頸動脈粥樣硬化斑塊患者外周血LCAT基因啟動子區(qū)DNA甲基化情況觀察

趙佳，姜小建，謝紫陽，屈曉艷，左林

1 西安市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710003；2 空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院放射科

由動脈粥樣硬化所導(dǎo)致的心腦血管疾病已成為當(dāng)今嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病之一。頸動脈粥樣硬化斑塊是一種常見的動脈粥樣硬化表現(xiàn)形式，其臨床特點(diǎn)是頸動脈內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積和纖維組織增生，導(dǎo)致血管腔狹窄和血流受限。脂代謝異常是其重要發(fā)病機(jī)制。卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（LCAT）催化血漿脂蛋白中游離膽固醇的酯化，在高密度脂蛋白（HDL）代謝和膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［1-2］。LCAT 異?？捎绊懩懝檀嫉哪嫦蜣D(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展［3］。DNA 甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式，甲基化通常發(fā)生在基因啟動子區(qū)，抑制基因轉(zhuǎn)錄，這種變化可以通過細(xì)胞分化遺傳。研究［4］顯示，動脈粥樣硬化患者可以通過DNA 甲基化調(diào)控脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)，影響其功能，與動脈粥樣硬化的形成密切相關(guān)。本研究觀察了頸動脈粥樣硬化斑塊患者外周血LCAT基因啟動子區(qū)DNA 甲基化情況，并分析甲基化占比與頸動脈狹窄程度的關(guān)系，以期為動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制和臨床治療提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年6—12月西安市中心醫(yī)院收治的頸動脈粥樣硬化斑塊患者52例（觀察組），男33 例，女19 例；年齡50～64（57.06 ± 4.42）歲；BMI（25.10 ± 3.46）kg/m2；TC（4.42 ± 0.97）mmol/L；TG（1.76 ± 0.75）mmol/L；HDL-C（1.07 ± 0.23）mmol/L；LDL-C（2.62 ± 0.89）mmol/L；SBP（134.65 ±20.86）mmHg；DBP（80.24 ± 12.79）mmHg；FBG（6.11 ± 2.13）mmol/L；有吸煙史19 例（36.54%）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國頭頸部動脈粥樣硬化診治共識》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］；②年齡<65歲；③受試對象知情同意并表示愿意配合。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重感染性疾病；②惡性腫瘤；③血液和免疫系統(tǒng)疾?。虎車?yán)重肝腎功能不全；⑤顱內(nèi)出血和占位性病變；⑥近期服用降血脂類藥物。另選同期無頸動脈粥樣硬化斑塊健康體檢者50 例（對照組），男30 例，女20 例；年齡50～62（55.64 ± 4.26）歲；BMI（23.76 ± 3.73）kg/m2；TC（4.15 ± 0.88）mmol/L；TG（1.44 ± 0.54）mmol/L；HDL-C（1.16 ± 0.30）mmol/L；LDL-C（2.37 ±0.76）mmol/L；SBP（131.52 ± 18.34）mmHg；DBP（78.46 ± 11.32）mmHg；FBG（5.75 ± 1.94）mmol/L；有吸煙史11 例（22.00%）。兩組一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過，且患者知情同意。

1.2 外周血LCAT 基因啟動子區(qū)DNA 甲基化情況觀察 采集所有受試者空腹肘靜脈血2 mL，應(yīng)用血液基因組DNA 抽提試劑盒提取外周血基因組DNA，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。提取的DNA 進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，并檢測其濃度和純度。-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。在NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫中查詢LCAT（GenBank ID： 3931）基因序列，應(yīng)用MethPrimer 甲基化預(yù)測軟件（http：//www. urogene. org/methprim?er/）對LCAT 基因啟動子區(qū)進(jìn)行甲基化預(yù)測。經(jīng)預(yù)測存在3 個甲基化區(qū)域，分別設(shè)計3 對引物，引物序列：區(qū)域1，上游引物GAGGGTTATAGATTGGTGGT?TAGT，下游引物CAAAAACATAAACATACCAC?CATC；區(qū)域2，上游引物AGTTGGGTTTTTAYGGT?TAATTTTG， 下 游 引 物 CACCTTACCTC?CRAAAAATAAACAC；區(qū)域3，上游引物ATGGTT?TATGGYGATTTGTGATT，下 游 引 物 CTCAC?TATTCCTAAATAAACCAAACA。以提取的外周血基因組DNA 作為模板，進(jìn)行PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增3 個甲基化區(qū)域基因片段。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3～5 min；94 ℃變性30 s；55～60 ℃退火25～30 s；72 ℃延伸30～50 s，35 個循環(huán)。反應(yīng)后的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的基因，與pUCm-T Vector 連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（SK9307），進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，提取質(zhì)粒，應(yīng)用硫化測序PCR（BSP）方法對甲基化位點(diǎn)進(jìn)行測序。DNA 甲基化判定標(biāo)準(zhǔn)：用亞硫酸氫鹽處理DNA，未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不會轉(zhuǎn)變。隨后在PCR 擴(kuò)增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，然后對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序，再與DNA 原始序列比對來判定CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化。

1.3 頸動脈狹窄程度檢查 對觀察組進(jìn)行頭頸部CTA 檢查，根據(jù)《中國頭頸部動脈粥樣硬化診治共識》對血管進(jìn)行狹窄程度進(jìn)行判定，輕中度狹窄為血管狹窄程度<70%，重度狹窄為血管狹窄程度>70%及血管閉塞［5］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

觀察組外周血LCAT基因啟動子區(qū)DNA 甲基化占比為65.38%（34/52），對照組外周血LCAT 基因啟動子區(qū)DNA 甲基化占比為36.00%（18/50），兩組甲基化占比比較，P<0.05。觀察組34例甲基化患者中，頸動脈輕中度狹窄21 例（61.8%）、重度及閉塞13 例（38.2%）；觀察組18 例非甲基化患者中，頸動脈輕中度狹窄16 例（88.9%）、重度及閉塞2 例（11.1%）；兩者輕中度狹窄、重度及閉塞占比比較，P均<0.05。觀察組甲基化患者和非甲基化患者典型病例CTA圖像見圖1。

圖1 觀察組甲基化患者和非甲基化患者典型病例CTA圖像

3 討論

頸動脈粥樣硬化斑塊是一種動脈粥樣硬化病變，通常呈現(xiàn)為黃色或黃棕色斑塊，質(zhì)地較硬，貼附在頸動脈內(nèi)膜下，形成脂質(zhì)斑塊和纖維斑塊，它主要由膽固醇、脂質(zhì)和鈣鹽組成，隨著時間的推移，這些斑塊會逐漸增厚并脫落［6］。頸動脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展會引起局部血流動力學(xué)的改變。斑塊的存在會使得頸動脈內(nèi)膜變得不規(guī)則，增加了血流阻力。同時斑塊的脫落可能會導(dǎo)致血栓形成，進(jìn)一步阻塞血流［7］。頸動脈粥樣硬化斑塊的存在增加了腦卒中和心臟病等心血管事件的風(fēng)險［8］。頸動脈粥樣硬化斑塊的臨床表現(xiàn)可以因患者的個體差異而有所不同，但一般包括以下幾個方面：首先，頸動脈聽診時可能會發(fā)現(xiàn)異常的血流聲音，如血流湍流聲、頸動脈雜音等。這些異常聲音可能是由于頸動脈粥樣硬化斑塊引起的血流不暢所致［9］。其次，頸動脈粥樣硬化斑塊的存在會導(dǎo)致頸動脈血流減少甚至完全中斷，使得頸動脈搏動減弱或消失。醫(yī)生可以通過觸摸頸動脈來評估患者的頸動脈搏動情況［10］。此外，頸動脈粥樣硬化斑塊可能導(dǎo)致腦供血不足，引起一系列腦血管癥狀，如頭暈、頭痛、視力模糊、言語困難、肢體無力等，嚴(yán)重的情況下，還可能出現(xiàn)突發(fā)性面癱、短暫性偏癱等癥狀。最后，頸動脈粥樣硬化斑塊的并發(fā)癥還可能包括心血管癥狀，如胸痛、心悸、呼吸困難等。這是由于斑塊脫落導(dǎo)致血流阻塞心臟供血的冠狀動脈所致。

LCAT 基因位于人類染色體16q22.1 上，包含6個外顯子和5 個內(nèi)含子，全長約為4 200 bp，編碼膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的關(guān)鍵酶LCAT。LCAT 在體內(nèi)的主要功能是催化游離膽固醇與磷脂結(jié)合，形成膽固醇酯。這個過程在膽固醇代謝中起著重要作用，對于維持膽固醇平衡至關(guān)重要。LCAT 基因的甲基化是指DNA 中的甲基化修飾發(fā)生在LCAT基因上。甲基化是一種常見的表觀遺傳修飾方式，不涉及DNA 序列的變化［11］。這種修飾是通過DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA 分子上的胞嘧啶堿基上實(shí)現(xiàn)的。在LCAT 基因上，甲基化通常發(fā)生在CpG 位點(diǎn)上，這是DNA 序列中的一種特殊序列，其中的C 堿基與緊鄰的G 堿基通過磷酸二酯鍵連接。CpG 位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)可以影響基因的表達(dá)，從而影響相關(guān)的生物過程和疾病的發(fā)生［12］。研究［13-14］發(fā)現(xiàn)，DNA 異常甲基化在炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮損傷、泡沫細(xì)胞形成和平滑肌細(xì)胞增殖等過程中起著重要作用。此外，脂代謝相關(guān)基因的DNA 甲基化在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程中也發(fā)揮了一定的調(diào)控作用［15-16］。然而，LCAT 基因的甲基化與動脈粥樣硬化之間的關(guān)系尚不明確。本研究顯示，觀察組LCAT基因啟動子區(qū)DNA 甲基化占比高于對照組，此結(jié)果與陳久凱等［17］的研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，觀察組甲基化者頸動脈狹窄程度明顯高于非甲基化者。結(jié)果表明，LCAT 基因甲基化可能影響膽固醇代謝和膽固醇平衡的維持，與動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。考慮到動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展與脂代謝紊亂密切相關(guān)，LCAT 基因的甲基化可能是動脈粥樣硬化發(fā)生的一個重要機(jī)制。近年來，許多學(xué)者采用頸動脈超聲檢查評估頸動脈狹窄情況［18］。頸動脈血管超聲診斷具有成本較低、簡單無創(chuàng)的特點(diǎn)，不僅可以動態(tài)檢測血流動力學(xué)情況，還能評估血管內(nèi)膜損傷情況。然而受顱骨的影響，超聲無法全面評估頸內(nèi)動脈全段及顱內(nèi)血管的狹窄情況，存在一定的局限性［19］。因此，本研究采用256 排CT 血管成像評估動脈粥樣硬化患者頭頸部血管狹窄程度，不受顱骨的干擾，能夠準(zhǔn)確、全面地顯示頸內(nèi)動脈、頸外動脈、頸總動脈及椎動脈全段異常部位的狹窄程度和斑塊形態(tài)，從而使結(jié)果更加準(zhǔn)確、全面。

總之，動脈粥樣硬化患者外周血LCAT 基因啟動子區(qū)DNA 甲基化與動脈粥樣硬化斑塊的形成密切相關(guān)，可能是促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展重要影響因素。至于LCAT 基因甲基化是否通過影響LCAT 的生物學(xué)功能而導(dǎo)致脂代謝紊亂，我們將在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。需要注意的是，LCAT 基因與動脈粥樣硬化以及動脈狹窄的關(guān)系是復(fù)雜的，受到多種遺傳和環(huán)境因素的影響。因此，在臨床實(shí)踐中，應(yīng)綜合考慮多個因素，包括基因、生活方式、環(huán)境等，來評估患者的動脈粥樣硬化風(fēng)險和狹窄程度。