非肌層浸潤膀胱癌患者癌組織BLACAT2、WDR5表達觀察及預后影響因素分析

石艷宏，何丹，馬曉燕，董兵衛(wèi)，郭文文，高應芳，司小敏

1 咸陽市中心醫(yī)院病理科，陜西咸陽 712000；2 西安市中心醫(yī)院病理科；3 咸陽市中心醫(yī)院腫瘤科

膀胱癌是常見的泌尿外科惡性腫瘤，全世界每年新發(fā)病例達43.0 萬，死亡例數(shù)達16.5 萬［1］。膀胱癌以非肌層浸潤膀胱癌（NMIBC）最為常見，約占所有初發(fā)膀胱腫瘤的70%。NMIBC 的治療包括經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切、術后膀胱局部灌注化療等，但仍會發(fā)生腫瘤局部復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，導致不良預后［2］。因此，有必要深入研究膀胱癌疾病機制，尋找能夠評估膀胱癌預后的腫瘤標志物。長鏈非編碼RNA 膀胱癌相關轉(zhuǎn)錄本2（BLACAT2）是一種長鏈非編碼RNA，又稱為LNC00958，長度為2.6 kb。BLACAT2 在膀胱癌［3］、食管癌［4］等惡性腫瘤中表達上調(diào)，通過促進腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移，是新的腫瘤標志物。WD 重復域蛋白5（WDR5）屬于WD 重復蛋白家族成員，具有典型的WD 重復序列，該序列有助于異源三聚體或多蛋白復合物的形成，參與包括細胞周期進展、信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡和基因調(diào)控等多種細胞過程［5］。胃癌、結(jié)腸癌中WDR5 的表達升高能夠通過組蛋白H3 賴氨酸4（H3K4）三甲基化，促進細胞周期素D1的表達，促進腫瘤細胞的惡性增殖［6-7］。目前，BLACAT2 和WDR5在NMIBC中的表達尚不清楚，鑒于既往研究中BLACAT2、WDR5的腫瘤促進作用，兩者可能是新的NMIBC 腫瘤標志物，影響NMIBC 患者的無進展生存預后。本研究觀察了NMIBC患者癌組織BLACAT2、WDR5表達變化，并分析患者預后的影響因素。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018 年2 月—2019 年2 月咸陽市中心醫(yī)院收治的NMIBC 患者94 例，男55 例，女39 例；年齡38～69（62.52 ± 4.26）歲；<60 歲40 例，≥60 歲54 例；有吸煙史41 例，無吸煙史53 例；腫瘤直徑≥3 cm 者25例，<3 cm 者69例；腫瘤數(shù)目為單發(fā)67例，多發(fā)27 例；腫瘤TNM 分期為Ta/Tis 期43 例，T1期51例；病理分級為低級別54例，高級別40例。納入標準：①所有患者均接受經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術，經(jīng)術后病理診斷為非肌層浸潤膀胱尿路上皮癌；②首次診治，術前均未接受放化療等抗腫瘤治療；③患者及家屬對本研究知情同意并簽字，臨床和隨訪資料完整。排除標準：①合并其他器官惡性腫瘤；②合并尿道狹窄，尿路感染或嚴重肝腎功能障礙等；③妊娠哺乳期婦女。留取經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術切除的NMIBC 和正常膀胱黏膜組織各94 例份。本研究經(jīng)倫理委員會審核批準。

1.2 NMIBC 和正常膀胱黏膜組織BLACAT2、WDR5 mRNA 檢測 取NMIBC 和正常膀胱黏膜組織，液氮中研磨，TRIzol 法提取組織總RNA，微量分光光度計檢測OD260/OD280 比值介于1.8～2.1。將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行實時熒光定量聚合酶鏈反應。引物由上海華大公司設計合成。BLA?CAT2 正向序列：5'-AGCAGCGAAAACGTGGTTGTA-3'，反向序列：5'-GCCGCAAAATAGTGTGCAAAG-3'；WDR5 mRNA 正向序列：5'-TTTTGCGGCTTC?GAGTAACCA-3'，反向序列：5'-GGCCTTGTA?AGGTTGTGCCA-3'；GAPDH 正向序列：5'-ACTCGT?GTCATCAGCGACTTG-3'，反向序列：5'-GCAACAG?TAGGTTTCCTTGTGT-3'。反應條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，變性退火延伸共40 個循環(huán)?？傮w系20 μL，包括SYBR Premix Master Mix 10 μL，正反向游引物各1 μL，cDNA 1 μL 和雙蒸水 7 μL。以GAPDH 為內(nèi)參，BLACAT2、WDR5 mRNA 相對表達量采用2-ΔΔCt法表示。

1.3 NMIBC 和正常膀胱黏膜組織WDR5 蛋白檢測 取NMIBC 和正常膀胱黏膜組織，以10%中性甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋切片，切片厚度4 μm，常規(guī)進行免疫組化染色。WDR5兔單克隆抗體購于英國Abcam公司（貨號ab178410）。梯度酒精脫水后中性樹脂封片。切片置于倒置顯微鏡下觀察染色情況。根據(jù)染色深度評分與染色面積評分的乘積進行評分，染色深度評分：無染色0 分，淺黃色1 分，棕黃色2 分，棕褐色3 分；染色面積評分：陽性面積<25%計1 分，25%～50%計2 分，51%～75%計3 分，>75%計4分。乘積≥2分為陽性，<2分為陰性。

1.4 NMIBC 患者隨訪方法 所有患者術后接受規(guī)范的膀胱灌注化療。術后第1 年每3 個月電話或門診隨訪1次，術后第2～3年每半年隨訪1次，隨訪內(nèi)容為腫瘤復發(fā)進展及患者生存情況，隨訪方式為膀胱鏡鏡檢，尿脫落細胞及盆腔CT 等影像學檢查等。隨訪終點為2022 年3 月1 日。進展定義腫瘤膀胱局部復發(fā)，盆腔或遠處轉(zhuǎn)移或發(fā)生腫瘤相關死亡。無進展生存時間（PFS）定義為自確診之日至腫瘤復發(fā)，轉(zhuǎn)移或腫瘤相關死亡時間發(fā)生的間隔時間。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)性分布的計量資料以±s表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson 相關分析法。生存分析采用Kaplan-Meier 分析，Log-rank 檢驗比較生存曲線間的差異。單因素及多因素Cox 回歸分析影響膀胱癌患者無進展生存預后的因素。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NMIBC 和正常膀胱黏膜組織BLACAT2、WDR5 mRNA及WDR5蛋白相對表達量比較 NMIBC組織BLACAT2、WDR5 mRNA 相對表達量分別為2.19 ± 0.38、1.62 ± 0.41，正常膀胱黏膜組織分別為0.47 ± 0.09、0.61 ± 0.12，兩者比較，P均<0.05。NMIBC、正常膀胱黏膜組織WDR5 蛋白陽性率分別為71.28%、10.64%，P<0.05。

2.2 NMIBC 組織BLACAT2、WDR5 mRNA 表達的相關性 NMIBC 組織BLACAT2 mRNA 與WDR 5 mRNA表達呈顯著正相關（r=0.756，P=0.000）。

2.3 BLACAT2、WDR5 mRNA 表達與NMIBC 臨床病理特征的關系 BLACAT2、WDR5 mRNA 表達與NMIBC 臨床病理特征的關系見表1，由表1 可知，BLACAT2、WDR5 mRNA 表達與NMIBC 腫瘤分期、病理分級有關（P均<0.05）。

表1 BLACAT2、WDR5 mRNA表達與NMIBC臨床病理特征的關系（± s）

表1 BLACAT2、WDR5 mRNA表達與NMIBC臨床病理特征的關系（± s）

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2.4 不同BLACAT2、WDR5 mRNA 表達的NMIBC患者總體無進展生存率比較 分別根據(jù)癌組織BLACAT2、WDR5 mRNA 表達的平均值2.19、1.62為界，分為BLACAT2高表達者（n=50）和低表達者（n=44），WDR5 mRNA高表達者（n=48）和低表達者（n=46）。BLACAT2 高表達者、低表達者3 年總體無進展生存率分別為44.00%（22/50）、77.27%（34/44），WDR5 mRNA 高表達者、低表達者3 年總體無進展生存率分別為41.67%（20/48）、78.26%（36/46），兩者比較，P均<0.05。

2.5 NMIBC 患者生存影響因素 以隨訪過程中NMIBC患者的是否發(fā)生腫瘤進展為因變量（1=進展，0=未進展，t=無進展生存時間），納入年齡（≥60歲vs.<60歲）、性別（男vs.女）、吸煙史（有vs.無）、病理分級（高級別vs.低級別）、腫瘤直徑（≥3 cmvs.<3 cm）、腫瘤數(shù)量（多發(fā)vs.單發(fā)）、腫瘤分期（T1期vs.Ta/Tis期）、BLACAT2（高表達vs.低表達）、WDR5 mRNA（高表達vs.低表達）為自變量，將單因素分析中差異具有統(tǒng)計學意義的因素（P<0.05）納入多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示腫瘤分期T1期、腫瘤分級高級別、BLA?CAT2高表達、WDR5 mRNA高表達是影響NMIBC患者無進展生存預后的獨立危險因素，詳見表2～3。

表2 NMIBC患者無進展生存預后的單因素Cox回歸分析結(jié)果

表3 NMIBC患者無進展生存預后的多因素Cox回歸分析結(jié)果

3 討論

膀胱癌是常見的尿路惡性腫瘤，每年新發(fā)患者例數(shù)達8.2 萬［8］。NMIBC 是臨床最常見的膀胱癌類型，腫瘤分期包括Ta、T1、Tis 期。NMIBC 的臨床治療以經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術為主，輔以術后膀胱灌注化療，但術后仍有約60%患者發(fā)生腫瘤局部復發(fā)，約15%患者進展為肌層浸潤膀胱癌，導致不良預后［9］。目前，NMIBC 預后的評估主要根據(jù)腫瘤分期，病理分級等因素進行危險分層，但由于腫瘤異質(zhì)性，仍然難以準確評估患者臨床預后［10］。深入研究膀胱癌發(fā)生發(fā)展的機制，尋找有效評估膀胱癌預后的分子標志物，對于指導臨床治療，改善高危患者的臨床預后意義重大。

BLACAT2 基因位于11p15.3，是一種長鏈非編碼RNA。近年來發(fā)現(xiàn)，BLACAT2 作為一種致癌因子，其表達升高促進腫瘤細胞的惡性增殖、轉(zhuǎn)移，是新的腫瘤治療靶點［11］。組蛋白甲基化修飾是組蛋白在組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下其氨基酸殘基甲基化過程，參與多種真核生物轉(zhuǎn)錄激活過程。WDR5 是WD-40 蛋白家族成員，具有甘氨酸—組氨酸及色氨酸—天冬氨酸支架結(jié)構(gòu)，能與H3K4 甲基化位點結(jié)合，參與胚胎干細胞分化，發(fā)育等生物學過程。近年來發(fā)現(xiàn)，WDR5通過參與形成蛋白復合體，在表觀遺傳學水平轉(zhuǎn)錄激活下游基因表達，參與胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展［12］。

本研究顯示，NMIBC 組織BLACAT2 表達升高，此結(jié)果與SEITZ 等［13］研究結(jié)果一致。SEITZ 等［13］利用二代測序?qū)Π螂装┲胁町愋员磉_的長鏈非編碼RNA 進行分析，證實癌組織BLACAT2 表達上調(diào)較為顯著，但該研究納入的病例主要以Ta 期為主，本研究增加Tis 和T1 期病例，能夠更為客觀反映非肌層浸潤膀胱癌中BLACAT2 的表達情況。本研究還顯示，BLACAT2 表達與NMIBC 腫瘤分期、病理分級有關，提示BLACAT2 參與促進膀胱癌的腫瘤進展。分析其機制，BLACAT2 能夠促進膀胱癌侵襲和轉(zhuǎn)移。XIAO 等［14］發(fā)現(xiàn)，膀胱癌中BLACAT2 的表達升高，其通過抑制c-Jun 氨基末端激酶通路，促進膀胱癌細胞的增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進腫瘤的侵襲能力。HE 等［15］報道，BLACAT2 的表達上調(diào)能夠誘導血管內(nèi)皮生長因子C的表達，促進膀胱癌淋巴轉(zhuǎn)移，動物實驗中予以抗血管內(nèi)皮生長因子C抗體則能夠逆轉(zhuǎn)BLACAT2過表達引起的膀胱癌轉(zhuǎn)移。因此，膀胱癌中BLACAT2表達升高參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可能是評估膀胱癌患者不良預后的腫瘤標志物。本研究證實，BLACAT2 高表達的NMIBC 患者無進展生存預后較差，是影響患者無進展生存預后的獨立危險因素，表明BLACAT2 有助于評估NMIBC 患者的臨床預后。分析其原因，一方面是BLACAT2高表達患者腫瘤惡性程度高，術后復發(fā)轉(zhuǎn)移的風險較大。另一方面，REN 等［16］發(fā)現(xiàn)，BLACAT2 高表達的腫瘤細胞對5 氟尿嘧啶等化療藥具有較強的耐藥性，從而增加了患者術后腫瘤復發(fā)的風險。

本研究顯示，NMIBC 組織WDR5 mRNA 和蛋白表達均明顯升高，此結(jié)果與國內(nèi)學者利用基因芯片研究結(jié)果一致［17］。HUANG 等［18］報道，膀胱癌中熱休克因子1 能夠與蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5 相互作用，招募并激活WDR5 的表達，促進H3K4 三甲基化，導致淋巴增強子結(jié)合因子1、基質(zhì)金屬肽酶9 和E2F 轉(zhuǎn)錄因子2 的表達上調(diào)，促進膀胱癌的侵襲和淋巴轉(zhuǎn)移能力。本研究還顯示，WDR5 mRN 表達與NMIBC腫瘤分期及病理分級有關，提示W(wǎng)DR5促進膀胱癌的腫瘤進展。分析其機制，可能是WDR5的表達影響腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的浸潤。LU 等報道，WDR5的表達升高能夠通過H3K4三甲基化，上調(diào)胰腺癌腫瘤細胞骨橋蛋白水平及程序性死亡配體1的表達，促進腫瘤細胞免疫逃逸。本研究中，WDR5 mRNA高表達是影響膀胱癌患者無進展生存預后的獨立因素，表明WDR5 是一種新的NMIBC 預后相關腫瘤標志物。分析其原因，NMIBC經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切后腫瘤可發(fā)生復發(fā)，復發(fā)高峰在術后半年和一年半，這與術中存在肉眼難以分辨的微小病灶或腫瘤殘余有關，而術后膀胱灌注化療對減少腫瘤復發(fā)發(fā)揮重要作用。本研究中WDR5 mRNA高表達患者術后易發(fā)生腫瘤復發(fā)進展，這可能是WDR5 mRNA高表達腫瘤細胞存在化療耐藥的現(xiàn)象。ZHANG 等報道，膀胱癌腫瘤細胞T24、UM-UC-3 中過表達WDR5 能夠增強對順鉑化療藥物的耐藥性，而加用WDR5 的特異性抑制劑OICR-9429 后，提高了腫瘤對化療治療的敏感性。因此，臨床醫(yī)生可根據(jù)NMIBC 組織WDR5 的表達，對患者電切術后的預后進行評估，對于高危復發(fā)的患者予以積極治療及隨訪，以改善患者臨床預后。本文結(jié)果還顯示，BLACAT2 mRNA 與WDR5 mRNA表達呈正相關，提示NMIBC 中BLACAT2 與WDR5可能存在協(xié)同的作用關系，共同參與膀胱癌的腫瘤進展。HE 等在膀胱癌細胞系和小鼠模型中證實，BLACAT2的過度表達通過與人H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶復合物的核心亞基WDR5 直接相互作用，表觀遺傳學上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子-C 的表達，促進膀胱癌相關的淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移［10］。但兩者能否成為新的治療靶點，值得臨床深入研究。

總之，NMIBC 組織BLACAT2、WDR5 表達升高，與腫瘤分期、病理分級及無進展生存預后有關，是潛在的評估NMIBC 患者無進展生存預后的腫瘤標志物，腫瘤分期T1 期、腫瘤分級高級別、BLACAT2 高表達、WDR5 mRNA 高表達是影響NMIBC 患者無進展生存預后的獨立危險因素。