種較為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。

（2）磷酸化位點的預測

通過Netphos 3.1 Server 在線軟件對GR蛋白進行磷酸化位點預測。GR 蛋白存在47 個磷酸化位點，其中絲氨酸（Ser）位點28 個，蘇氨酸（Thr）位點25個，絡氨酸（Tyr）位點4 個，該蛋白Ser 磷酸化位點最多，推測其活性可能受到磷酸化的調(diào)控。

（3）親水性預測和分析

利用Protscale 在線軟件對綠豆GR 蛋白預測與分析。結果表明：GR 最低疏水值為-2.678，最高親水值為2.278，親水值大于疏水值，由此推測該蛋白為親水性蛋白。這一結果與ExPASy ProtParam 的預測結果一致。

（4）跨膜結構域預測

使用TMHMM 2.0 Server 在線軟件對綠豆GR蛋白的跨膜結構域進行預測，未發(fā)現(xiàn)GR 蛋白有明顯的跨膜結構域。通過SignalP3.0 軟件預測GR 蛋白的信號肽，也未發(fā)現(xiàn)GR 蛋白有信號肽，表明GR 蛋白是一種非分泌蛋白。接著根據(jù)ProtComp9.0 在線軟件對綠豆GR 蛋白進行亞細胞定位預測，發(fā)現(xiàn)其在細胞質(zhì)積分值（inteGRal）最高，說明該蛋白主要在細胞質(zhì)中行使功能。

（5）蛋白質(zhì)二級結構預測

為了更好地了解GR 蛋白的結構與功能，采用SOPMA 對綠豆GR 蛋白二級結構進行預測。發(fā)現(xiàn)GR蛋白中α-螺旋有163 處，占29.96%；延伸鏈有120處，占22.06%；β-轉(zhuǎn)角有31 處，占5.07%；無規(guī)則卷曲有230 處，占42.28%。

（6）保守結構域

通過SMART 在線軟件分析GR 的保守結構域，發(fā)現(xiàn)該蛋白在第67～390 個氨基酸處有Pyr_redox_2結構域，在第410～519 個氨基酸處有Pyr redox dim結構域（圖3）。PROSITE 在線程序也同樣顯示GR 蛋白是含有Pyr redox 2、Pyr redox dim 結構域的ATP結合蛋白，屬于PLN025465 超家族（圖3）。

圖3 GR 蛋白結構域預測Fig.3 Domain prediction of GR protein

（7）蛋白質(zhì)三級結構模型預測

在預測GR蛋白二級結構的基礎上，利用Phyre2在線軟件預測該蛋白的三級結構模型。該模型是以C5w1jA 為模板進行構建，二者的序列一致性達到83%，預測可信度為100%。由圖4 可知，GR蛋白主要由α-螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈組成，β-轉(zhuǎn)角比較少，這也與GR 蛋白二級結構預測的結果一致。并且在預測的GR 蛋白三維結構中，其具有GR 蛋白與GSSG 和NADPHet al 作用的結合位點，C 端具有黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的結合域。

圖4 GR 蛋白三級結構預測Fig.4 Prediction of the tertiary structure of GR protein

2.2 同源比對及進化樹分析

通過NCBI 網(wǎng)站中的blastp（protein-protein BLAST）與CD- Search 在線比對工具對綠豆GR基因編碼氨基酸序列進行同源比對，在其中選取相似性較高的物種，用DNAMAN 軟件做氨基酸多重序列比對。結果表明，綠豆GR基因與其他物種的GR基因編碼氨基酸序列高度保守（圖5）。

圖5 不同物種GR 同源比對Fig.5 GR homology comparison of different species

利用MEGA7 軟件基于鄰接法繪制綠豆GR 蛋白和其他22 條來自物種GR 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。如圖6 所示，進化樹聚為2 個大組，其中豆科、薔薇科、茄科和十字花科屬于同一大組，禾本科單獨成組。其中豆科和薔薇科屬于同一四級分支，前者與茄科屬于同一三級分支，前者與十字花科屬于同一二級分支。分級數(shù)越大，說明各個植物科目情緣關系越密切。

（1）綠豆GR基因編碼蛋白與赤豆處在同一個末級分支，說明與赤豆的親緣關系最近。其次是菜豆，在豆科植物中與豌豆親緣關系最遠。

（2）豆科植物GR基因與薔薇科植物GR基因?qū)儆谕淮箢惙种?，說明其與蘋果、桃等薔薇科植物的親緣關系較為接近，而與粳稻、大麥、玉米、高粱等禾本科植物親緣關系最遠。

（3）綠豆和赤豆同處于豆科最末級分支，說明其GR基因可能是豆科中最后演化（圖6）。

圖6 不同植物的GR 進化樹分析Fig.6 GR phylogenetic tree analysis of different plants

2.3 四靶點CRISPR/Cas9-GR-gRNA 載體的構建與轉(zhuǎn)化

（1）CRISPR/Cas9-GR-gRNA 載體的構建

首先構建四個分別由AtU3d、AtU3b、AtU6-1、AtU6-29 啟動子啟動的靶位點。通過巢式PCR 擴增的方法分別進行四個靶位點sgRNA 表達盒的連接，擴增產(chǎn)物的片段都約為500 bp（圖7A）。再將4 個sgRNA 表達盒通過一步法組裝到pYLCRISPR/Cas9載體上，構建pYLCRISPR/Cas9-GR-gRNA 表達載體，組裝完成的重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，隨后挑取陽性單克隆，搖菌培養(yǎng)，隨后進行質(zhì)粒的提取。經(jīng)Asc Ⅰ酶切鑒定，切出目的片段大小分別約為15.5 kbp 和2 000 bp（圖7B），表明四個靶位點gRNA表達載體盒已經(jīng)成功插入到編輯載體上。最后將酶切驗證正確的質(zhì)粒進行測序，測序正確的載體保存用于后續(xù)試驗。

圖7 pYLCRISPR/Cas9-GR-gRNA 表達載體的構建及驗證Fig.7 Construction and verification of pYLCRISPR/Cas9-GR-gRNA expression vector

（2）發(fā)根農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化

將構建好的pYLC RISPR/Cas9-GR-gRNA 表達載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌K599，利用通用引物SP1/3 進行PCR，為陽性克隆，則能擴增出2 000 bp 左右的目的條帶。（圖8）說明pYLCRISPR/Cas9-GR-gRNA 重組質(zhì)粒已轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌K599 中，挑取陽性單克隆制備好農(nóng)桿菌K599 菌液，待菌液OD600=0.6 時侵染萌發(fā)4～5 d 的綠豆子葉，暗條件下培養(yǎng)，直至長出毛狀根（圖9）。

圖8 重組質(zhì)粒pYLCRISPR/Cas9-GR-gRNA PCR 鑒定Fig.8 PCR identification of recombinant plasmid pYLCRISPR/Cas9-GR-gRNA

圖9 發(fā)根農(nóng)桿菌K599 轉(zhuǎn)化綠豆子葉節(jié)和下胚軸Fig.9 Agrobacterium K599 transformation of mung bean cotyledon nodes and hypocotyls

2.4 毛狀根檢測

利用CRISPR/Cas9 載體上通用引物SP1/3，PCR擴增產(chǎn)物約為2 000 bp。本次共檢測20 株毛狀根，共檢測出12 株陽性轉(zhuǎn)基因毛狀根，其毛狀根轉(zhuǎn)化率約為60%（圖10）。

圖10 陽性轉(zhuǎn)基因根毛檢測Fig.10 Detection of positive transgenic roots

3 討論

3.1 GR 基因

GR（谷胱甘肽還原酶）是維持還原型谷胱甘肽含量的關鍵酶，還原型谷胱甘肽直接參與應激抵抗和適應機制，從而確保細胞免受氧化損傷，在抵抗干旱、低溫、高鹽、高溫、強光、重金屬等環(huán)境脅迫中具有重要作用[10，19-20]。丁舜華等[21]研究表明，擬南芥谷胱甘肽還原酶的減少導致擬南芥中年齡依賴性和H2O2誘導的提前衰老。Tang G 等[22]構建了苜蓿根瘤菌GR基因缺失突變體，使得苜蓿延遲結瘤，總固氮容量減少75%，還發(fā)現(xiàn)通過GR途徑GSSG 回收谷胱甘肽有助于苜蓿根瘤的發(fā)育和競爭能力，在固氮共生中起著關鍵作用。Bashir K 等[23]研究表明，GR可能在禾本科植物的缺鐵應答中發(fā)揮作用。Wu TM 等[24]研究表明，水稻GR3 基因敲除導致水稻對鹽脅迫的敏感性增加。同時有研究表明，GR在抵抗生物脅迫方面也具有一定的作用。研究通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)綠豆GR基因編碼一個58.38 kDa，含有544 個氨基酸的蛋白質(zhì)，并顯示其與赤豆、菜豆、豌豆、蘋果、桃、大麥等，具有高度序列同源性，都具有保守的GSSG 和NADPH 序列，含有Pyr_redox_2 和Pyr_redox_dim 兩個結構域，這與Madhu[25]的研究結果相一致。

3.2 CRISPR/Cas 基因編輯及育種

CRISPR/Cas 系統(tǒng)作為一項主流的基因編輯技術，由于其操作簡單、效率高，廣泛應用于哺乳動物和植物的基因突變和轉(zhuǎn)錄調(diào)控[26]。與傳統(tǒng)育種方法相比，CRISPR/Cas 系統(tǒng)能快在改良作物產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病性、抗除草劑和縮短育種周期均起到重要作用[27]。Jiang B[28]研究表明，利用CRISPR/Cas9 介導大豆雄性不育基因MS1 的誘變，花粉活性測試表明，雖然野生型植物的花藥充滿了有活力的花粉，但兩個編輯品系的花藥都是空心的，并且有活力的花粉粒數(shù)量顯著減少。Do[29]利用CRISPR/Cas9 編輯GmFAD2-1A和GmFAD2-1B，使大豆油酸含量超過80%的顯著增加，而亞油酸降低到1.3%～1.7%。蔡宇鵬等[30]利用CRISPR/Cas9 介導的GmFT2a 靶向誘變延遲大豆開花時間。

隨著國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因植物新品種的越來越多，但轉(zhuǎn)基因食品的安全問題引起了人們的思考。利用CRISPR/Cas9 技術，可以很簡單、方便且在理論上相對安全地獲得具有穩(wěn)定遺傳的目標基因突變植物材料，但方法也存在許多技術上的難題。技術在不同的物種其遺傳效率不同，豆科作物就是遺傳轉(zhuǎn)化效率極低的一類物種，很難將基因編輯載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)并發(fā)揮基因編輯功能；其次，不同物種編輯基因的效率有所不同，在相同物種不同基因型的生物編輯效率也有所差異。最后，CRISPR/Cas9 成功進入細胞內(nèi)并發(fā)揮基因編輯功能，使目標靶點斷裂，但由于生物同源修復能力不同，導致被切割的目的基因難以被修復重組等。

我國綠豆的基因編輯育種尚無報道，目前國內(nèi)外還沒有CRISPR/Cas9 技術在綠豆中的應用。研究成功構建了分別由AtU3d、AtU3b、AtU6-1、AtU6-29啟動子啟動四靶點CRISPR/Cas9 編輯載體，接著利用靶點篩選引物GR-CasF/R-Test 對陽性毛狀根進行PCR 擴增后測序。通過測序發(fā)現(xiàn)，AtU3d、AtU3b、AtU6-1、AtU6-29 啟動子啟動的Target 1、2、3、4 靶點均未出現(xiàn)有效的基因編輯（圖11）。導致上述結果的可能原因如下：（1）由于試驗樣本量不足，綠豆基因編輯效率低，導致難以獲得突變體；（2）CRISP/Cas9技術中也存在脫靶效應，Target 2、3、4 各靶點序列大小僅有20 bp，全基因組中這段序列可能存在相同或類似的序列，因此不知道靶點設計是否合理有效；（3）由于未見有AtU3d、AtU3b、AtU6-1、AtU6-29 啟動子在綠豆中的報道，潛在的因素尚未確定，暫時無法確定這些啟動子能否在綠豆中正常啟動。

圖11 編輯靶點測序峰圖Fig.11 Detailed sequence of the targets site

4 結論

研究通過生物信息學手段明確了綠豆GR基因及其所編碼蛋白的理化特性、結構特征、亞細胞定位及生物進化關系。同時以此為基礎，成功構建了CRISPR/Cas9-GR-gRNA 基因編輯載體，同時通過K599 農(nóng)桿菌介導綠豆轉(zhuǎn)化并產(chǎn)生毛狀根，最后利用基因編輯重組載體通用引物進行PCR 鑒定，成功獲取陽性毛狀根12 個，研究可為今后深入分析GR基因在綠豆中的功能提供有效信息和理論依據(jù)，同時為CRISPR/Cas9 技術在綠豆中的應用提供前期基礎。