中性水相介質(zhì)中開(kāi)菲爾胞外多糖與乳清蛋白的相互作用

白英,王純瑋

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特,010018)

蛋白質(zhì)凝膠性、乳化性、起泡性等重要功能因多糖的參與得以改善,進(jìn)而改變食品質(zhì)構(gòu)及加工特性,可用于提高乳液狀食品貨架期和改善食品品質(zhì)。蛋白質(zhì)-多糖相互作用在食品行業(yè)及生命體信號(hào)傳導(dǎo)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞黏附、病菌感染等許多細(xì)胞識(shí)別過(guò)程中發(fā)揮重要作用,蛋白質(zhì)和多糖的相互作用引起許多科學(xué)領(lǐng)域的廣泛興趣。蛋白質(zhì)和多糖之間的關(guān)聯(lián)相互作用是連續(xù)相和界面處的絡(luò)合及凝膠形成的主要基礎(chǔ),傳統(tǒng)上用于改善食品制造中各種食品膠體(分散體、乳液、泡沫、凝膠及其混合變體)的物理穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)特征。開(kāi)菲爾胞外多糖(Kefiran)與各種微生物形成了開(kāi)菲爾粒結(jié)構(gòu)的骨架,并可以保護(hù)開(kāi)菲爾粒免受外部微生物的危害。與其他多糖相比,Kefiran具有顯著的抗菌和抗真菌特性、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、減少血清膽固醇水平和調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)等功能特性。經(jīng)過(guò)許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),體系中乳清蛋白(whey protein,WP)的聚集與乳清蛋白和多糖之間的相互作用有關(guān)[1]。HUAN等[2]研究了不同多糖對(duì)冷凝乳清蛋白凝膠性質(zhì)的影響。DE JONG等[3]和曾令鶴等[4]研究了不同多糖與乳清蛋白混合體系微觀結(jié)構(gòu)的影響。謝建華等[5]研究得出一定比例的乳清蛋白-魔芋葡甘聚糖混合體系表現(xiàn)出協(xié)同作用。微生物多糖被用作食品添加劑在食品工業(yè)中被廣泛應(yīng)用。所以對(duì)Kefiran與乳清蛋白相互作用的研究對(duì)食品工業(yè)的發(fā)展及Kefiran的開(kāi)發(fā)研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

WP,恒天然合作社集團(tuán)有限公司;Kefiran,本實(shí)驗(yàn)室提取自開(kāi)菲爾發(fā)酵乳[6]。

1.2 儀器與設(shè)備

Nano-ZS90激光粒度儀,英國(guó)馬爾文公司;TM400SEM掃描電鏡,日立高新技術(shù)那珂事業(yè)所;FL970Plus熒光分光光度計(jì),上海天美有限公司;T6-新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度儀,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;DHR-2 DHR流變儀,美國(guó)TA Instruments公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Kefiran/WP混合溶液的制備

WP溶液為10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù));Kefiran/WP溶液是含有10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的WP和2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的Kefiran。28 ℃的恒溫磁力攪拌水浴1.5 h后取出。及時(shí)進(jìn)行以下試驗(yàn)。

1.3.2 粒徑測(cè)定

將樣品在通用分析模式下進(jìn)行粒徑測(cè)定。條件為分散劑為水的折射率為1.333,樣品顆粒的折射率為1.520,波長(zhǎng)為633 nm,每個(gè)樣品測(cè)定3次,得到平均粒徑。

1.3.3 Zeta-電位測(cè)定

將樣品稀釋后置于激光粒度儀中進(jìn)行Zeta-電位的測(cè)定。溫度25 ℃,每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

采用體積分布進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),分別選取d(0.1)、d(0.5)、d(0.9)及峰的分布寬度[7]進(jìn)行表示。分布寬度的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:d(0.1)、d(0.5)、d(0.9)分別表示樣品的累計(jì)粒徑分布數(shù)達(dá)到10%、50%、90%時(shí)所對(duì)應(yīng)的粒徑。

1.3.4 紫外/可見(jiàn)光譜掃描

將樣品置于石英比色皿中用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。溫度25 ℃,掃描波長(zhǎng)220～400 nm,采樣間隔1 nm,每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

1.3.5 內(nèi)源性熒光光譜的測(cè)定

將樣品置于專用比色皿中用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。溫度25 ℃,激發(fā)波長(zhǎng)295 nm,掃描范圍310～440 nm,掃描速率240 nm/min,采樣間隔1 nm,每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

1.3.6 流變學(xué)特性研究

采用DHR流變儀對(duì)不同樣品溶液進(jìn)行流變學(xué)特性研究。通過(guò)在10～1 000 s-1剪切速率下測(cè)定黏度的變化。通過(guò)應(yīng)力掃描觀察儲(chǔ)能模量(G′)和損耗模量(G″)的變化。通過(guò)0.1～100 Hz剪切振蕩頻率下測(cè)定表觀黏度的變化。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)用Design-Expert 13分析軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析,所有數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 23統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析,之后用origin 2019b軟件進(jìn)行做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 粒徑測(cè)定

粒徑分布情況可以反映溶液中多糖和蛋白質(zhì)的相互作用,也是判斷溶液是否均一的重要指標(biāo)[8]。粒度的累積分布圖表示顆粒從最小到某一代表粒徑值范圍內(nèi)的顆粒占總的顆粒的百分比含量。d(0.1)表示粒度累積分布(0～100%)中10%所對(duì)應(yīng)的直徑,d(0.5)和d(0.9)同理,其中d(0.5)是中值粒徑,是粒度大小的典型值。D[3,2]表面積加權(quán)平均粒徑,D[4,3]體積加權(quán)平均粒徑,兩者差值表明顆粒的規(guī)則度及分布狀態(tài)。均勻性系數(shù)越高說(shuō)明顆粒越集中,粒度分布范圍越窄,表示樣品中顆粒分布的均勻性越好,反之則越分散。

從圖1、表1和表2中可以看出,Kefiran粒徑<0.57 μm的占到10%;<0.76 μm的占到50%;<1 μm的占到90%;WP粒徑<0.08 μm的占到10%;<0.17 μm的占到50%;<0.75 μm的占到90%;Kefiran/WP(1∶5)粒徑<0.12 μm的占到10%;<7 μm的占到50%;<69.9 μm的占到90%,且7組實(shí)驗(yàn)樣品中,d(0.1),d(0.5)和d(0.9)的含量均存在顯著差異(P<0.05)。KefiranD[3,2]和D[4,3]的差值為0.037 μm,峰分布寬度為0.558,d(0.5)為0.765 μm,說(shuō)明2% Kefiran溶液中多糖顆粒的形狀相對(duì)比較規(guī)則,50%的顆粒粒徑集中于 0.765 μm左右。與Kefiran相比,10% WP溶液和2% WP溶液中蛋白顆粒粒度分布較寬,50%的顆粒粒徑分別集中于0.173 μm和0.167 μm左右,相差不大。但考慮10% WP溶液殘差值<3%,理論光強(qiáng)和實(shí)際光強(qiáng)信號(hào)良好匹配<1%,因此,后期混合樣品采用10% WP溶液。

表1 不同溶液粒徑累計(jì)分布結(jié)果

表2 不同溶液的表面積和體積的加權(quán)平均粒徑及均勻性系數(shù)

圖1 不同溶液的粒徑分布

WP與Kefiran帶相同電荷,由于熱力不相容現(xiàn)象[9],混合溶液中形成了WP分散相和Kefiran分散相,蛋白質(zhì)肽鏈和暴露出來(lái)的疏水基團(tuán)由于靜電相互作用和疏水相互作用形成聚集體,導(dǎo)致Kefiran/WP溶液粒徑增大。因此,2% Kefiran溶液與10% WP混合后,粒度分布較2% Kefiran溶液和10% WP溶液變大。其中,Kefiran/WP(1∶5)粒度分布大于其他3種混合樣品,峰的分布寬度較其他3種混合樣品寬(P<0.05),50%粒徑集中于7.043 μm左右。且Kefiran/WP(1∶5)均勻性系數(shù)明顯高于其他3種混合樣品(P<0.05),說(shuō)明Kefiran/WP(1∶5)混合樣品中顆粒分布的均勻性較好。因此,后期以Kefiran/WP(1∶5)混合樣品為研究對(duì)象,進(jìn)行Kefiran和WP互作關(guān)系的進(jìn)一步研究。

2.2 Zeta-電位測(cè)定

Zeta-電位用來(lái)測(cè)定樣品的表面電荷密度以及帶電性質(zhì),也可以用來(lái)反映WP和多糖之間的靜電作用程度,進(jìn)一步反映溶液的穩(wěn)定性[10]。Kefiran電位值為-2.09 mV,WP的Zeta電位值約為-30.37 mV,混合溶液Kefiran/WP的Zeta-電位均處于Kefiran與WP之間,為-24.47 mV,混合溶液的Zeta電位值為-20 ～-30 mV(圖2),屬于比較穩(wěn)定的溶液,這一現(xiàn)象與MA等[11]的研究結(jié)果類似。

圖2 不同溶液的Zeta-電位的影響

2.3 紫外/可見(jiàn)光譜掃描

為了進(jìn)一步分析乳蛋白與多糖之間的相互作用,分別測(cè)定了不同樣品溶液的紫外光譜圖,如圖3所示,紫外-可見(jiàn)吸收光譜在280 nm處可觀察到特征吸收峰,吸收峰主要由芳香族氨基酸生色團(tuán)(色氨酸吲哚環(huán)和酪氨酸苯環(huán))的π-π*躍遷所致。從圖3和圖4可以看出,不同樣品溶液的最大吸收波長(zhǎng)以及紫外吸收強(qiáng)度均發(fā)生了變化,可能是由于蛋白質(zhì)肽鏈展開(kāi),含有共軛雙鍵的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸暴露出來(lái)導(dǎo)致發(fā)生了變化[12]。在Kefiran/WP混合體系中,Kefiran/WP混合溶液的吸收峰強(qiáng)度降低,最大吸收峰相比于WP發(fā)生紅移,這可能是因?yàn)榧尤氲腒efiran與蛋白質(zhì)結(jié)合,導(dǎo)致疏水氨基酸基團(tuán)被包裹[13]。

圖3 不同溶液的紫外光譜圖

圖4 不同溶液的內(nèi)源性熒光光譜圖

2.4 內(nèi)源性熒光光譜的測(cè)定

內(nèi)源性熒光光譜可以通過(guò)分析蛋白質(zhì)的熒光基團(tuán)酪氨酸殘基和色氨酸殘基微環(huán)境的變化,觀察熒光強(qiáng)度及最大發(fā)射波長(zhǎng)的變化,反應(yīng)出蛋白質(zhì)和多糖結(jié)合后三級(jí)結(jié)構(gòu)和極性發(fā)生的變化[14]。

在Kefiran/WP混合體系中,WP溶液的熒光強(qiáng)度最強(qiáng),Kefiran的加入減弱了WP中色氨酸殘基的疏水作用[15],導(dǎo)致Kefiran/WP混合溶液的熒光強(qiáng)度顯著降低,Kefiran/WP混合溶液的最大發(fā)射波長(zhǎng)比WP向低波段移動(dòng)了5 nm。

由圖4可知,WP的最大熒光峰出現(xiàn)在326 nm處,表明色氨酸存在于蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)中,被非極性氨基酸包圍[16]。與WP溶液相比,Kefiran/WP混合溶液最大發(fā)射波長(zhǎng)熒光強(qiáng)度降幅明顯,且最大發(fā)射波長(zhǎng)向低波段波長(zhǎng)方向移動(dòng),表明蛋白質(zhì)色氨酸殘基附近的疏水作用逐漸減弱,使熒光強(qiáng)度降低。

2.5 掃描電鏡結(jié)果

不同樣品凍干后微觀結(jié)構(gòu)如圖5所示,WP的微觀結(jié)構(gòu)為大小較為均一、表面粗糙疏松的顆粒狀結(jié)構(gòu)(圖5-a),與Kefiran表面光滑具有薄膜特點(diǎn)、結(jié)構(gòu)疏松(圖5-b)、間或呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)相比,通過(guò)電鏡圖片觀察到Kefian-WP的結(jié)構(gòu)呈碎片狀、表面緊密光滑(圖5-c)。同樣,ZHAO等[15]發(fā)現(xiàn)陰離子多糖可以通過(guò)共價(jià)相互作用使WP的不同球狀顆粒轉(zhuǎn)變?yōu)楦o密和光滑的結(jié)構(gòu)。說(shuō)明Kefiran與WP在中性水相介質(zhì)中可形成聚合物結(jié)構(gòu)。

a-WP;b-Kefiran;c-Kefiran/WP

2.6 流變學(xué)特性

2.6.1 剪切性質(zhì)分析

圖6顯示了在剪切速率范圍(10～1 000 s-1)內(nèi),不同樣品溶液的黏度與剪切速率的關(guān)系。當(dāng)剪切速率較低時(shí),Kefiran/WP混合溶液和WP溶液的黏度隨著剪切速率的增加而減小,體現(xiàn)出假塑性和剪切稀釋的流動(dòng)特征;剪切速率較高時(shí),隨著剪切速率的增加表現(xiàn)為恒定的理想牛頓流體行為。Kefiran/WP混合溶液的黏度值高于單一WP體系的黏度值,這是因?yàn)镵efiran可以增加溶液的黏度,這與PIERMARIA等[17]和MORADI等[18]的結(jié)果一致。

圖6 不同溶液剪切速率與黏度的關(guān)系

穩(wěn)定狀態(tài)下測(cè)量不同溶液表觀黏度如圖7所示。在混合體系中,Kefiran/WP比WP的表觀黏度更高,溶液表觀黏度由于Kefiran的加入而增加,這一事實(shí)表明多糖在混合體系中起主導(dǎo)作用[19]。這有利于乳狀液產(chǎn)品貯藏、運(yùn)輸及貨架期期間的穩(wěn)定性。

圖7 不同溶液表觀黏度變化

2.6.2 動(dòng)態(tài)力學(xué)分析

2.6.2.1 應(yīng)變掃描

圖8顯示對(duì)不同樣品進(jìn)行應(yīng)變掃描測(cè)試的結(jié)果。G′是用于表示剪切過(guò)程中樣品中貯存的可逆能量,表示樣品的彈性尺度[20];G″表示不可逆的衰減的剪切能部分,表示樣品的黏性行為。可以觀察到2個(gè)不同區(qū)域:G′和G″保持恒定的是線性黏彈性區(qū)域,此范圍內(nèi)結(jié)構(gòu)中的變形是可逆的;G′和G″發(fā)生變化的是非線性區(qū)域[21]。所有溶液在線性黏彈性區(qū)都表現(xiàn)出G′值大于G″值的弱黏彈性凝膠特征,這與SUN等[19]和PRASANNA等[22]的結(jié)果相一致。在Kefiran/WP混合體系中,Kefiran-WP混合溶液的應(yīng)變值略高于WP的應(yīng)變值,是因?yàn)樵贙efiran/WP混合溶液中存在耗盡(depletion)相互作用[17]。耗盡力是膠體系統(tǒng)中一種廣泛存在的相互作,指尺寸不同的球體相混時(shí),存在促進(jìn)大球聚集的體積排除熵。通過(guò)增強(qiáng)耗盡效應(yīng)來(lái)促使高分子達(dá)到預(yù)定的有序排列。因此,Kefiran可能會(huì)使蛋白質(zhì)聚集體之間產(chǎn)生新的相互作用,促使凝膠性增強(qiáng)。從剪切性質(zhì)分析結(jié)果也可以看出(圖6),隨著多糖的加入,體系黏度增強(qiáng),這在一定程度上可以提高食品體系的凝膠穩(wěn)定性,增強(qiáng)體系的保水性,從而改善食品的口感和組織特性及發(fā)酵乳產(chǎn)品運(yùn)輸期或貨架期乳清析出問(wèn)題。

圖8 應(yīng)變對(duì)不同溶液黏彈性的影響

2.6.2.2 頻率掃描

圖9為測(cè)試了不同樣品溶液不同振動(dòng)頻率時(shí)的黏彈性,可以進(jìn)一步從微觀結(jié)構(gòu)運(yùn)動(dòng)的角度了解不同溶液體系的性能。隨著剪切振蕩頻率的增加不同溶液的G′和G″都表現(xiàn)出不同程度的升高。在Kefiran/WP混合體系中,WP和Kefiran/WP混合溶液均表現(xiàn)出在低頻率時(shí)G′均低于其G″,隨著頻率的升高出現(xiàn)G″高于G′的變化,G″與G′相同時(shí)的頻率稱為交叉頻率[23]。頻率低于交叉頻率時(shí),表現(xiàn)為黏性性質(zhì)(G″>G′);頻率高于交叉頻率時(shí),表現(xiàn)為彈性性質(zhì)(G″

圖9 頻率對(duì)不同溶液黏彈性的影響

3 結(jié)論

在Kefiran/WP混合體系中加入Kefiran均使體系的粒徑增大,結(jié)構(gòu)呈碎片狀、表面緊密光滑。電位的絕對(duì)值減小,表觀黏度增加以及黏彈性的增強(qiáng)。Kefiran/WP混合體系中,Kefiran與WP的相互作用導(dǎo)致粒徑的增大以及電位絕對(duì)值減小。Kefiran本身不可忽略的增稠作用導(dǎo)致表觀黏度的增加。Kefiran與WP之間的耗盡作用使黏彈性及凝膠特性增強(qiáng),而在頻率變化時(shí)表現(xiàn)出明顯的頻率依賴性。通過(guò)調(diào)節(jié)或增強(qiáng)Kefiran與WP的耗盡力,可以廣泛用于改善或提高產(chǎn)品品質(zhì)。

目前,除蛋白-多糖復(fù)合物的凝膠性、乳化性、起泡性等特性在食品加工等方面的研究之外,研究者以蛋白-多糖復(fù)合體系作為載體進(jìn)行功能因子包埋和保護(hù)及生物活性物質(zhì)的遞送;利用蛋白-多糖復(fù)合來(lái)制備可食用薄膜和涂層,以期在食品保護(hù)和貯藏中實(shí)現(xiàn)創(chuàng)新應(yīng)用等方面也已廣泛開(kāi)展研究。因此通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)和多糖之間的共價(jià)和非共價(jià)相互作用制備功能優(yōu)異的復(fù)合物,在食品與醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。