結(jié)直腸癌組織Tregs占比和Foxp3、IL-10、TGF-β1 mRNA表達(dá)變化及其意義

馬虎林，孫曉霞，陳良全，張浩，黨利敏

1 內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院腹部腫瘤外科，呼和浩特 010010；2 內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院外科門診；3 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)內(nèi)蒙古臨床學(xué)院

結(jié)直腸癌（CRC）是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一［1］。CRC 在早期大多無明顯臨床癥狀，腫瘤確診率較低，多數(shù)患者確診時(shí)已屬中晚期。CRC 的發(fā)生發(fā)展及免疫逃逸機(jī)理仍不明確，對(duì)于喪失手術(shù)時(shí)機(jī)的CRC 患者仍缺乏有效的治療方法。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Tregs）是機(jī)體內(nèi)重要的免疫抑制細(xì)胞，可抑制CD8+CTL 細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞（DC）等多種免疫效應(yīng)細(xì)胞的功能，在腫瘤免疫逃逸機(jī)制中具有關(guān)鍵作用。Tregs 通常是指CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞，是繼K-ras 后對(duì)CRC 預(yù)后判斷具有潛在意義的分子標(biāo)記物之一，可能成為一項(xiàng)CRC 的獨(dú)立預(yù)后評(píng)估指標(biāo)［2］。白細(xì)胞介素10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）是參與免疫調(diào)節(jié)及具有免疫抑制功能的細(xì)胞因子，而Treg細(xì)胞可通過釋放IL-10和TGF-β等抑制性細(xì)胞因子參與維持對(duì)機(jī)體免疫平衡［3-4］。叉頭轉(zhuǎn)錄因子（Foxp3）是Tregs最關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物，對(duì)于Tregs的分化和功能維持具有重要作用。大量研究［5-7］證實(shí)，外周循環(huán)、區(qū)域淋巴結(jié)和惡性腫瘤患者腫瘤部位（包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌和皮膚癌）的Tregs 均會(huì)增加。CRC 患者正常結(jié)腸黏膜中Foxp3+Treg 密度高與預(yù)后較差相關(guān)［8-10］。因此，探討Tregs 在CRC 中的可能作用，在CRC 的靶向治療中具有重要意義。本研究觀察了CRC 組織中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）占比及Foxp3、IL-10、TGF-β1mRNA 表達(dá)情況，分析了Tregs 占比與CRC 臨床病理參數(shù)的關(guān)系，旨在探討Tregs 發(fā)揮免疫逃逸的可能機(jī)制，為CRC的治療提供一個(gè)新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2021 年6 月—2022 年6 月內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院收治的CRC 患者24 例，男16例，女8 例；年齡<60 歲10 例，≥60 歲14 例；TNM 分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期6例，Ⅲ期11例，Ⅳ期4例；回盲部腫瘤1例，升結(jié)腸腫瘤4例，橫結(jié)腸腫瘤3例，降結(jié)腸腫瘤5 例，乙狀結(jié)腸腫瘤11 例；腫瘤直徑：<5 cm 13例，≥5 cm 11 例；組織學(xué)分級(jí)：中高分化17 例，低分化7 例。所有患者術(shù)前均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，且均未行化療或放療。選取手術(shù)切除的CRC 組織及正常結(jié)腸組織各24 例份。本研究經(jīng)內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得所有患者的書面知情同意。

1.2 主要試劑及儀器 MACS CD4MicroBeads、MACS 分選器、MACS-Octo 解離器均購自于德國Miltenyi Biotec 公司；TRIzol 液購自于Invitrogen 公司；RNA 提取試劑盒購自于德國Qiagen 公司；Super?script Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自于Miltenyi 公司；FITC 標(biāo)記鼠抗人CD4單克隆抗體、PE 標(biāo)記鼠抗人CD25單克隆抗體、PE 標(biāo)記鼠抗人FOXP3 單克隆抗體購自于Pharmingen 公司；胎牛血清、RPMI 1640 培養(yǎng)基購自于美國Gibco 公司；FASC Calibur 流式細(xì)胞儀購自于美國BD 公司；熒光定量PCR 儀購自于美國Corbett公司。

1.3 CRC 組織中Tregs 占比測(cè)算 ①單核細(xì)胞分離：將CRC 組織和正常結(jié)腸組織樣本切碎，并研磨為懸糊狀，在含2.5%胎牛血清（FBS）和1 mmol/L二硫蘇糖醇的漢克斯緩沖鹽水溶液（HBSS）中孵育20 min，然后在37 ℃、0.75 mmol/L EDTA 中孵育3周期，每次15 min，分別去除粘液和上皮細(xì)胞。將樣品轉(zhuǎn)移到含有鈣和鎂的gentle MACS C 管（Miltenyi）中，加入0.5 mg/mL 膠原酶Ⅳ（Sigma 公司）、50 ng/mL DNAse Ⅰ（Thermo Fisher）、2%胎牛血清和10%胎牛血清。擰緊C 管蓋子，倒置在帶加熱器的gentle-MACS Octo 解離器（Miltenyi）上進(jìn)行組織解離。用濾器去除分離的組織塊，并用HBSS 液沖洗濾器，收集過濾液，室溫下以300 g離心10 min，棄去上清，用冰HBSS 重懸細(xì)胞。②CD4+T 細(xì)胞分選：采用免疫磁珠法。在重懸的單核細(xì)胞中加入PBS洗滌一次，以1 500 r/min速度離心5 min，棄去上清；取約1×107細(xì)胞加入80 μL 緩沖液重懸細(xì)胞，加入20 μL的MACS CD4+MicroBeads，混勻，4 ℃條件下放置20 min；轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，加入4 mL 的PBS 緩沖液，充分混勻，以1 500 r/min速度離心時(shí)間5 min；棄離心上清，用500 μL 的PBS 緩沖液重懸細(xì)胞，使用吸管緩慢反復(fù)吹打10次，使細(xì)胞能夠均勻分散開同時(shí)磁珠不脫離細(xì)胞；將分離柱置于MACS 分選器中，加入3 mL 的PBS 緩沖液沖洗分離柱，然后將細(xì)胞懸液緩慢加入到分離柱中，進(jìn)行分選；將分離柱移出磁場，用5 mL 的PBS 緩沖液反復(fù)沖洗分離柱，收集沖洗液，微量離心機(jī)離心5 min（2 500 r/min），棄上清溶液，并用500 μL 的PBS 緩沖液重懸所有細(xì)胞，-70 ℃凍存?zhèn)溆?。此部分即為CD4+T 細(xì)胞。③Tregs 占比測(cè)算：取CD4+T 細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×107/mL，取樣100 μL 加入離心管，封口，4 ℃孵育20 min；分別加入10 μL 的CD25、10 μL 的CD4和10 μL 的Foxp3 抗體，渦旋振蕩4～5 s，充分混勻，封口，4 ℃低溫避光孵育15 min；加新配制的溶血素2 mL（按1︰9 的比例配置溶血素，1 mL 的10×溶血素 + 9 mL 的雙蒸水）后避光孵育10～15 min，根據(jù)紅細(xì)胞裂解狀態(tài)，以1 500 r/min 速度離心5 min；棄去上清，用PBS 緩沖液洗滌1 次，再加入200～500 μL 的PBS 液混勻，封口，避光4 ℃保存，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。對(duì)照管按同樣測(cè)定條件上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果分析用Flow Jo 軟件。根據(jù)散點(diǎn)圖分布選定淋巴細(xì)胞群，再以CD4+T 細(xì)胞和SSC 設(shè)門，選擇CD4+T 細(xì)胞分析門內(nèi)相關(guān)Tregs 的比例。Tregs 占比以CD4+T細(xì)胞中被標(biāo)記為CD4+CD25+Foxp3+的細(xì)胞所占百分比表示。

1.4 CRC組織中Tregs相關(guān)因子檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR法。取CRC組織和正常結(jié)腸組織，液氮冷凍后研磨成粉，TRIzol提取組織總RNA，用SuperScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，按照PCR 試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)及合成由TAKRA 公司完成，F(xiàn)oxp3 上游引物5′-GAGAAGCTGAGTGCCATGCA-3′，下游引物5′-AGAGCCCTTGTCGGATGAT-3′；IL-10 上游引物5′-CGAGATGCCTTCAGCAGAGTG-3′，下游引物5′-TCATCTCAGAACAAGGCTTGGC-3′；TGF-β1上游引物5′-GGCAGTGGTTGAGCCGTGGA-3′，下游引物5′-TGTTGGACAGCTGCTCCACCT-3′；GAPDH 上游引物5′-AAGAGCTACGAGCTGCCT?GAC-3′，下游引物5′-ATGGCCCAGCGGATGAG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共45 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2?ΔΔCt法計(jì)算Foxp3、IL-10、TGF-β1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC 組織和正常結(jié)腸組織Tregs 占比比較 CRC 組織和正常結(jié)腸組織Tregs 占比分別為4.23% ± 0.74%、7.73% ± 2.04%，兩者比較，P<0.05。

2.2 CRC組織和正常結(jié)腸組織Foxp3、IL-10、TGF-β1相對(duì)表達(dá)量比較 CRC 組織和正常結(jié)腸組織Foxp3相對(duì)表達(dá)量分別為4.05 ± 1.27、1.35 ± 0.53，IL-10相對(duì)表達(dá)量分別為3.52 ± 0.98、1.4 ± 0.31，TGF-β1相對(duì)表達(dá)量分別為0.96 ± 0.24、0.78 ± 0.25，兩者比較，P均<0.05。

2.3 Tregs占比與CRC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Tregs占比與CRC 臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1，由表1 可知，Tregs占比與CRC腫瘤分期相關(guān)（P<0.05）

表1 Tregs占比與CRC臨床病理參數(shù)的關(guān)系（± s）

表1 Tregs占比與CRC臨床病理參數(shù)的關(guān)系（± s）

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3 討論

CRC 是世界上最常見的致命惡性腫瘤之一，全球每年有1 000多萬人罹患結(jié)、直腸癌［11］。在世界范圍內(nèi)，我國CRC 的發(fā)病率低于西方發(fā)達(dá)國家，但目前總體呈上升趨勢(shì)。我國CRC 發(fā)病率已升至惡性腫瘤的第三位，在一些發(fā)達(dá)城市病死率甚至已升至第二位［12-13］。目前CRC 的治療方法以多種治療手段聯(lián)合的綜合治療模式為主，雖然為患者帶來了一定的生存獲益，但5 年生存率仍徘徊在50%～60%，總體治療效果不盡如人意［14］。因此，尋找理想的CRC早期診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)以及理想的治療靶點(diǎn)十分必要。

Tregs 是一種具有免疫抑制性的T 淋巴細(xì)胞亞群，被認(rèn)為是參與腫瘤免疫耐受的主要細(xì)胞群。在腫瘤免疫逃逸過程中，Tregs通過細(xì)胞間的直接接觸和分泌細(xì)胞因子（如TGF-β1、IL-10 等）的方式，抑制CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、DC和NK細(xì)胞的功能活性，從而降低機(jī)體免疫應(yīng)答的效力，達(dá)到免疫抑制的作用，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸［15］。研究［16-17］表明，F(xiàn)oxp3 是Tregs 中的特異性標(biāo)志物，其表達(dá)水平對(duì)于Tregs 的成熟發(fā)育和免疫抑制作用的發(fā)揮具有重要意義。Foxp3 作為轉(zhuǎn)錄因子，可通過調(diào)節(jié)多種與腫瘤發(fā)生具有直接或者間接關(guān)系的腫瘤基因表達(dá)來發(fā)揮對(duì)腫瘤的免疫抑制作用，如Foxp3 可抑制LAST2、p21、BRCA 等常見的抑癌基因的表達(dá)。Foxp3 也可通過激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路和上皮—間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）促使腫瘤生長［18］。IL-10 主要通過抑制抗原提呈細(xì)胞（APCs）對(duì)抗原的遞呈從而抑制機(jī)體對(duì)腫瘤免疫監(jiān)視作用。如抑制DC、Th17 細(xì)胞的活性，減少IL-23、IL-17 的分泌，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［19］。TGF-β1不僅能刺激血管生成和免疫逃避，而且可通過刺激癌細(xì)胞的EMT 過程，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長。此外，TGF-β1還可通過對(duì)癌基因的激活或腫瘤抑制因子丟失而減輕免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。如TGF-β1通過介導(dǎo)PSPC1 等因子的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［20］。Tregs 在CRC、肝癌、卵巢癌及前列腺癌等多種腫瘤患者外周血和腫瘤局部微環(huán)境中表達(dá)增高，且Tregs水平與患者腫瘤進(jìn)展及預(yù)后呈負(fù)相關(guān)；在腫瘤切除后Tregs 可恢復(fù)到正常水平，而腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)Tregs增多，而且這些Tregs表達(dá)的Foxp3 水平也較高，說明Tregs 與腫瘤的侵襲性和預(yù)后密切相關(guān)［21］。對(duì)于CRC 患者，外周血、腫瘤引流區(qū)域淋巴結(jié)、腫瘤部位Tregs會(huì)增多，這些Tregs可以主動(dòng)遷移到免疫活性部位［5，22］。研究［11］發(fā)現(xiàn)，CRC組織與正常CRC組織相比FOXP3過表達(dá)，F(xiàn)OXP3的表達(dá)與Dukes 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。因此，Tregs 和Foxp3 在CRC 的發(fā)生、發(fā)展和治療中具有重要的作用，可能成為治療靶點(diǎn)和預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)。本研究顯示，相比正常結(jié)腸組織，腫瘤浸潤組織中Tregs 明顯增多，且與腫瘤的TNM 分期呈正相關(guān)，同時(shí)腫瘤組織中Foxp3、IL-10、TGF-β1mRNA 表達(dá)升高，這與之前的許多研究結(jié)果一致，證實(shí)Foxp3+通過基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)促炎性因子的表達(dá)，如TNF-p、IL-2、GM-CSF 等，并上調(diào)免疫抑制因子的表達(dá)，如IL-10、TGF-β1以及血紅素加氧酶等，從而發(fā)揮免疫抑制的功能。這些研究表明，F(xiàn)oxp3 具有特異性地表達(dá)Tregs 的作用，因此Foxp3 可作為Tregs 的一個(gè)特異性標(biāo)志物。從另一個(gè)角度來看，我們可以利用檢測(cè)Foxp3 的水平來評(píng)估Tregs 在實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中的表達(dá)水平，進(jìn)而評(píng)估其免疫抑制功能的強(qiáng)弱。

總之，CRC 組織中Tregs 占比增加，Tregs 占比與患者腫瘤分期有關(guān)，F(xiàn)oxp3、IL-10、TGF-β1在CRC 組織中呈高表達(dá)。