賀蘭山東麓中部產(chǎn)區(qū)優(yōu)良抗逆葡萄酒乳酸菌的分離篩選及釀酒特性研究

浩楠,唐雅利,邱子軒,趙雨竹,管雪強,劉樹文,4,5,6,7*,石侃,4,5,6,7*

1(西北農(nóng)林科技大學 葡萄酒學院,陜西 楊凌,712100)2(山東省葡萄研究院,山東 濟南,250100) 3(山東省釀酒葡萄與葡萄酒技術創(chuàng)新中心,山東 濟南,250100) 4(陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心,陜西 楊凌,712100) 5(國家林業(yè)和草原局葡萄與葡萄酒工程技術研究中心,陜西 楊凌,712100) 6(西北農(nóng)林科技大學,合陽葡萄試驗示范站,陜西 渭南,715300) 7(西北農(nóng)林科技大學,寧夏賀蘭山東麓葡萄酒試驗站,寧夏 永寧,750104)

蘋果酸-乳酸發(fā)酵(malolactic fermentation, MLF)是葡萄酒在酒精發(fā)酵(alcoholic fermentation, AF)結束后,利用乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)將L-蘋果酸降解為L-乳酸和CO2的過程[1]。不僅可以降低酸度、提高微生物穩(wěn)定性,還可以改善口感、增加風味復雜性[2],是優(yōu)質葡萄酒釀造中不可缺少的工藝技術。在自然條件下,啟動和完成MLF依賴于葡萄酒中存在的釀酒乳酸菌,但這會導致MLF時間延長、無法預測發(fā)酵過程、葡萄酒變質等一系列問題。因此,篩選具有優(yōu)良性能的乳酸菌對葡萄酒的釀造具有重要意義。

酒類酒球菌,因其對高乙醇體積分數(shù)(>10%)、低pH值(pH<3.5)的葡萄酒環(huán)境有更好的耐受性而成為葡萄酒進行MLF的主導菌[3],研究發(fā)現(xiàn)它在MLF過程中會釋放次級代謝產(chǎn)物,如酯類、高級醇、羰基化合物、揮發(fā)性脂肪酸和硫磺化合物[4]等,從而影響葡萄酒的香氣和口感。目前,國內多數(shù)酒廠采用接種商業(yè)乳酸菌發(fā)酵劑以確保MLF正常、有效地完成。但這些商業(yè)發(fā)酵劑多來自國外,會造成國內葡萄酒同質化嚴重,不利于國產(chǎn)葡萄酒的發(fā)展[5]。此外,研究表明本土微生物菌株有助于展現(xiàn)葡萄酒獨特的風土特色[6],本土微生物菌群、發(fā)酵性能和葡萄酒特征之間存在特定的聯(lián)系[7]。因此,篩選具有區(qū)域特色的本土蘋果酸乳酸發(fā)酵劑,能更好地適應產(chǎn)區(qū)、特定產(chǎn)品和生產(chǎn)技術,對呈現(xiàn)和塑造具有中國葡萄酒區(qū)域特色的葡萄酒有積極的影響。

寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)是我國釀酒葡萄的主要種植區(qū)之一,具有優(yōu)越的地理位置、獨特的氣候與豐富的本土微生物群落,有待科研人員與葡萄酒釀造師的開發(fā)與利用。本試驗采用脅迫酸性番茄(acid tomato juice medium,ATB)培養(yǎng)基從寧夏賀蘭山東麓中部產(chǎn)區(qū)處于自然蘋乳發(fā)酵的葡萄酒中分離得到優(yōu)良抗逆葡萄酒乳酸菌,對其進行分子生物學鑒定、蘋果酸降解試驗和菌株安全性分析,并以商業(yè)菌株酒類酒球菌(Oenococcusoeni)31-DH與優(yōu)良自篩菌株O.oeniSD-2a為對照進行MLF,分析篩選菌株的蘋果酸代謝能力及對葡萄酒基本理化指標和香氣成分等品質的影響,進而探討優(yōu)良抗逆葡萄酒乳酸菌在葡萄酒釀造中的應用潛力,為寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)釀造具有本土特色的葡萄酒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

本試驗所用葡萄酒樣采樣于2020年10月寧夏賀蘭山東麓中部子產(chǎn)區(qū),釀造實驗所用葡萄采摘自張裕摩塞爾十五世酒莊,2021年赤霞珠,含糖量約為25.4～25.8°Brix。

1.1.2 藥品與試劑

釀酒酵母(CECA),安琪酵母股份有限公司;對照乳酸菌2株:商業(yè)菌株O.oeni31-DH,中國食品工業(yè)研究院;優(yōu)良自篩菌株O.oeniSD-2a,西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院實驗室保存;放線菌酮,北京Solarbio科技有限公司;萬古霉素,上海源葉生物公司;果膠酶(Cuvee Blanc),法國Lallemand公司;2-辛醇(色譜純),美國Sigma公司;L-蘋果酸測定試劑盒,阿拉丁試劑(上海)有限公司;蛋白胨、酵母浸粉等其他試劑,西隴科學股份有限公司;Gel signalTM Red核酸染料,上海勤翔科學儀器有限公司;2×TaqMaster Mix酶、Lysis Buffer、DL2000 DNA marker,大連TaKara公司。

1.2 儀器與設備

Cary 60 UV-Vis紫外分光光度計,美國Agilent Technologies公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司;pH計,上海儀電科學儀器股份有限公司;Bio-Rad C1000基因擴增儀,美國Bio-Rad公司;MIKRO-200R臺式高速離心機,德國Hettich科學儀器公司;ChampGel 500 plus全自動凝膠成像系統(tǒng),北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司;JY-300HC電泳儀,北京君意東方電泳設備有限公司;SX-500高壓蒸汽滅菌鍋,日本TOMY公司;Y15葡萄酒全自動分析儀,西班牙BioSystems S.A.公司;QP2020氣象色譜-質譜聯(lián)用儀、色譜柱DB-WAX(60 m×0.25 mm×0.25 μm),日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 抗逆葡萄酒乳酸菌的分離篩選

1.3.1.1 培養(yǎng)基的配制

ATB液體培養(yǎng)基[8]:葡萄糖10 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母浸粉5 g/L,蘋果酸1 g/L,硫酸鎂0.2 g/L,硫酸錳0.05 g/L,L-鹽酸半胱氨酸0.5 g/L,番茄汁25%(體積分數(shù)),加水定容至1 L,用1 mol/L NaOH調pH值至4.8,115 ℃滅菌30 min。ATB固體培養(yǎng)基:在ATB液體培養(yǎng)基基礎上加入20 g/L瓊脂。ATB分離固體培養(yǎng)基:將滅菌后的ATB固體培養(yǎng)基放置至60 ℃左右,添加100 mg/L放線菌酮和50 mg/L萬古霉素,搖晃均勻。

1.3.1.2 葡萄酒乳酸菌的分離

將酒精發(fā)酵后的葡萄酒酒樣放置在20 ℃培養(yǎng)箱中進行MLF,同時利用紙層析法[9]監(jiān)測MLF過程。每3 d取酒樣10 mL,將酒樣以梯度10-1～10-7用生理鹽水稀釋后,吸取100 μL于ATB分離固體培養(yǎng)基涂布培養(yǎng),26 ℃條件下培養(yǎng)9～11 d。挑取白色、菌落直徑小于1 mm的單菌落進行劃線純化培養(yǎng)[10]。將純化后的單菌落轉接至ATB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期,甘油管保存于-80 ℃冰箱備用。

1.3.1.3 葡萄酒乳酸菌抗逆篩選

將篩選出的所有原始菌株活化兩次至對數(shù)生長期,并接種至ATB脅迫培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h并測定OD600值,篩選在脅迫條件中OD600≥0.3的菌株,即獲得具有一定抗逆性的葡萄酒乳酸菌,而OD600<0.3或無法在脅迫培養(yǎng)基中生長的菌株被視為無抗逆性乳酸菌。

ATB脅迫培養(yǎng)基:在ATB液體培養(yǎng)基基礎上調整pH值與乙醇體積分數(shù),分別為:(1)pH 3.2,乙醇體積分數(shù)10%;(2)pH 3.2,乙醇體積分數(shù)11%;(3)pH 3.4,乙醇體積分數(shù)10%;(4)pH 3.4,乙醇體積分數(shù)11%。

1.3.2 分子生物學鑒定

抗逆優(yōu)良菌株的分子生物學鑒定采用種屬特異性聚合酶鏈反應(sequence specific polymerase chain reaction,SSP)進行擴增[11],引物分別為:上游OE1(5′-TAATGTGGTTCTTGAGGAGAAAAT-3′),下游OE2(5′-ATCATCGTCAAACAAGAGGCCTT-3′),并使用單一引物3R(3′-ACGCAGGCAC-5′)進行隨機擴增多態(tài)性(random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction, RAPD-PCR)分析[12]。

1.3.3 菌株安全性鑒定

抗逆優(yōu)良菌株的生物胺(biogenic amine,BA)功能性基因的鑒定:參考COTON等[13]和趙艷卓等[14]方法進行擴增,特異性引物分別為:組氨酸脫羧酶(hdc):上游(F-GATGGTATTGTTTCKTATGA),下游(R-CCAAACACCAGCATCTTC);鳥氨酸脫羧酶(odc):上游(F-GTNTTYAAYGCNGAYAARACNTAYTTYGT),下游(R-TACRCARAATACTCCNGGNGGRTANGG);酪氨酸脫羧酶(tdc):上游(F-CCRTARTCNGGNATAGCRAARTCNGTRTG),下游(R-GAYATNATNGGNATNGGNYTNGAYCARG)。

上述PCR產(chǎn)物送至北京奧克鼎盛生物公司進行測序,測序后其結果提交https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進行比對分析以驗證PCR產(chǎn)物的特異性。

1.3.4 低pH與高乙醇濃度模擬環(huán)境發(fā)酵試驗

1.3.4.1 模擬酒的配制[15]

葡萄汁10 mL/L;D-葡萄糖2 g/L;D-果糖2 g/L;NaCl 0.2 g/L;(NH4)2SO41 g/L;K2HPO42 g/L;MnSO4·H2O 0.05 g/L;MgSO4·7H2O 0.2 g/L;酵母浸粉4 g/L;L-蘋果酸 3 g/L;用1 mol/L NaOH或HCl調整pH值,115 ℃滅菌30 min,滅菌后加入無水乙醇。高乙醇體積分數(shù)模擬酒:pH 3.8,乙醇體積分數(shù)14%;低pH模擬酒:pH 3.2,乙醇體積分數(shù)10%。

1.3.4.2L-蘋果酸含量的測定

分別使用優(yōu)良抗逆菌株和對照菌株31-DH與SD-2a在上述兩種模擬酒中進行MLF,同時采用紙層析法[9]監(jiān)測L-蘋果酸分解情況。每隔2 d取樣,然后將樣品置于80 ℃水浴鍋中15 min后10 000 r/min離心3 min,取上清液用于后續(xù)L-蘋果酸測定。根據(jù)L-蘋果酸試劑盒說明書,使用Y15葡萄酒全自動分析儀檢測。

1.3.4.3 乳酸菌生物量監(jiān)測

分別將優(yōu)良抗逆菌株和對照菌株31-DH與SD-2a以107CFU/mL接種至上述兩種模擬酒中,采用平板計數(shù)法[10]進行活菌計數(shù)。每隔2 d取樣,用生理鹽水稀釋為10-1～10-7菌懸液,吸取100 μL 10-4～10-7菌液涂布于ATB固體培養(yǎng)基上,26 ℃培養(yǎng)5～7 d后進行菌落總數(shù)計數(shù),以菌落形成單位(CFU/mL)表示。

1.3.5 釀造試驗

將上述篩選的優(yōu)良抗逆菌株和對照菌株31-DH與SD-2a以108CFU/mL、5%的接種量接種至酒精發(fā)酵結束的赤霞珠葡萄酒中進行MLF,發(fā)酵溫度 20 ℃,同時采用紙層析法對發(fā)酵過程中L-蘋果酸代謝情況進行監(jiān)測,待層析紙上L-蘋果酸斑點消失表明MLF完畢。

1.3.5.1L-蘋果酸代謝能力的測定

在赤霞珠葡萄酒中接種優(yōu)良抗逆菌株和對照菌株進行MLF的過程中,每隔1 d取酒樣直至MLF發(fā)酵結束。然后將樣品按照1.3.4.2節(jié)的方法進行處理后,根據(jù)L-蘋果酸試劑盒說明書,使用Y15葡萄酒全自動分析儀檢測。

1.3.5.2 葡萄酒基本理化指標的測定

葡萄酒的酒精度、殘?zhí)?、總酸、揮發(fā)酸、pH值等基本理化指標采用GB/T 15038—2006 《葡萄酒、果酒通用分析方法方法》。

1.3.5.3 葡萄酒香氣成分的測定

參照余東亮[8]的方法稍作修改測定葡萄酒香氣成分。

固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)香氣富集:取8 mL酒樣于頂空瓶,加2.0 g的NaCl和20 μL 2-辛醇(質量濃度為0.016 g/L),在恒溫磁力攪拌器40 ℃條件下攪拌30 min,然后將萃取頭插入玻璃瓶進行30 min頂空萃取,進入GC-MS分析儀進行揮發(fā)性化合物檢測。

定性分析:采用NIST17質譜庫檢索、標準香氣成分保留時間比對與手動檢索矯正相結合,進行定性分析。

定量分析:將2-辛醇作為內標,采用內標-標準曲線法進行定量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2019進行計算,GraphPad Prism 9進行相關圖表繪制,SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析、單因素方差分析、主成分分析(principal component analysis, PCA)等。

2 結果與分析

2.1 抗逆葡萄酒乳酸菌的分離篩選

利用涂布法將稀釋后的葡萄酒樣品涂布于ATB分離固體培養(yǎng)基上,經(jīng)劃線純化后最終從酒樣中分離出了388個菌株,并根據(jù)不同葡萄品種和酒莊進行編號,見表1。菌株形態(tài)為白色表面光滑且直徑小于1 mm 的菌落,符合文獻[16]描述。

表1 酒樣來源及菌株編號

將上述初步分離篩選的388株菌株接種至4種ATB脅迫培養(yǎng)基中進行菌株抗逆性篩選,結果發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)72 h后僅有8株菌株的OD600≥0.3,分別是XMN18、XM12、XM16、BM43、BM68、BM79、XC22-N-3、XC22-N-19(數(shù)據(jù)未顯示)。

2.2 菌株的分子生物學鑒定

對上述篩選獲得的8株優(yōu)良抗逆乳酸菌進行分子生物學鑒定。

2.2.1 SSP鑒定

凝膠電泳檢測8株菌株的PCR擴增產(chǎn)物,結果如圖1所示,所有乳酸菌均能擴增出單一條帶(1 025 bp),初步鑒定8株抗逆乳酸菌均為酒類酒球菌。

1-XMN18;2-XM12;3-XM16;4-BM43;5-BM68;6-BM79;7-XC22-N-3;8-XC22-N-19;M-DL2000 DNA Marker

2.2.2 RAPD-PCR分析

選用3R引物,對8株優(yōu)良抗逆酒類酒球菌和2株對照菌株進行了RAPD-PCR分析,如圖2所示,菌株的擴增片段數(shù)量各不相同,BM79與XC22-N-3擴增到5條片段,XMN18與XM16擴增得到4條片段,XC22-N-19擴增到3條片段,XM12與BM68擴增到2條片段,BM43擴增到1條片段。所有菌株擴增得到的片段長度在500～2 000 bp,且10株菌株之間擴增片段大小各不相同,XMN18和XM16雖然均擴增出4條片段,但XMN18其中的3條集中在750～1 000 bp,而XM16集中在500～750 bp,說明這些菌株的基因組DNA具有多態(tài)性。

1-SD-2a;2-31-DH;3-XMN18;4-XM12;5-XM16;6-BM43;7-BM68;8-BM79;9-XC22-N-3;10-XC22-N-19;M-DL2000 DNA Marker

2.3 菌株產(chǎn)生物胺風險分析

葡萄酒中最常見的生物胺是腐胺、組胺和酪胺,這些化合物主要由它們各自的氨基酸前體(鳥氨酸、組氨酸和酪氨酸)經(jīng)特異性脫羧酶作用而形成[17]。研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌的生長代謝是葡萄酒中生物胺的主要來源,產(chǎn)生生物胺的能力可能與菌株相關,而不是某種物種特有的[18]。優(yōu)良抗逆菌株的生物胺相關基因分析結果如圖3所示,通過檢測合成組胺、酪胺和腐胺的功能性基因(hdc、tdc、odc)結果如圖3所示,優(yōu)良抗逆酒類酒球菌均未擴增出生物胺相關功能性基因條帶,表明菌株不具有產(chǎn)生生物胺的能力。

M-DL5000 DNA Marker;1-XMN18;2-XM12;3-XM16;4-BM43;5-BM68;6-BM79;7-XC22-N-3;8-XC22-N-19

2.4 低pH與高乙醇濃度模擬環(huán)境MLF能力分析

葡萄酒中乙醇的濃度是抑制乳酸菌生長主要因素,研究發(fā)現(xiàn)當乙醇體積分數(shù)大于10%時對菌株有抑制作用[19]。優(yōu)良抗逆菌株在pH 3.8、乙醇體積分數(shù)14%模擬酒中的L-蘋果酸代謝能力和活菌數(shù)變化如圖4-A、圖4-C所示,與優(yōu)良自篩菌株SD-2a(第4天)和商業(yè)菌株31-DH(第6天)比較,XMN18和BM68在發(fā)酵的第4天均完成MLF,且活菌數(shù)維持在107CFU/mL。前期L-蘋果酸代謝速度最快的是XMN18,在0～2 d時降解了1.76 g/L,其次BM68降解了1.48 g/L,兩者發(fā)酵速度較SD-2a(1.33 g/L)和31-DH(0.99 g/L)顯著快。另外,XM12和XM16表現(xiàn)相似,在0～2 d時降解了0.85 g/L,但在發(fā)酵的第6天L-蘋果酸含量仍維持在1 g/L,且活菌數(shù)僅維持在104CFU/mL。BM43、BM79、XC22-N-3、XC22-N-9對酒精的耐受性較差,在發(fā)酵第6天菌株的活菌數(shù)均低于105CFU/mL,特別是BM43,在發(fā)酵的第6天L-蘋果酸含量僅減少了1.07 g/L。說明菌株對乙醇的耐受能力有所不同,這與學者研究一致,研究內容表明高乙醇濃度對菌株的生長有一定的抑制作用[19]。除此之外,優(yōu)良抗逆菌株在pH 3.2、乙醇體積分數(shù)10%模擬酒中的L-蘋果酸代謝能力和活菌數(shù)變化如圖4-B、圖4-D所示,與優(yōu)良自篩菌株SD-2a(第4天)和商業(yè)菌株31-DH(第4天)比較,所有優(yōu)良抗逆菌株均能完成MLF,且活菌數(shù)維持在106～107CFU/mL。其中,XM12發(fā)酵速度最快,其次是BM68,在發(fā)酵的第2天均完全代謝L-蘋果酸。除XC22-N-3之外,其余優(yōu)良抗逆菌株在發(fā)酵的第2天可代謝L-蘋果酸至0.4 g/L以下。另外,在發(fā)酵初期只有XMN18和BM68活菌數(shù)升高,說明相比于其他菌株,XMN18和BM68更耐低酸環(huán)境?？傊?篩選獲得的優(yōu)良抗逆菌株均能在低酸脅迫環(huán)境中快速代謝L-蘋果酸完成MLF,而只有XMN18和BM68才能較好的適應高乙醇濃度的脅迫環(huán)境。

A-pH 3.8、14%(乙醇體積分數(shù))下菌株的L-蘋果酸代謝;B- pH 3.2、10%(乙醇體積分數(shù))下菌株的L-蘋果酸代謝;C-pH 3.8、14%(乙醇體積分數(shù))下菌株的活菌數(shù)變化;D-pH 3.2、10%(乙醇體積分數(shù))下菌株的活菌數(shù)變化

2.5 優(yōu)良菌株釀造試驗分析

2.5.1L-蘋果酸代謝能力

將8株優(yōu)良抗逆酒類酒球菌接種至葡萄酒(L-蘋果酸含量為1.34 g/L)中,在整個MLF過程中對菌株代謝L-蘋果酸的能力進行監(jiān)測。由圖5可知,葡萄酒中L-蘋果酸的含量隨著發(fā)酵時間的延長而逐漸減少,8株優(yōu)良抗逆酒類酒球菌均可以完全代謝L-蘋果酸(<0.2 g/L)完成MLF。與優(yōu)良自篩菌株SD-2a(第4天)和商業(yè)菌株31-DH(第4天)比較,XMN18和BM68代謝L-蘋果酸最快,在發(fā)酵的第3天完成MLF,其次是XM12在發(fā)酵的第4天完成MLF,接著是XM16在發(fā)酵的第5天完成MLF,剩余菌株則是在發(fā)酵的第6天完成MLF。結果表明,優(yōu)良抗逆酒類酒球菌在葡萄酒中具有較好的L-蘋果酸代謝能力。此外,與上述pH 3.8、乙醇體積分數(shù)14%模擬酒中優(yōu)良抗逆菌株的L-蘋果酸代謝能力比較,雖然模擬酒和葡萄酒的pH值與乙醇濃度相同,但在模擬酒中XM12、XM16、BM43、BM79、XC22-N-3、XC22-N-9沒有完全代謝L-蘋果酸而在葡萄酒中均完成了MLF,可能是由于葡萄酒中存在酵母產(chǎn)生的多糖等次級代謝物及葡萄自身含有的微量元素和能量物質等增強了乳酸菌的生長能力,進而提升了其對脅迫環(huán)境的耐受能力[20]。

圖5 優(yōu)良抗逆菌株在葡萄酒中進行MLF的L-蘋果酸代謝能力

2.5.2 葡萄酒基本理化指標分析

表2顯示了MLF后葡萄酒的基本理化指標的變化。與未MLF的葡萄酒比較,MLF后的葡萄酒的pH值隨著總酸的下降而升高0.4～0.6個單位,殘?zhí)橇烤邢陆?揮發(fā)酸含量低于1.20 g/L,符合國家標準。綜上,表明采用8株優(yōu)良抗逆酒類酒球菌進行MLF后的葡萄酒的基本理化指標符合國家標準,菌株在釀造本土特色葡萄酒中具有十分廣闊的應用潛力。

表2 葡萄酒的基本理化指標

2.5.3 菌株對葡萄酒香氣成分的影響

2.5.3.1 葡萄酒的香氣成分分析

采用GC-MS對篩選得到的優(yōu)良抗逆酒類酒球菌MLF后的葡萄酒進行了檢測分析。結果見附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034093),共檢出45種香氣化合物,包括乙酸酯類(5種)、乙酯類(12種)、其他酯類(3種)、高級醇類(8種)、脂肪酸類(5種)、萜烯類(5種)、醛類(4種)、揮發(fā)性酚(2種)、呋喃類(1種),并將對葡萄酒香氣具有貢獻的香氣成分即氣味活性值(odor activity values,OAV)大于0.1的香氣成分進行分析,見表3。結果表明,不同優(yōu)良抗逆菌株發(fā)酵酒樣的香氣物質含量有所差異,與未MLF(酯類66 605.62 μg/L;醛類70.65 μg/L)相比,經(jīng)MLF后酯類物質總含量(88 259.86～143 642.88 μg/L)顯著升高,但醛類物質總含量(15.61～42.56 μg/L)顯著降低,尤其是乳酸乙酯(乳香,黃油;0.11)α-松油醇(百合花香;0.11)和癸酸乙酯、乳酸乙酯(0.1

表3 葡萄酒的OAV(>0.1)及香氣物質描述

2.5.3.2 主成分分析

為了進一步探究優(yōu)良抗逆菌株與香氣化合物之間關系及對葡萄酒香氣成分的整體差異,將上述OAV>0.1的香氣物質進行PCA,如圖6所示,其中PC1占53.69%,PC2占21.97%,兩個主成分的累計方差貢獻率為75.66%,基本可以解釋原變量大多數(shù)的變異信息。優(yōu)良抗逆酒類酒球菌發(fā)酵酒樣香氣成分與未MLF酒樣和對照菌株發(fā)酵酒樣很好的分離開,未MLF酒樣處于PC2的負向端,這個區(qū)域沒有呈現(xiàn)相關物質。對照菌株31-DH和SD-2處于PC1的負向端,主要與乙酸乙酯、丁酸乙酯、苯乙醇、異戊醇、D-檸檬烯的香氣相關,呈現(xiàn)更多香蕉、柑橘、玫瑰花香、溶劑的香氣。而XMN18、XM12、XM16、BM79、XC22-N-3、XC22-N-19分布于PC1和PC2的正向端,主要為酯類(乙酸異戊酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯)和萜烯類(α-松油醇和芳樟醇),使葡萄酒表現(xiàn)更多草莓、香蕉、菠蘿、柑橘、黃油等果香和奶香。此外,BM43和BM68的香氣表現(xiàn)相似,分布于PC1的正向端和PC2的負向端,與香葉醇、癸酸和糠醛相關性較大,主要使葡萄酒呈現(xiàn)更多烘烤味和酸奶酪味,香氣表現(xiàn)單一。

圖6 優(yōu)良抗逆菌株MLF后葡萄酒香氣化合物主成分分析

本試驗通過ATB脅迫培養(yǎng)基篩選的優(yōu)良抗逆菌株均為酒類酒球菌,這與目前的研究結果一致,酒類酒球菌是在葡萄酒進行MLF過程中存在的主要菌株,它具有優(yōu)良的抗脅迫能力,如抗低pH值,高乙醇體積分數(shù),高SO2等[8]。另外,本試驗針對寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)葡萄原料面臨的問題:高糖度(即高酒精度)和高酸度(即低pH值)分別設計兩種模擬酒脅迫環(huán)境以篩選適合寧夏賀蘭山東麓不同子產(chǎn)區(qū)葡萄原料的本土優(yōu)良抗逆乳酸菌,其中XMN18和BM68表現(xiàn)出較好的抗高乙醇體積分數(shù)的能力,而XM12表現(xiàn)出較好的抗低pH能力。酒類酒球菌除了可以代謝L-蘋果酸使葡萄酒的酸澀口感變得柔和,而且在MLF過程中可以產(chǎn)生次級代謝物來提升葡萄酒香氣的復雜性,賦予葡萄酒烘烤味、奶油味和蜂蜜味等香氣[23]。本試驗結果表明,篩選獲得的優(yōu)良抗逆酒類酒球菌發(fā)酵酒樣的香氣物質總含量均高于未MLF酒樣,主要是乙酸異戊酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯、α-松油醇和芳樟醇等香氣物質,可賦予葡萄酒更多草莓、香蕉、菠蘿、柑橘、黃油等果香和奶香香氣。綜上所述,8株優(yōu)良抗逆酒類酒球菌具有良好的抗脅迫能力、L-蘋果酸代謝能力和產(chǎn)香能力,為建立寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)菌種資源及遺傳多樣性提供了菌株樣本,同時為發(fā)展我國本土優(yōu)良乳酸菌、呈現(xiàn)和塑造特色葡萄酒具有重要意義。

3 結論

采用ATB分離培養(yǎng)基從寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)分離篩選獲得388株乳酸菌,經(jīng)抗逆篩選、分子生物學、菌株安全性等鑒定,得到其中8株具有優(yōu)良抗逆性能的酒類酒球菌。

8株優(yōu)良抗逆酒類酒球菌對高乙醇體積分數(shù)(14%)、低pH值(3.2)環(huán)境具有良好的耐受性,可快速代謝L-蘋果酸完成葡萄酒的蘋乳發(fā)酵。

優(yōu)良抗逆酒類酒球菌在葡萄酒中進行MLF,表現(xiàn)出L-蘋果酸代謝速度快,發(fā)酵酒樣香氣含量高,酒香豐盈,有助于本土優(yōu)良乳酸菌的發(fā)展和產(chǎn)區(qū)特色葡萄酒的釀造。