基于3A組裝的多拷貝基因策略?xún)?yōu)化重組水蛭素變體Ⅲ的生產(chǎn)

王亞麗,劉秀霞,楊艷坤,白仲虎*

1(江南大學(xué),糧食發(fā)酵與食品生物制造國(guó)家工程研究中心,江蘇 無(wú)錫,214122) 2(江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫,214122)3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

水蛭素(Hirudin,H)是一種從水蛭唾液中提取的小分子多肽,具有3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵[1]。它能特異性結(jié)合凝血酶,是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)凝血酶天然抑制劑[2]。水蛭素有3種主要亞型,分別為水蛭素變體(Hirudin varidant, Hv)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(Hv1, Hv2, Hv3)[3],它們具有相似的N端核心結(jié)構(gòu)域和對(duì)凝血酶的抑制活性。其中Hv3除了具有抗凝血作用外,在預(yù)防和治療白內(nèi)障方面也表現(xiàn)出巨大潛力[4]。目前,一些水蛭素變體已經(jīng)在大腸桿菌(Escherichiacoli)、乳酸乳球菌、絲狀真菌、轉(zhuǎn)基因植物、酵母菌等[4-10]多種底盤(pán)細(xì)胞中成功表達(dá)。MENDOZA-VEGA等[11]利用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) C13ABYS86表達(dá)Hv2時(shí)產(chǎn)量達(dá)到500 mg/L,但是其發(fā)酵周期長(zhǎng)達(dá)60 h;KIM等[7]利用GAL1啟動(dòng)子在S.cerevisiae中表達(dá)水蛭素,發(fā)酵72 h產(chǎn)量才能達(dá)到62.1 mg/L;MATSUI等[12-13]通過(guò)構(gòu)建豬腺苷酸激酶蛋白與重組水蛭素變體I(recombinant Hirudin varidant I, Rhv1)融合表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)了Rhv1在E.coli中的高水平表達(dá),但是其以包涵體形式存在,產(chǎn)物沒(méi)有活性。HUANG等[4]開(kāi)發(fā)了一種穩(wěn)定表達(dá)Rhv3的方法,并通過(guò)補(bǔ)料分批發(fā)酵使得Rhv3產(chǎn)量達(dá)到915 mg/L。然而S.cerevisiae、轉(zhuǎn)基因植物、絲狀真菌等發(fā)酵周期長(zhǎng);E.Coli具有內(nèi)毒素、純化工藝復(fù)雜,其大規(guī)模生產(chǎn)仍然具有不小的挑戰(zhàn)。

谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是一種高GC含量、無(wú)內(nèi)毒素的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,常被用來(lái)生產(chǎn)氨基酸等小分子物質(zhì)[14-15]。由于其胞外蛋白酶活性低、具有Sec、Tat兩種強(qiáng)大的蛋白分泌體系,被認(rèn)為是一種新型重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。利用C.glutamicum表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組蛋白生產(chǎn)不僅能縮短發(fā)酵周期,而且可以規(guī)避E.coli表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)毒素、純化難的問(wèn)題,降低重組蛋白生產(chǎn)成本。

本研究利用實(shí)驗(yàn)室前期開(kāi)發(fā)的3A組裝系統(tǒng),在C.glutamicun中構(gòu)建以組成型啟動(dòng)子Ptac控制表達(dá)的1～7拷貝Rhv3重組菌株,并且每一個(gè)Rhv3基因的構(gòu)建過(guò)程中將信號(hào)肽進(jìn)行替換,以實(shí)現(xiàn)Rhv3的高效分泌。同時(shí)在Rhv3基因的C端添加6個(gè)組氨酸標(biāo)簽,最終僅需通過(guò)簡(jiǎn)單的Ni2+純化即可獲得高純度Rhv3蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

TaqDNA聚合酶、pfuDNA聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒,CWBIO;限制性?xún)?nèi)切酶、Ligation Mix,TakaRa;牛纖維蛋白原、凝血酶,索萊寶;所有試劑和化學(xué)品均為分析純?cè)噭?/p>

1.1.2 菌株、質(zhì)粒

不同核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome binding site,RBS)-目標(biāo)基因融合質(zhì)粒所用引物見(jiàn)表1。引物合成和測(cè)序由蘇州安升達(dá)完成。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物

本研究中所構(gòu)建菌株如表2所示。

表2 本實(shí)驗(yàn)所用菌株

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5,胰蛋白胨10,NaCl 10,用于培養(yǎng)E.coliDH5α。

LBB培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5,胰蛋白胨10,NaCl 10,腦心浸出液 10,用于C.glutamicumCGMCC1.15647重組菌株培養(yǎng)。

CGXⅡ培養(yǎng)基:葡萄糖 40 g/L;尿素 5 g/L;硫酸銨 20 g/L;K2HPO41 g/L;MgSO4·7H2O 0.25 g/L;CaCl210 mg/L;FeSO4·7H2O 10 mg/L;MnSO4·H2O 10 mg/L;ZnSO4·7H2O 1 mg/L;0.2 mg/L CuSO4;NiCl·6H2O 0.02 mg/L;原兒茶酸30 mg/L;3-嗎啉丙磺酸(3-morpholinopropanesulfoinc acid,MOPs) 42 g/L,用于C.glutamicumCGMCC1.15647重組菌株培養(yǎng)。

BHI培養(yǎng)基:腦心浸出液 37 g/L,用于C.glutamicumCGMCC1.15647重組菌株培養(yǎng)。

1.1.4 儀器與設(shè)備

LongGene A 300 PCR儀,朗基科學(xué)儀器有限公司;DYCZ-24DN電泳儀,北京六一儀器廠(chǎng);MicroPulser電擊轉(zhuǎn)化儀,Bio-Rad (USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單拷貝基因表達(dá)載體構(gòu)建

課題組前期以BioBrick為基礎(chǔ),在C.glutamicum中構(gòu)建了含不同抗性基因的3A組裝系統(tǒng)[16]。克隆質(zhì)粒p3A-Amp、p3A-Kan、p3A-Chlr上含有EcoR I、NheI、SpeI和PstI 4個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)。NheI、SpeI為一組同尾酶,經(jīng)酶切后產(chǎn)生相同的黏性末端。在組裝時(shí)兩個(gè)黏性末端連接,形成不被其中任何限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別的間隔序列(Scar)。

標(biāo)準(zhǔn)化組成型啟動(dòng)子Ptac采用EcoR I、NheI酶切,標(biāo)準(zhǔn)化egfp質(zhì)粒使用SpeI、PstI酶切,標(biāo)準(zhǔn)化p3A-Kan質(zhì)粒使用EcoR I、PstI酶切。經(jīng)80 ℃滅活后,按照4∶4∶1比例連接,構(gòu)建以Ptac控制表達(dá)的單拷貝egfp質(zhì)粒。同樣地,構(gòu)建以Ptac啟動(dòng)子、CspA信號(hào)肽控制分泌表達(dá)的單拷貝Rhv3質(zhì)粒。

1.2.2 多拷貝基因表達(dá)載體構(gòu)建

RBS-egfp質(zhì)粒構(gòu)建:以p3A-egfp-Kan為模板,使用引物3A-RBS-F和p3A-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1-A),將不同RBS序列引入egfp基因ATG之前。獲得的片段使用EcoR I、PstI酶切后,將目的片段連入經(jīng)EcoR I、PstI酶切的p3A-Amp中,得到含不同RBS序列的p3A-RBS-egfp-Amp質(zhì)粒。

A-適用于3A組裝系統(tǒng)的RBS通用引物示意圖;B-基于3A組裝的多拷貝質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

多拷貝egfp質(zhì)粒構(gòu)建:分別利用上述質(zhì)粒與實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的p3A-Ptac-egfp-Kan進(jìn)行3A組裝,獲得含不同RBS序列的兩拷貝egfp表達(dá)質(zhì)粒(圖1-B)。具體操作步驟參照?qǐng)D1-B。

RBS-CgR0949-Rhv3、RBS-PorB-Rhv3、RBS-CspA-Rhv3、RBS-CspB-Rhv3、RBS-Cg1514-Rhv3質(zhì)粒構(gòu)建:分別以p3A-CgR0949-Kan、p3A-PorB-Kan、p3A-CspA-Kan、p3A-CspB-Kan、p3A-Cg1514-Kan為模板,使用引物3A-SD1-F和p3A-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1-A),將RBS1序列引入信號(hào)肽基因CgR0949、PorB、CspA、CspB、Cg1514的ATG之前。得到的片段使用EcoR I、PstI酶切,連接到p3A-Amp中,得到p3A-RBS1-CspA-Amp、p3A-RBS1-CgR0949-Amp。上述質(zhì)粒經(jīng)EcoR I、NheI酶切,標(biāo)準(zhǔn)化Rhv3質(zhì)粒經(jīng)SpeI、PstI酶切,連接至經(jīng)EcoR I、PstI酶切的p3A-Chlr中,獲得p3A-RBS1-CgR0949-Rhv3-Chlr、p3A-RBS1-PorB-Rhv3-Chlr、p3A-RBS1-CspA-Rhv3-Chlr、p3A-RBS1-CspB-Rhv3-Chlr、p3A-RBS1-Cg1514-Rhv3-Chlr(圖1-B)。

多拷貝Rhv3質(zhì)粒構(gòu)建:分別利用上述質(zhì)粒與單拷貝p3A-Ptac-CspA-Rhv3-Chlr進(jìn)行3A組裝,獲得含不同信號(hào)肽序列的兩拷貝Rhv3表達(dá)質(zhì)粒。接著選擇最優(yōu)表達(dá)菌株對(duì)應(yīng)質(zhì)粒按照上述步驟進(jìn)行多輪(×N rounds)構(gòu)建,獲得多拷貝Rhv3表達(dá)質(zhì)粒。具體操作步驟參照?qǐng)D1-B。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

上述質(zhì)粒采用電轉(zhuǎn)化方法引入宿主細(xì)胞C.glutamicumCGMCC1.15647中[17]。

1.2.4egfp熒光強(qiáng)度分析

將含有不同RBS序列的兩拷貝egfp重組菌株接種到24孔板中過(guò)夜培養(yǎng)。按2%接種比例轉(zhuǎn)接到含新鮮LBB培養(yǎng)基的24孔板中發(fā)酵24 h。取待測(cè)菌液0.2 mL,使用培養(yǎng)基將OD600值調(diào)至0.5左右,使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定菌體熒光值(激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為488 nm和507 nm)。最后計(jì)算單位OD600值熒光強(qiáng)度以指示不同RBS翻譯強(qiáng)度。

1.2.5 Rhv3表達(dá)、純化分析

將重組菌接種至含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng),按2%接種比例轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中發(fā)酵24 h后,菌液經(jīng)12 000 r/min離心5 min收集上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

Rhv3蛋白序列C端添加有6個(gè)His-tag,作為純化標(biāo)記。用AKTA中的HisTrap HP色譜柱純化Rhv3-His,蛋白純度用SDS-PAGE分析測(cè)定。

1.2.6 凝血酶滴定

蛋白濃度檢測(cè)采用BSA定量法。分別取0.5 mg/L蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、4、8、12、16、20 μL加入到96孔酶標(biāo)板中,用PBS溶液稀釋上述蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液至終體積為20 μL。同時(shí)取適量樣品加入酶標(biāo)板中,按需將終體積稀釋至20 μL;按照說(shuō)明書(shū)配制BCA標(biāo)準(zhǔn)溶液,并向上述各孔中加入200 μL,放置在37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min;結(jié)束后使用酶標(biāo)儀測(cè)定A595;最后根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度及A595得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),并按此曲線(xiàn)計(jì)算樣品蛋白濃度。

Rhv3活性分析采用凝血酶滴定法。試管中加入200 μL 0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))牛纖維蛋白原及100 μL適量濃度發(fā)酵上清液;接著每隔1 min加入10 μL 50、25、12.5、6.25、3.125 NIH/mL凝血酶溶液,直至觀(guān)察到溶液出現(xiàn)凝結(jié),此時(shí)即為反應(yīng)終點(diǎn)。按照水蛭素與凝血酶1∶1反應(yīng),加入凝血酶的量即為水蛭素抗凝血酶活性(ATU/mL),如公式(1)所示:

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 Rhv3在C.glutamicum中的表達(dá)及活性分析

將構(gòu)建好的p3A-M1-CspA-Rhv3-Chlr質(zhì)粒(圖2-A)電轉(zhuǎn)化入C.glutamicumCGMCC 1.15647中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),取發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果如圖2-B所示,在15 kDa處出現(xiàn)明顯的蛋白條帶。與理論值(8 kDa)相比,目標(biāo)條帶大小接近理論值的2倍,猜測(cè)可能是因?yàn)?個(gè)蛋白質(zhì)分子間較強(qiáng)的疏水作用力使Rhv3以二聚體形式分泌。為進(jìn)一步優(yōu)化產(chǎn)量,將重組菌株分別在LBB、BHI和CGXⅡ 3種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。結(jié)果顯示在CGXⅡ培養(yǎng)基中Rhv3幾乎無(wú)表達(dá)。結(jié)合重組菌株生物量及凝血酶滴定活性分析(圖2-C)可知,重組菌株在CGXⅡ培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最差,其OD600值僅為3.33,活性為0.42×103ATU/L。相反在BHI培養(yǎng)基中重組菌株具有最大的生物量(26.62)和最大活性(3.02×103ATU/L)。

A-單拷貝Rhv3質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖;B-不同培養(yǎng)基中Rhv3表達(dá)分析(M為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn));C-不同培養(yǎng)基中Rhv3活性分析

2.2 RBS篩選

為了獲得強(qiáng)RBS序列用于C.glutamicum中重組蛋白生產(chǎn),本研究選取了7個(gè)不同強(qiáng)度的RBS序列,分別是AAAGGAGGA、AGAAGGAG、AGAAAGGAGG、GAAAGGAGG、GAAAGGA、GAAAGGCGA、GAAAGGAGA。按照?qǐng)D1-A方式進(jìn)行PCR,構(gòu)建含不同RBS序列的p3A-RBS-egfp-Amp質(zhì)粒。接著得到的質(zhì)粒分別與p3A-Ptac-egfp-Kan進(jìn)行組裝,構(gòu)建兩拷貝egfp質(zhì)粒(圖1-B)。將構(gòu)建好的兩拷貝egfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)入C.glutamicum中,以單拷貝egfp(p3A-Ptac-egfp-Kan, POS)重組菌為對(duì)照(圖3-A),通過(guò)egfp熒光強(qiáng)度差異比較不同RBS序列表達(dá)強(qiáng)度。

A-兩拷貝egfp質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖;B-不同RBS重組菌株單位熒光強(qiáng)度(RFU/OD600值)比較

如圖3-B所示,兩拷貝egfp重組菌株熒光強(qiáng)度均高于單拷貝egfp重組菌株(POS);含不同RBS序列的兩拷貝egfp重組菌株中,RBS1熒光強(qiáng)度最高,達(dá)到POS的1.81倍;RBS2、RBS3次之;RBS5最弱,熒光強(qiáng)度與POS相比幾乎無(wú)增長(zhǎng)。因此,選用RBS1序列用于C.glutamicum中重組蛋白的表達(dá)。

2.3 多拷貝Rhv3菌株構(gòu)建及信號(hào)肽、拷貝數(shù)的優(yōu)化表達(dá)分析

為優(yōu)化Rhv3分泌水平,選擇C.glutamicum內(nèi)源信號(hào)肽CgR0949、PorB、CspA、CspB、Cg1514進(jìn)行Rhv3多拷貝重組菌株構(gòu)建(圖4-A)并通過(guò)SDS-PAGE驗(yàn)證其表達(dá)強(qiáng)度。以單拷貝Rhv3重組菌做對(duì)照,通過(guò)Image J進(jìn)行灰度分析發(fā)現(xiàn),兩拷貝Rhv3重組菌株表達(dá)量明顯得到改善,并且第二拷貝Rhv3使用CgR0949、PorB、CspA、CspB和Cg1514信號(hào)肽(M2S-Cg1514)時(shí),分泌強(qiáng)度分別是單拷貝菌株(M1-CspA)的1.37、1.67、1.45、2.06、2.28倍。需要注意的是,當(dāng)?shù)诙截怰hv3使用信號(hào)肽CspA、CspB時(shí),SDS-PAGE上顯示為兩條帶,猜測(cè)可能是蛋白表達(dá)過(guò)程中Rhv3蛋白出現(xiàn)降解造成的。

A-多拷貝Rhv3質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖;B～G-分別為二、三、四、五、六、七拷貝Rhv3表達(dá)分析(M-蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);CK-野生型C.glutamicum)

為進(jìn)一步優(yōu)化Rhv3的表達(dá),選擇最優(yōu)表達(dá)菌株(M2S-Cg1514)構(gòu)建三拷貝Rhv3重組菌,結(jié)果如圖4-C所示,Rhv3最高表達(dá)強(qiáng)度(M3S-CspB)是M2S-Cg1514的1.45倍。當(dāng)Rhv3拷貝數(shù)到六時(shí),Rhv3表達(dá)量達(dá)到最高(M6S-PorB),是出發(fā)菌株的4.69倍(圖4-F)。然而在隨后的七拷貝Rhv3表達(dá)中發(fā)現(xiàn),Rhv3表達(dá)量出現(xiàn)下降(圖4-G),猜測(cè)可能是過(guò)多重復(fù)序列積累導(dǎo)致其在體內(nèi)發(fā)生同源重組;也可能是因?yàn)檫^(guò)多Rhv3合成消耗了過(guò)量核糖體,或者造成宿主代謝負(fù)擔(dān)加重,導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)不良。綜上,經(jīng)過(guò)多輪構(gòu)建及篩選,獲得了一株高產(chǎn)Rhv3重組菌株(M6S-PorB);并且發(fā)現(xiàn),在一定程度上,Rhv3表達(dá)量隨著基因拷貝數(shù)的增加而升高。

2.4 Rhv3重組菌發(fā)酵培養(yǎng)及純化分析

將M6S-PorB重組菌在500 mL搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)并檢測(cè)其凝血酶活性。結(jié)果如圖5-A所示,菌株在4～20 h內(nèi)生物量快速增長(zhǎng),20 h后進(jìn)入穩(wěn)定期,至40 h時(shí)生物量達(dá)到最高(OD600=23.08)。SDS-PAGE顯示,在4 h時(shí)上清液中能檢測(cè)到明顯的Rhv3蛋白條帶。并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),條帶越來(lái)越粗(圖5-B)。凝血酶滴定結(jié)果證實(shí)在40 h時(shí),上清液中Rhv3活性達(dá)到最高,為10.91×103ATU/L,比單拷貝Rhv3菌株提高3.61倍。經(jīng)BCA蛋白定量檢測(cè)分析可知,Rhv3含量達(dá)到1.89 g/L。AKTA純化后,Rhv3純度高于90%(圖5-C)。

A-重組菌株在BHI培養(yǎng)基中發(fā)酵生長(zhǎng)曲線(xiàn)及Rhv3活性分析;B-重組菌株Rhv3表達(dá)分析(每泳道上樣3 μL,M為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),1～12對(duì)應(yīng)發(fā)酵4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h時(shí)Rhv3的表達(dá)情況);C-BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn);D-經(jīng)AKTA純化后蛋白的SDS-PAGE分析(L1為目標(biāo)蛋白純化樣品)

3 討論

為了改善重組蛋白的合成,學(xué)者們嘗試過(guò)很多方法,包括替換啟動(dòng)子和信號(hào)肽、共表達(dá)伴侶蛋白、優(yōu)化發(fā)酵工藝、提高基因拷貝數(shù)等[13,16,18-19]。對(duì)于Rhv3這種小分子多肽的生產(chǎn),多數(shù)采用多拷貝策略提高生產(chǎn)。LIN等[20]利用2A肽構(gòu)建egfp基因多拷貝串聯(lián)表達(dá)菌株,egfp表達(dá)量在三拷貝時(shí)達(dá)到最高。梁偉鋒等[18]利用同尾酶的不可逆轉(zhuǎn)連接方式在Pichiapastoria中構(gòu)建人腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(human brain derived neurotrophic factor, hBDNF)的1～6拷貝重組表達(dá)載體,使得hBDNF產(chǎn)量達(dá)到20 mg/L。同年,ZHONG等[21]使用常規(guī)構(gòu)建方法在E.coli中構(gòu)建1、2、4、8個(gè)拷貝融合人β-防御素-2(humanβ-defensin-2, hBD2)重組表達(dá)菌株,最終融合蛋白產(chǎn)量占總可溶性蛋白的62.2%,是目前報(bào)道的最高產(chǎn)量。周偉杰等[22]利用BioBrick法在P.pastoria中構(gòu)建以Pgap為啟動(dòng)子的五拷貝血管內(nèi)表皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)重組菌,獲得VEGF165產(chǎn)量高達(dá)0.45 g/L。

理論上講,重組蛋白的生產(chǎn)與基因拷貝數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系,基因拷貝數(shù)增加會(huì)直接提高重組蛋白的生產(chǎn)。盡管在實(shí)際應(yīng)用生產(chǎn)中被證實(shí)兩者并沒(méi)有呈現(xiàn)出很好的線(xiàn)性關(guān)系,但是這一策略仍然是提高重組蛋白生產(chǎn)最高效、快捷的方法。本研究通過(guò)在C.glutamicum中分泌表達(dá)Rhv3并篩選RBS、信號(hào)肽和拷貝數(shù),使得Rhv3產(chǎn)量達(dá)到1.89 g/L。然而需要注意的是,RBS序列、拷貝數(shù)只是影響重組蛋白表達(dá)的因素之一,后續(xù)仍然可以通過(guò)底盤(pán)細(xì)胞改造、發(fā)酵工藝優(yōu)化等手段進(jìn)一步改善Rhv3的表達(dá)。

4 結(jié)論

總之,本研究在C.glutamicum表達(dá)系統(tǒng)中開(kāi)發(fā)了3A組裝的多拷貝基因表達(dá)策略。利用該策略,優(yōu)化Rhv3合成過(guò)程中的RBS、信號(hào)肽以及拷貝數(shù)等,在放大培養(yǎng)中Rhv3分泌活性達(dá)到10.91×103ATU/L,比之前報(bào)道的1.75×103ATU/L[16]提高523%。與通過(guò)Linker、2A肽等進(jìn)行重組蛋白表達(dá)的多拷貝融合策略相比,本研究多拷貝基因策略旨在利用一條mRNA上進(jìn)行多個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)的翻譯,實(shí)現(xiàn)重組蛋白表達(dá)最大化。同時(shí)3A組裝的開(kāi)發(fā),縮短了載體構(gòu)建周期,極大加速了重組蛋白生產(chǎn)效率。這一策略的開(kāi)發(fā),增強(qiáng)了C.glutamicum作為重組蛋白生產(chǎn)宿主的核心競(jìng)爭(zhēng)力,為進(jìn)一步利用C.glutamicum進(jìn)行重組蛋白工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。