冒煙型多發(fā)性骨髓瘤的生物學(xué)特征研究

徐嘉軒 董曉慶 陳兵

冒煙型多發(fā)性骨髓瘤(smoldering multiple myeloma, SMM)是一種介于意義未明的單克隆免疫球蛋白血癥(monoclonal gammopathy of undetermined significance, MGUS)和活動(dòng)性多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)間的無癥狀惡性克隆性漿細(xì)胞疾病[1]。國際骨髓瘤工作組(IMWG)將真正的惰性骨髓瘤定義為SMM,其診斷標(biāo)準(zhǔn)為血清M蛋白≥3 g/dL或24 h尿本周蛋白≥500 mg,和(或)骨髓克隆漿細(xì)胞比例為10%～60%,且無骨髓瘤定義事件或淀粉樣變[2]。SMM病人是一類高風(fēng)險(xiǎn)亞群,其進(jìn)展為活動(dòng)性MM的比例較高且不均勻,診斷后前5年內(nèi)進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)約為每年10%[3-4]。梅奧診所提出的風(fēng)險(xiǎn)分層表明,SMM可根據(jù)骨髓漿細(xì)胞比例、M蛋白及血清游離輕鏈比值劃分出低、中、高三類風(fēng)險(xiǎn)等級(jí),其中位進(jìn)展時(shí)間分別為110、68、29個(gè)月[5]。

目前SMM進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)與疾病相關(guān)的臨床指標(biāo)有關(guān)[6],因此通常能夠識(shí)別出小部分將要或者已經(jīng)進(jìn)展為MM階段的病人。但由于MM生物學(xué)的高度異質(zhì)性,僅靠現(xiàn)有的疾病臨床因素鑒別出進(jìn)展傾向或高危病人仍然不夠全面和準(zhǔn)確,因此深入闡明SMM內(nèi)在的生物學(xué)特性尤為必要?；蛐酒?、下一代測序(next-generation sequencing, NGS)和單細(xì)胞測序等技術(shù)的應(yīng)用為識(shí)別SMM基因組學(xué)及免疫學(xué)特征提供了平臺(tái)支撐[7-8],有助于揭示骨髓瘤的克隆進(jìn)化模式和進(jìn)展分子機(jī)制,為臨床評(píng)估SMM的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)提供更全面的手段。

1 細(xì)胞遺傳學(xué)

細(xì)胞遺傳學(xué)異常是SMM進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)升高的重要因素,免疫球蛋白熒光原位雜交(FISH)作為染色體異常的常用臨床檢測技術(shù),用以明確SMM病人中細(xì)胞遺傳學(xué)異常的分布特點(diǎn)及其對(duì)進(jìn)展預(yù)后的影響。Lopez-Corral等[9]的研究表明,SMM發(fā)生del 13q的比例(61%)低于MM(74%),高于MGUS(37%),發(fā)生t(11;14)、t(4;14)、t(14;16)、del 17p以及gain 1q等事件的比例也均介于MGUS與MM之間,且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這證實(shí)了骨髓瘤疾病進(jìn)程中涉及到明顯的遺傳學(xué)異常漿細(xì)胞的克隆擴(kuò)增,SMM則處于MGUS至MM克隆演變的中間過渡態(tài)。Rajkumar等[10]對(duì)351例SMM病人進(jìn)行FISH分析表明,36.2%的病人存在免疫球蛋白重鏈(IGH)易位,發(fā)生IGH易位的病人中最常見的為t(11;14)(57例),其次為t(4;14)(36例)。與t(11;14)病人相比,t(4;14)病人向MM進(jìn)展的中位時(shí)間明顯更短(28個(gè)月比55個(gè)月),診斷為SMM后的中位生存時(shí)間也較短(105個(gè)月比147個(gè)月)。另外,del 17p也與進(jìn)展時(shí)間縮短顯著相關(guān),其與t(4;14)均被認(rèn)為是SMM細(xì)胞遺傳學(xué)高風(fēng)險(xiǎn)因素。

基于診斷為SMM時(shí)及進(jìn)展為MM后的配對(duì)樣本縱向分析則更能反映骨髓瘤進(jìn)程中克隆演化及亞克隆的影響。Merz等[11]開展縱向隊(duì)列FISH分析強(qiáng)調(diào)了t(4;14)、del 17p、del 8p、del 13q以及gain 1q與更高的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān),并且這些細(xì)胞遺傳學(xué)異常作為主克隆而非亞克隆時(shí)對(duì)預(yù)后的影響更加明顯,其作為亞克隆遺傳學(xué)異常也同樣具有預(yù)后意義,尤其在高危SMM中更為顯著。另一項(xiàng)縱向研究觀察到SMM進(jìn)程中出現(xiàn)新的細(xì)胞遺傳學(xué)事件如del 13q、del 17p以及t(14;16)[12],驗(yàn)證了疾病過程中的克隆進(jìn)化,并強(qiáng)調(diào)了在SMM階段實(shí)施FISH檢測的重要性。

2 基因表達(dá)譜

由于SMM進(jìn)展到MM的生物學(xué)過程非常復(fù)雜,目前未能明確用來區(qū)分MM各階段的特異性生物標(biāo)志物,進(jìn)展過程中涉及的信號(hào)通路和分子機(jī)制也尚未被完全了解?；诨虮磉_(dá)譜的生物信息學(xué)分析能夠描繪功能通路富集特點(diǎn)、鑒定轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及建立風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型,從而加深對(duì)疾病特性基因?qū)用娴恼J(rèn)知。

轉(zhuǎn)錄組通路網(wǎng)絡(luò)分析表明,與正常樣本相比,SMM的差異基因數(shù)目明顯少于MM,提示SMM擁有較為惰性的生物學(xué)功能狀態(tài),MM所涉及的通路富集更為復(fù)雜[13]。SMM差異基因中包括MAFB和HIF1A這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,前者與許多SMM進(jìn)展相關(guān)基因存在互作關(guān)系;而進(jìn)展后的MM差異基因網(wǎng)絡(luò)中包含26個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,提示MM比SMM擁有更復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控特性。進(jìn)一步的,差異基因功能富集分析表明,SMM擁有覆蓋且超過MGUS涉及的基因本體(GO)富集結(jié)果,表明SMM存在著與MGUS相似的生物學(xué)特性而又演化出新的功能通路,其中SMM最顯著的GO類別是主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅱ類受體,其他還包括蛋白復(fù)合物結(jié)合、細(xì)胞因子結(jié)合、激酶結(jié)合和蛋白二聚化活動(dòng);而MM顯著富集的GO類別則與SMM存在著較大差異,其主要包括RNA結(jié)合、酶結(jié)合和結(jié)構(gòu)性DNA結(jié)合等。

經(jīng)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)鑒定及拷貝數(shù)變異分析驗(yàn)證后得到4個(gè)SMM特征性的轉(zhuǎn)錄因子標(biāo)志物[14],分別是MYC相關(guān)因子X(MAX)、鋅指蛋白148(ZNF148)、轉(zhuǎn)錄因子4(TCF4)和ZNF281。MAX是MYC轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)的復(fù)合物,其在SMM進(jìn)程中拷貝數(shù)變異下調(diào),被認(rèn)為是MM中的腫瘤抑制基因[15];ZNF148在從正常到MGUS再到SMM的進(jìn)程中拷貝數(shù)變異和基因表達(dá)量均逐漸上升,可能作為SMM早期診斷的潛在標(biāo)志物,其也是MM轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)特征中的重要一員[13];模塊富集分析結(jié)果提示,ZNF281在SMM中轉(zhuǎn)錄基因更加活躍,更有利于引起DNA突變從而促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的增殖及惡性演變,而TCF4則在MGUS驅(qū)動(dòng)過程中更為活躍。這4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在SMM發(fā)展進(jìn)程中具有很強(qiáng)的生物學(xué)相關(guān)性,后續(xù)可開展功能實(shí)驗(yàn)深入驗(yàn)證其在體內(nèi)外的重要作用。

有研究表明,從惰性骨髓瘤到MM的轉(zhuǎn)變過程中,炎癥及細(xì)胞因子/趨化因子信號(hào)通路是最為顯著的調(diào)控通路,進(jìn)而根據(jù)B細(xì)胞/漿細(xì)胞介導(dǎo)的免疫過程相關(guān)基因鑒定出一個(gè)多基因評(píng)估模型,其能夠準(zhǔn)確區(qū)分SMM和癥狀性MM的進(jìn)程狀態(tài),有助于在基因表達(dá)層面評(píng)估SMM病人的分子學(xué)特征[16]。此外,一個(gè)結(jié)合臨床特征的四基因評(píng)分模型(GEP4)被用來預(yù)測SMM進(jìn)展為癥狀性MM的風(fēng)險(xiǎn)概率[17]:GEP4模型高評(píng)分病人2年進(jìn)展為MM的概率為85.7%;而GEP4模型低評(píng)分、基線M蛋白<3 g/dL和白蛋白≥3.5 g/dL所共同確定的低風(fēng)險(xiǎn)SMM群體2年進(jìn)展為MM的概率僅為5.0%。

3 基因組測序

既往關(guān)于SMM的基因組特征及其向MM進(jìn)化模式的研究甚少,尤其是進(jìn)展為MM過程中全基因組突變譜的變化差異尚不清楚。近年來,NGS技術(shù)尤其是全基因組測序(whole genome sequencing, WGS)的應(yīng)用提供了對(duì)骨髓瘤基因組編碼區(qū)突變景觀的全面刻畫[18],識(shí)別出各種關(guān)鍵的MM驅(qū)動(dòng)事件及其產(chǎn)生的分子學(xué)演變模式,并能預(yù)估疾病進(jìn)展過程中各類驅(qū)動(dòng)因素出現(xiàn)的時(shí)間序列[19],從而顯著提升了對(duì)骨髓瘤發(fā)生與進(jìn)展基因組學(xué)層面的認(rèn)知。

SMM基因組圖譜與MM具有相似的遺傳學(xué)組成,如突變位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)重排,也具有相似的突變密度和克隆異質(zhì)性[20-21]。SMM基因組的復(fù)雜性相當(dāng)高,其復(fù)雜性與疾病進(jìn)展時(shí)間或演化頻率似乎無關(guān)。短時(shí)間內(nèi)進(jìn)展的高危SMM病人其轉(zhuǎn)化條件并不總是依賴額外突變或克隆選擇的獲得,而可能是在外部因素的驅(qū)動(dòng)下憑借基因組的復(fù)雜性達(dá)到向MM轉(zhuǎn)化的閾值,這種轉(zhuǎn)化進(jìn)展可能與獲得性突變模式的改變有關(guān),而非突變總負(fù)荷的積累增加[20,22]。

SMM進(jìn)展過程中的主要特征是克隆穩(wěn)定性,一些常見的染色體異常如del 13q、超二倍體及IGH易位等均是克隆性的;常見的驅(qū)動(dòng)突變?nèi)鏚LHL6、TP53及MAX等大多數(shù)也是克隆性的,可能在疾病早期獲得并驅(qū)動(dòng)克隆拓展。對(duì)于亞克隆而言,SMM具有顯著的亞克隆異質(zhì)性,且在進(jìn)展時(shí)容易受干擾,例如骨髓微環(huán)境中存在的強(qiáng)大選擇壓力能定義克隆結(jié)構(gòu),進(jìn)而在亞克隆演化和疾病進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。少數(shù)體細(xì)胞拷貝數(shù)變異如del 1p和del 17p是亞克隆性的,MM常見驅(qū)動(dòng)事件相關(guān)的單核苷酸變異主要也是亞克隆的,表明它們是在疾病進(jìn)展的后期獲得的[20-22]。

研究表明,在SMM診斷時(shí),大部分的遺傳改變異常已經(jīng)發(fā)生,即大多數(shù)病人的基因組成很大程度上取決于SMM的診斷時(shí)間,因此基于SMM診斷時(shí)發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物能夠作為基因組預(yù)測因子,以區(qū)分易于進(jìn)展的高風(fēng)險(xiǎn)SMM病人[21,23]。KRAS、NRAS及FAM46突變是顯著的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)因素[21],尤其是KRAS突變與更短的進(jìn)展時(shí)間顯著相關(guān)[24-25]。KRAS突變影響著細(xì)胞周期進(jìn)展從而促進(jìn)克隆清除和MM轉(zhuǎn)化,攜帶KRAS突變的SMM病人更適合被定義為過渡進(jìn)程中的MM[24]。信號(hào)通路突變層面,MAPK通路及DNA修復(fù)通路相關(guān)基因的突變與SMM進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[21];而與初診MM病人相比,高危SMM病人NF-κB通路基因突變頻率較低[26]。值得注意的是,活化誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶對(duì)早期亞臨床階段突變格局的形成起著重要作用,載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽(APOBEC)能夠驅(qū)動(dòng)SMM進(jìn)程且其活性隨著疾病進(jìn)展而提升,APOBEC相關(guān)突變?cè)赟MM進(jìn)展病人中顯著富集并與更短的進(jìn)展時(shí)間相關(guān)[20-21,24]。此外,MYC異位或擴(kuò)增作為關(guān)鍵的基因組結(jié)構(gòu)突變事件,是SMM進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,對(duì)預(yù)測骨髓瘤進(jìn)展具有重要價(jià)值[21,24,27]。

基于WGS技術(shù)對(duì)SMM進(jìn)展前后配對(duì)樣本的全基因組分析能夠識(shí)別出不同的生物學(xué)進(jìn)展模式,從而深刻揭示SMM惡性轉(zhuǎn)化的生物學(xué)基礎(chǔ)。Bolli等[20]提出SMM進(jìn)展的兩種不同模式,第一種是靜態(tài)進(jìn)展模型,疾病進(jìn)展到MM時(shí)相同的亞克隆結(jié)構(gòu)保留,進(jìn)展僅反映了從積累足夠的疾病負(fù)荷到出現(xiàn)臨床癥狀所需的時(shí)間,進(jìn)展時(shí)間通常小于1年;第二種是自發(fā)進(jìn)化模型,SMM亞克隆組成在缺乏任何來自治療的選擇壓力下發(fā)生了變化,反映了形成一個(gè)真正的新惡性克隆并進(jìn)展到明顯MM所需的時(shí)間,其中位進(jìn)展時(shí)間比第一種模型更長。Oben等[28]也證明WGS技術(shù)可用于識(shí)別兩種生物學(xué)特征截然不同的SMM實(shí)體,即穩(wěn)定型和進(jìn)展型,兩者在骨髓瘤基因組事件如驅(qū)動(dòng)基因突變、染色體多態(tài)性、拷貝數(shù)變異及典型APOBEC突變活性等方面存在顯著的差異。穩(wěn)定型病例高危遺傳事件負(fù)擔(dān)較低,臨床病程呈惰性且進(jìn)展慢,較晚發(fā)生或缺少骨髓瘤定義的基因組事件;而進(jìn)展型病人則較早發(fā)生或有足夠數(shù)量的上述事件,惡性潛能高且進(jìn)展快。

4 免疫微環(huán)境

免疫微環(huán)境失調(diào)是骨髓瘤重要的生物學(xué)特性,骨髓微環(huán)境中的漿細(xì)胞外在因素在疾病進(jìn)展和治療效果中起著關(guān)鍵作用[29]。骨髓瘤的發(fā)生與發(fā)展密切依賴于惡性漿細(xì)胞與骨髓免疫環(huán)境細(xì)胞成分間的交互作用,引起骨質(zhì)破壞和免疫系統(tǒng)受損等,進(jìn)而促進(jìn)疾病進(jìn)程、復(fù)發(fā)和耐藥產(chǎn)生[30]。通過免疫表達(dá)譜、單細(xì)胞測序及流式細(xì)胞術(shù)等能夠鑒定SMM的免疫微環(huán)境特征,有助于識(shí)別出高進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的SMM病人并開發(fā)新的免疫靶向療法。

Isola等[31]的研究表明,與MGUS和MM相比,SMM中細(xì)胞毒性相關(guān)基因的表達(dá)明顯上調(diào),其中部分細(xì)胞毒性分子與抑制性免疫檢查點(diǎn)如淋巴細(xì)胞激活基因3(LAG3)、T細(xì)胞免疫球蛋白和免疫受體酪氨酸抑制性基序結(jié)構(gòu)域(TIGIT)等表達(dá)呈正相關(guān),可能損害骨髓細(xì)胞毒性T細(xì)胞的效應(yīng)功能以及削弱抗骨髓瘤的免疫反應(yīng)。進(jìn)一步地,基于免疫成分和激活標(biāo)志物表達(dá)譜聚類分析得到4個(gè)不同的亞群,其中亞群2病人細(xì)胞毒性分子如GZMB、GNLY、IFNG等表達(dá)較高,提示耗竭的細(xì)胞毒性T細(xì)胞水平較高,這類SMM病人的無進(jìn)展生存期顯著更短。該研究發(fā)現(xiàn)的高危SMM病人存在部分抑制性免疫檢查點(diǎn)如TIGIT和LAG3表達(dá)上調(diào)也得到了單細(xì)胞測序結(jié)果的支持[32],后續(xù)可深入評(píng)估其作為阻遏SMM進(jìn)展的免疫治療靶點(diǎn)的應(yīng)用潛力。另一方面,配對(duì)基因表達(dá)分析表明,與活動(dòng)性MM相比,SMM階段某些腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員如CD137、TNFAIP3、TNFRSF14等表達(dá)水平高,且與病人更短的無進(jìn)展生存期顯著相關(guān),提示促炎微環(huán)境的形成可能促進(jìn)骨髓瘤的進(jìn)展[31]。因此,細(xì)胞毒性T細(xì)胞衰竭和慢性炎癥可能是SMM中免疫失調(diào)導(dǎo)致漿細(xì)胞惡性進(jìn)化的部分機(jī)制解釋。

此外,Paiva等[33]發(fā)現(xiàn)高危SMM病人較健康對(duì)照者,免疫狀態(tài)輕度受損,1型T輔助細(xì)胞及γδT細(xì)胞數(shù)量顯著更少,使用來那度胺治療這些高危病人后,其功能性活性T淋巴細(xì)胞數(shù)量得到提升,NK細(xì)胞表型發(fā)生顯著變化,表明治療性免疫調(diào)節(jié)能通過激活受損的免疫系統(tǒng)以延緩SMM進(jìn)展。Zavidij等[32]觀察到SMM階段即出現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的早期積累,隨后GrK(+)記憶細(xì)胞毒性T細(xì)胞種群喪失,后者在小鼠模型骨髓瘤免疫監(jiān)測中起關(guān)鍵作用;同時(shí)也觀察到SMM期間IFN信號(hào)通路強(qiáng)度升高,暗示涉及IFN通路的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在高危SMM階段可能已經(jīng)存在,有望成為預(yù)防SMM進(jìn)展的干預(yù)靶點(diǎn)。Fernandez等[34]對(duì)73例SMM病人骨髓標(biāo)本利用蛋白組學(xué)、血清組學(xué)及T細(xì)胞受體測序的綜合方式進(jìn)行高維免疫分析,鑒定出3個(gè)穩(wěn)定的免疫分類亞群,并明確了骨髓血漿多效蛋白和骨髓T細(xì)胞水平的差異是這些免疫類群間的重要區(qū)分因素,這更加證實(shí)了骨髓瘤細(xì)胞和免疫微環(huán)境間復(fù)雜的相互作用導(dǎo)致SMM最終進(jìn)展的可能性。

5 結(jié)語

SMM的生物學(xué)特征復(fù)雜且多樣,不僅取決于惡性漿細(xì)胞本身的基因組遺傳學(xué)特征,也受細(xì)胞外在因素如免疫微環(huán)境的影響。借助各類基因?qū)W或免疫學(xué)技術(shù)能夠深刻揭示SMM疾病的生物學(xué)特性,有助于根據(jù)所鑒定出的特征因素進(jìn)一步開發(fā)并驗(yàn)證新的風(fēng)險(xiǎn)分層系統(tǒng),從而精準(zhǔn)預(yù)測SMM的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)并使高危病人從早期治療中獲益。