TIMP-1在大鼠不可復(fù)性牙髓炎中的抗炎作用

唐 穎,李午麗,楊 琪,王 璐,李 頌

活髓保存治療(vital pulp therapy,VPT)是在深齲露髓診斷為不可復(fù)性牙髓炎的成熟恒牙中的應(yīng)用,目前已有大量的臨床研究,但缺乏組織學(xué)研究來(lái)觀察治療后牙髓炎癥狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。在炎癥發(fā)展過程中,炎癥遞質(zhì)介導(dǎo)了組織的損傷、炎性滲出等反應(yīng),其中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallopeptidase-9,MMP-9)在牙髓炎中起著至關(guān)重要的作用[1]。MMP-9可以降解破壞細(xì)胞外基質(zhì),金屬蛋白酶抑制劑1(tissue inhibitor of metalloprotease,TIMP-1)是MMP-9的天然抑制劑,可以通過與MMP-9形成抑制性復(fù)合物來(lái)防止細(xì)胞外基質(zhì)分解[2]。研究顯示牙髓炎癥期間牙髓中的MMP-9含量隨著炎癥進(jìn)展升高,同時(shí)TIMP-1的含量會(huì)隨著牙髓炎癥的進(jìn)展而降低,說明TIMP-1與牙髓炎的發(fā)展存在一定的相關(guān)性[3],并且TIMP-1可以誘導(dǎo)大鼠健康牙髓形成修復(fù)性牙本質(zhì)[4],但是健康牙髓模型不能反映炎癥牙髓的組織病理學(xué)狀態(tài)。該研究建立實(shí)驗(yàn)性大鼠不可復(fù)性牙髓炎模型,在活髓切斷術(shù)中應(yīng)用TIMP-1,旨在探討TIMP-1在牙髓炎中的抗炎作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物72只8～10周齡成年雄性SD大鼠,SPF級(jí),300 g±50 g,口腔衛(wèi)生狀況良好,無(wú)齲病及牙周疾病。研究通過安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的倫理審查(編號(hào):LLSC20221248)。

1.2 主要材料與儀器光學(xué)顯微鏡(型號(hào):Nikon Eclipse E100)購(gòu)于日本尼康公司;移動(dòng)式牙科治療機(jī)(型號(hào):PC2930)購(gòu)于廣州市廣州超盛醫(yī)療器械有限公司;高速渦輪手機(jī)(型號(hào):T3 Racer Midwest)購(gòu)于德國(guó)西諾德公司;根管口探針(型號(hào):DG-16)購(gòu)于美國(guó)登士柏公司;高速鎢鋼車針球鉆(型號(hào):BR-49)購(gòu)于日本MANI公司;碘伏消毒液(貨號(hào):3180132)購(gòu)于深圳市安多福消毒高科技股份有限公司;生理鹽水(貨號(hào):R00641)購(gòu)于成都市四川科倫藥業(yè)股份有限公司;TIMP-1(貨號(hào):410-01)購(gòu)于美國(guó)PeproTech公司;玻璃離子水門汀(貨號(hào):56633)購(gòu)于美國(guó)3M公司;一抗CD68(貨號(hào):GB113109)購(gòu)于武漢塞維爾生物科技有限公司;二抗CY3山羊抗rab(貨號(hào):GB21303)購(gòu)于武漢谷歌生物科技有限公司。

1.3 不可復(fù)性牙髓炎模型的建立大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(3 ml/kg),取仰臥位固定于操作臺(tái)上,0.5%碘伏消毒口腔及口周后,使用高速渦輪手機(jī)及BR-49球鉆在水冷卻下于大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙咬牙合面中央窩鉆磨,注意要間斷磨除防止產(chǎn)熱過多或意外穿髓,直至窩洞底牙本質(zhì)透紅,DG16探針略微加壓穿透髓室頂,見出血點(diǎn),即為穿髓成功。每個(gè)磨牙窩洞的制備均使用全新及同一批次的BR-49球鉆以及DG16探針。根據(jù)開髓后髓腔開放不同時(shí)間分為6、12、24、36、48、72 h組,每組4只共24只大鼠。取上頜骨,分為左右兩半,4%多聚甲醛外固定48 h,組織切片HE染色。分析觀察牙髓炎模型的HE切片,選取出具有典型不可復(fù)性牙髓炎組織病理學(xué)特點(diǎn)且炎癥局限于冠部的髓腔開放時(shí)長(zhǎng)——髓腔開放24、36、48 h,后續(xù)的實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行。

1.4 不可復(fù)性牙髓炎的炎癥牙髓切除髓腔開放24、36、48 h誘導(dǎo)不可復(fù)性牙髓炎后,大鼠全身麻醉后取仰臥位固定于操作臺(tái)上,0.5%碘伏消毒口腔及口周后,BR-49球鉆在水冷卻下,在頭戴式放大鏡的幫助下于大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙咬牙合面擴(kuò)大穿髓孔,磨除冠髓,每個(gè)磨牙切髓時(shí)均使用全新及同一批次的BR-49球鉆以預(yù)防切髓過程中產(chǎn)熱不均勻?qū)ρ浪柩装Y產(chǎn)生影響。術(shù)中密切觀察,及時(shí)吸凈口腔內(nèi)的水以防止引起窒息死亡,術(shù)后觀察大鼠麻醉后蘇醒、日常活動(dòng)以及飲水進(jìn)食情況。無(wú)菌棉球止血,在沒有壓力的情況下,含有20 μl TIMP-1(200 ng/ml)(TIMP-1組)或20 μl生理鹽水(NS組)的無(wú)菌棉球直接覆蓋髓腔5 min。玻璃離子粘固劑修復(fù)空洞。于切髓給藥后24或48 h處死大鼠,每組4只大鼠。取上頜骨,分為左右兩半,4%多聚甲醛外固定48 h,組織切片HE及免疫熒光染色。

1.5 組織病理學(xué)分析將組織置于在EDTA脫鈣液中進(jìn)行25 ℃恒溫脫鈣4周左右,脫水包埋。將修整好的蠟塊置于石蠟切片機(jī),沿磨牙近遠(yuǎn)中方向平行于牙體長(zhǎng)軸制作連續(xù)切片,厚4 μm。切片HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察。牙髓炎癥的病理學(xué)評(píng)價(jià)及評(píng)分參照表1[5-6],評(píng)估包括根髓炎性細(xì)胞反應(yīng)、根髓組織形態(tài)改變、根髓壞死范圍。

表1 根髓組織病理學(xué)分析評(píng)分表

1.6 免疫熒光染色將切片與初級(jí)抗體孵育,在切片上滴加使用PBS以1 ∶100稀釋配好的一抗CD68,二抗CY3山羊抗rab以1 ∶300稀釋。使用了DAPI染液進(jìn)行細(xì)胞核染色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用IBM SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)HE染色切片各實(shí)驗(yàn)組牙髓組織炎癥評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;免疫熒光染色切片經(jīng)CaseViewer 2.4.0軟件掃描,Image J軟件分析熒光強(qiáng)度,應(yīng)用IBM SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)各實(shí)驗(yàn)組免疫熒光強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用多因素方差分析,按α=0.05水準(zhǔn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不可復(fù)性牙髓炎模型的建立光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠牙髓組織切片。髓腔開放6 h:穿髓孔附近可見輕微炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及成牙本質(zhì)細(xì)胞層輕微紊亂(圖1A);髓腔開放12 h:穿髓孔附近牙髓組織全層紊亂裂解(圖1B);髓腔開放24 h:可見冠髓中有微膿腫形成,周圍見炎癥浸潤(rùn)帶,冠髓組織約1/2紊亂裂解(圖1C);髓腔開放36 h:冠髓可見局部微膿腫,清晰的炎癥分界線,冠髓組織約2/3紊亂裂解(圖1D);髓腔開放48 h:可見微膿腫,大部分冠髓組織紊亂裂解,周圍出現(xiàn)炎癥界限(圖1E);髓腔開放72 h:大范圍的冠髓組織液化壞死,局部形成較大膿腫,周圍可見清晰的炎癥分界線(圖1F)。髓腔開放24、36、48 h時(shí)牙髓組織表現(xiàn)出典型的不可復(fù)性牙髓炎的表現(xiàn),且炎癥局限于冠髓,選擇這三個(gè)開放時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 部分不可復(fù)性牙髓炎模型的組織學(xué)表現(xiàn) HE ×50A:髓腔開放6 h;B:髓腔開放12 h;C:髓腔開放24 h;D:髓腔開放36 h;E:髓腔開放48 h;F:髓腔開放72 h;箭頭:指示炎癥分界線

2.2 根髓組織學(xué)定量分析VPT術(shù)后根髓HE染色的典型例子如圖2所示,組織病理學(xué)定量分析結(jié)果如表2、3所示,TIMP-1組根髓炎性細(xì)胞反應(yīng)、根髓組織形態(tài)及根髓壞死范圍的炎癥評(píng)分與NS組炎癥評(píng)分之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,TIMP-1組炎癥評(píng)分更高(P<0.001,P<0.001,P<0.01)。結(jié)果顯示,與NS組相比,TIMP-1組的根髓組織炎癥改變更加明顯,且根髓組織的炎癥改變隨著開放時(shí)長(zhǎng)及給藥時(shí)長(zhǎng)的增加而逐漸明顯。

圖2 VPT術(shù)后根髓HE染色 ×200

表2 根髓組織病理學(xué)評(píng)分多因素方差分析

表3 根髓組織病理學(xué)評(píng)分多重比較分析

2.3 免疫熒光染色分析VPT術(shù)后根髓免疫熒光染色的典型例子如圖3所示,CD68免疫熒光強(qiáng)度多因素方差分析見表4、5。TIMP-1組根髓組織的CD68免疫熒光標(biāo)記較NS組明顯,熒光強(qiáng)度高于NS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=110.37,P<0.001),且隨著開放時(shí)長(zhǎng)及給藥時(shí)長(zhǎng)的延長(zhǎng),根髓組織中的免疫熒光標(biāo)記強(qiáng)度也逐漸明顯增加。

圖3 VPT術(shù)后根髓免疫熒光染色(CD68標(biāo)記) ×200

表4 CD68免疫熒光強(qiáng)度多因素方差分析

表5 CD68免疫熒光強(qiáng)度多重比較分析

3 討論

臨床上,深齲露髓診斷為不可復(fù)性牙髓炎的患牙難以判斷細(xì)菌及炎癥侵入其牙髓組織的深度,因此進(jìn)行組織學(xué)研究具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)試圖尋找一種可行的抗炎藥物以提高不可復(fù)性牙髓炎VPT成功率,采用了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性牙髓炎模型,模擬臨床治療程序,在炎癥牙髓中應(yīng)用TIMP-1,并進(jìn)行了組織病理學(xué)觀察和免疫組化分析,了解VPT術(shù)后剩余根髓的炎癥進(jìn)展,為臨床治療提供依據(jù)。

TIMP-1是1975年發(fā)現(xiàn)的一種分泌分子,是MMP-9的天然抑制劑,通過與MMP-9形成抑制性復(fù)合物來(lái)防止ECM分解[2],TIMP-1還可以限制中性粒細(xì)胞的過度聚集,以防止活性氧和蛋白酶的過度產(chǎn)生,保護(hù)組織免受降解[7]。此外,TIMP-1還具有細(xì)胞因子樣活性,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和血管生成[8]。TIMP-1在人體多種系統(tǒng)的炎癥疾病中發(fā)揮著重要的作用,例如TIMP-1在哮喘過敏性肺部炎癥中發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥、參與組織重塑的保護(hù)作用[9]。TIMP-1與牙周組織的破壞和修復(fù)也密切相關(guān),慢性牙周炎患者經(jīng)牙周治療后TIMP-1表達(dá)增加,提示通過提高TIMP-1的表達(dá)可能會(huì)改善牙周治療的結(jié)果[10]。以上研究提示TIMP-1是一個(gè)潛在的抗炎藥物。

研究顯示TIMP-1在一些疾病如哮喘過敏性肺部炎癥中發(fā)揮抗炎促修復(fù)的作用[9],但是在某些疾病如慢性肝炎中又發(fā)揮促炎作用[11]。Glaab et al[12]在大鼠毒性研究中發(fā)現(xiàn)TIMP1mRNA的表達(dá)上調(diào)與組織變性和壞死相關(guān),Kobuch et al[13]發(fā)現(xiàn)TIMP-1水平的升高會(huì)導(dǎo)致肝臟中性粒細(xì)胞的增加,這些研究結(jié)果也與本實(shí)驗(yàn)所觀察到的TIMP-1加重了牙髓炎的結(jié)果相吻合。有研究[10]顯示不同濃度的TIMP-1對(duì)體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞的增殖與堿性磷酸酶活性表達(dá)的影響不同,牙周膜細(xì)胞增殖與堿性磷酸酶活性表達(dá)隨著TIMP-1濃度的增高出現(xiàn)先增高然后又降低的趨勢(shì),濃度過高時(shí)還會(huì)抑制牙周膜細(xì)胞增殖與堿性磷酸酶活性表達(dá),推測(cè)其濃度可能會(huì)影響TIMP-1在炎癥中的作用。

本項(xiàng)研究采用了一種動(dòng)物模型。大鼠磨牙牙體組織結(jié)構(gòu)與人類磨牙較為相似,而且其牙髓組織在受到損傷時(shí),炎癥與修復(fù)過程與人類牙髓組織受損后的反應(yīng)相似,所以選擇大鼠磨牙進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的研究越來(lái)越多[14]。通過髓腔暴露法建立了一個(gè)范圍明確可控的牙髓炎模型,解決了臨床上不能準(zhǔn)確評(píng)估牙髓炎癥范圍的治療難題。此外,本實(shí)驗(yàn)還具有一定的創(chuàng)新性,首先由于TIMP-1目前在口腔方向應(yīng)用的研究較少,僅有一項(xiàng)將TIMP-1作為蓋髓藥物在大鼠健康牙髓中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)[4],在該實(shí)驗(yàn)中TIMP-1的濃度為200 ng/ml,本研究作為一項(xiàng)前瞻性的研究就選擇了相同的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn),但是本實(shí)驗(yàn)選取的是牙髓炎癥模型,因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以設(shè)置濃度梯度實(shí)驗(yàn),分析TIMP-1的濃度是否對(duì)其在炎癥牙髓中的作用產(chǎn)生影響。其次,該文獻(xiàn)應(yīng)用TIMP-1進(jìn)行蓋髓實(shí)驗(yàn)時(shí),使用明膠海綿作為載體,吸取TIMP-1溶液后蓋髓,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了嘗試發(fā)現(xiàn)使用明膠海綿會(huì)導(dǎo)致玻璃離子充填空間不足或充填后易脫落,因此本實(shí)驗(yàn)將這一步改進(jìn)成牙髓止血后用吸取TIMP-1的無(wú)菌棉球覆蓋牙髓斷面5 min進(jìn)行給藥。