不同培養(yǎng)條件對黃檗快速繁殖的影響

劉 娜，范香香，丁俊杰

（1.中國科學院新疆生態(tài)與地理研究所《干旱區(qū)地理》編輯部，新疆 烏魯木齊 830011；2.蒲城縣退耕還林事務(wù)中心；3.新疆農(nóng)墾科學院）

黃檗（Phellodendron amurense Rupr.）又名黃菠蘿，蕓香科，落葉喬木，是國家二級珍貴樹種，也是我國三大珍貴闊葉樹種之一。黃檗具有深根性、抗風力強、生長快等特點，對氣候適應(yīng)性強，苗期稍能耐蔭，成年樹喜陽光。主要分布在我國的黑龍江、吉林、遼寧、河北等省[1]。黃檗樹皮木栓層很發(fā)達且其中含有一些生物堿，具有重要的經(jīng)濟和藥用價值。黃檗樹葉隨季節(jié)而變化，也可用于園林[2]。該樹種在新疆各地城市綠化生態(tài)園林中得到廣泛應(yīng)用，目前已推廣到博樂、奎屯、克拉瑪依、烏魯木齊及和田等地。目前，黃檗已經(jīng)被列為國家二級保護植物和重點植物保護資源，在《中國植物紅皮書》中，將其列為漸危種。

黃檗種皮堅硬，透水和透氣性較差，所以種子發(fā)芽率較低。扦插繁殖，黃檗不易生根，成活率低，繁殖系數(shù)低[3]。組織培養(yǎng)可在短期內(nèi)得到大量、優(yōu)質(zhì)、整齊的組培苗，有可能是解決種苗短缺的有效途徑之一。本項目的研究旨在找尋黃檗快速繁殖的最適條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃檗的繁殖材料于2019年5月17日至2019年6月7日采自石河子大學農(nóng)學院實驗站黃檗樹上的新鮮幼嫩的莖尖和莖段。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的選擇與消毒

于生長期分別采取黃檗幼嫩的莖尖和莖段（長2 cm左右），采用75%的酒精和0.1%的HgCl2進行消毒，經(jīng)不同時間的消毒滅菌后，建立外植體。

本實驗采用75%的酒精（消毒時間：3 s、5 s和8 s）和0.1%的HgCl2（消毒時間：2 min、4 min和6 min）進行消毒，共設(shè)9組實驗方案。

1.2.2 外植體的接種與培養(yǎng)

首先用自來水將黃檗莖段沖洗干凈，再放少許洗衣粉繼續(xù)沖洗，直到不再產(chǎn)生泡沫；然后將外植體轉(zhuǎn)移至無菌操作臺上，先浸入75%的乙醇，然后用無菌水沖洗3～5遍，再用0.1%的HgCl2消毒之后再用無菌水沖洗3～5遍，用無菌濾紙吸干水分；將外植體接種在基本培養(yǎng)基上進行組織培養(yǎng)。

在離體培養(yǎng)條件下，由于各種植物的生物學特性、遺傳特性和生態(tài)學特性的不一致，它們對營養(yǎng)的要求也不同，因此選擇適宜的培養(yǎng)基對黃檗組培至關(guān)重要[4]。本實驗設(shè)置不同6-BA濃度（0.5 mg/L、1.0 mg/L）和NAA濃度（0.5 mg/L、1.0 mg/L）配比的4組MS基本培養(yǎng)基，基本培養(yǎng)基各500 mL。

自從發(fā)布軍政令后，衢州城實際上成了一座兵城，原來允許每家每戶只留一個人看家守院，實際上，衢州的老百姓怕死得要命，早早都卷了細軟關(guān)門大吉。人一走，商賈全無，這下可苦了八十六軍上萬張守城官兵的嘴，入城月余，盡管米面不缺，但蔬菜、食油、肉類全無，這讓人怎么活啊。剛開始，軍紀還嚴，憲兵管束得也緊，街上少有入室盜物的，但天天吃米飯饅頭，有錢也沒處使，一些“寧當飽死鬼，不當餓死漢”的家伙開始撬門入室尋找食物。見長官見了也只是輕描淡寫地罵兩聲，于是搶劫之風便從城東刮到城西。實在看不下去了，中將副軍長陳頤磊便下令軍法從嚴，法辦了幾起搶劫打傷老百姓的，局面才平息下來。

培養(yǎng)條件為：蔗糖為30 g/L，瓊脂為7 g/L，pH為5.8，溫度介于20～25 ℃之間，光暗周期為16/8 h。

培養(yǎng)30 d后，觀察并統(tǒng)計9組消毒方案下黃檗組培苗的褐變率、污染率及成活率，通過對比分析，以確定最佳的消毒時間組合。此外，通過統(tǒng)計黃檗組培苗的芽叢數(shù)、株高，并觀察組培苗長勢，以確定最佳6-BA濃度和NAA濃度配比的基本培養(yǎng)基。

1.2.3 腋芽初始培養(yǎng)

利用第一次初始培養(yǎng)得到的黃檗組培苗進行芽的誘導實驗。制作不同6-BA濃度（0.5 mg/L、1.0 mg/L）和NAA濃度（0.2 mg/L、0.6 mg/L、1.0 mg/L、1.4 mg/L）配比的8組MS培養(yǎng)基，各250 mL。對基本培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的黃檗組培苗進行腋芽的初始誘導培養(yǎng)到8組激素配比的MS培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為：蔗糖為30 g/L，瓊脂為7 g/L，pH為5.8，溫度介于20～25 ℃，光暗周期為16/8 h。

培養(yǎng)30 d后，觀察并統(tǒng)計組培苗的腋芽數(shù)、株高及長勢，以確定用于腋芽誘導的最佳6-BA濃度和NAA濃度配比。

1.2.4 腋芽增殖培養(yǎng)

利用第一次腋芽初始誘導得到的黃檗組培幼苗進行腋芽的增殖培養(yǎng)。制作不同6-BA濃度（0.5 mg/L、0.7 mg/L、0.9 mg/L、1.2 mg/L）和NAA濃度（0.5 mg/L、1.0 mg/L）配比的8組MS培養(yǎng)基，各250 mL。對第一次腋芽初始誘導得到的黃檗組培苗的芽叢進行增殖培養(yǎng)到8組激素配比的MS培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為：蔗糖為30 g/L，瓊脂為7 g/L，pH為5.8，溫度介于20～25 ℃之間，光暗周期為16/8 h。

培養(yǎng)30 d后，觀察并統(tǒng)計組培苗的腋芽增殖數(shù)、株高及長勢，以確定用于腋芽增殖培養(yǎng)的最佳6-BA和NAA濃度配比。

1.2.5 試管苗生根培養(yǎng)

試管苗的生根培養(yǎng)是組織培養(yǎng)中的重要環(huán)節(jié)，是快速繁殖幼苗的有力保證[5]。目前，對于組織培養(yǎng)試管苗生根的研究，國內(nèi)外針對不同植物做了大量的研究。將外植體培養(yǎng)在4組不同NAA濃度（0.1 mg/L、0.4 mg/L、0.7 mg/L、1.0 mg/L）的MS培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為：蔗糖為30 g/L，瓊脂為7 g/L，pH為5.8，溫度介于20～25 ℃，光暗周期為16/8 h。

培養(yǎng)30 d后，觀察并統(tǒng)計組培苗的生根數(shù)、生根率及根的長勢，以確定黃檗組培苗生根的最佳NAA濃度。

1.2.6 黃檗組培苗轉(zhuǎn)培

在組織培養(yǎng)中，不同轉(zhuǎn)培時間對黃檗組培苗的影響也很大。本實驗共設(shè)立了4組轉(zhuǎn)培時間，分別是在接種后的20 d、25 d、30 d、35 d和40 d，將繼代培養(yǎng)中的黃檗組培苗分別經(jīng)不同時間將進行轉(zhuǎn)培，并觀察組培苗的株高和生長狀態(tài)，以確定其最適宜的轉(zhuǎn)培時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對黃檗莖段培養(yǎng)的影響

通過對比發(fā)現(xiàn)75%的酒精消毒時間為8 s、0.1%HgCl2的消毒時間為4 min時的消毒效果最好（表1），污染率僅為1.2%，褐變率為1.0%，外植體的成活率高達93.1%。從實驗可知，當75%的酒精殺毒時間為3 s時，褐變率很低，但是污染率卻升高了。當75%的酒精殺毒時間為5 s時，褐變率和污染率都不是很低，外植體的成活率也不高。0.1%HgCl2的消毒方法對實驗的影響較小。由此可見，酒精消毒時間過長會引起褐變的數(shù)量增加，但是殺菌效果較好；如果酒精消毒時間過短，雖然褐變率降低，但是殺菌效果不是很好。

表1 不同消毒時間對黃檗莖段培養(yǎng)的影響 %

2.2 最佳基本培養(yǎng)基的篩選

經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，不同激素濃度對黃檗組培苗壯苗的影響效果顯著（表2），在第4組培養(yǎng)基中，黃檗幼苗生長極其緩慢，平均株高只有2.7 cm。而第1組和第3組培養(yǎng)基中的黃檗幼苗長勢均良好，株高在3.2 cm左右。只有第2組培養(yǎng)基中的黃檗幼苗長勢最好，平均株高達到了4.8 cm。因此，在6-BA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L培養(yǎng)基中黃檗組培幼苗生長迅速且狀態(tài)最好。

2.3 腋芽的初始誘導

在所有的組合中，6-BA 0.6 mg/L+NAA 1.0 mg/L的培養(yǎng)基對黃檗莖段腋芽的誘導效果最好（表3）。在這種培養(yǎng)基中，腋芽數(shù)量較多且黃檗組培苗長勢較好。研究發(fā)現(xiàn)生長素NAA濃度一定時，芽的抽芽增殖率并不隨著細胞分裂素濃度的升高而增大，高濃度的6-BA反而抑制細胞的分化和生長。

2.4 腋芽的增殖培養(yǎng)

在培養(yǎng)基的各種成分中，植物激素的影響最大。在木本植物的組織培養(yǎng)中，常用BA誘導腋芽增殖途徑得到無菌苗。在6-BA 0.7 mg/L+NAA 1.0 mg/L的培養(yǎng)基中，黃檗腋芽增殖倍數(shù)最大，達到6倍每株（表4）。組培苗的生長狀態(tài)也最好，植株生長最高，葉片伸展而且大。由此可見，該濃度適合愈傷組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的研究。雖然黃檗在6-BA 0.7 mg/L+NAA 1.0 mg/L培養(yǎng)基中，腋芽的增殖數(shù)最大，達到每株6個。但是，腋芽的增殖率并不隨著激素濃度的增加而增加，高濃度的激素濃度反而抑制了組培苗的生長。因此，通過本實驗，確定了6-BA 0.7 mg/L+NAA 1.0 mg/L為黃檗腋芽增殖的最佳激素濃度。

表4 不同6-BA、NAA濃度對黃檗莖段腋芽增殖的影響

2.5 誘導生根途徑

當NAA濃度為0.7 mg/L時處理效果最好，生根的平均條數(shù)為4條，根呈綠色且粗壯。而當NAA濃度達到1.0 mg/L時，黃檗的生根率明顯降低，根的顏色也由綠色變成黃白色（表5）。這說明較高或者較低的生長素濃度都不利于黃檗再生苗的生根。由此，可以確定黃檗最佳生根激素為NAA 0.7 mg/L。

表5 不同NAA濃度對黃檗生根的影響

2.6 繼代培養(yǎng)中不同轉(zhuǎn)培時間對組培苗的影響

黃檗組培苗在培養(yǎng)20 d后，組培苗長勢一般，平均株高只有3.1 cm；黃檗組培苗在培養(yǎng)25 d后，組培苗長勢較好，葉片也變的伸展了，平均株高為3.4 cm；黃檗組培苗在培養(yǎng)30 d后，組培苗長勢最好，葉片大而伸展且顏色翠綠，平均株高為3.8 cm；黃檗組培苗在培養(yǎng)35 d后，組培苗較30 d時長勢下降，葉片大但是開始卷曲，平均株高為3.9 cm；黃檗組培苗在培養(yǎng)40 d后，組培苗長勢一般，葉片卷曲嚴重且開始發(fā)黃，平均株高為3.9 cm（表6）。所以，黃檗組培苗在培養(yǎng)30 d后進行轉(zhuǎn)培對黃檗組培苗的生長最好。

表6 不同轉(zhuǎn)培時間對黃檗組培苗的影響

3 結(jié)論

本實驗分別采用了6-BA和NAA研究不同激素組合對黃檗愈傷組織誘導和分化的影響。在接種的最初一周內(nèi)，外植體開始膨大，膨大到外植體最初體積的2倍；兩周左右，外植體開始從切口的邊緣分化出愈傷組織。研究發(fā)現(xiàn)，不同激素濃度對外植體愈傷組織誘導和再生均有一定的影響。本實驗研究結(jié)果表明：（1）消毒時間：75%的酒精消毒時間為8 s、0.1%HgCl2的消毒時間為4 min時的消毒效果最好。（2）基本培養(yǎng)基的確定：6-BA 0.5 mg/L +NAA 1.0 mg/L的培養(yǎng)基中黃檗組培幼苗生長迅速且狀態(tài)最好。（3）腋芽的初始誘導：6-BA 0.6 mg/L +NAA 1.0 mg/L的培養(yǎng)基對黃檗莖段腋芽的誘導效果最好。（4）腋芽的增值培養(yǎng)：6-BA 0.7 mg/L+NAA 1.0 mg/L的培養(yǎng)基中黃檗腋芽增殖倍數(shù)最大，組培苗的生長狀態(tài)也最好，植株生長最高，葉片伸展而且大。由此可見，該濃度適合愈傷組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化研究。（5）誘導生根途徑：當NAA濃度為0.7 mg/L時誘導生根的效果最好，根呈綠色且粗壯。（6）繼代培養(yǎng)中，黃檗組培苗在培養(yǎng)30 d后進行轉(zhuǎn)培對黃檗組培苗的生長最好。