達(dá)格列凈在ox-LDL誘導(dǎo)形成的THP-1源性泡沫細(xì)胞焦亡中的作用

龔才偉,趙廣建,劉大男,歐航君,趙權(quán)威,李 輝

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是動(dòng)脈血管壁脂質(zhì)聚積的慢性炎癥性疾病[1],嚴(yán)重危害人類健康,是心血管疾病致死、致殘的主要病因。巨噬細(xì)胞是AS斑塊的主要組成細(xì)胞,既能吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞,又能分泌多種促炎細(xì)胞因子來(lái)維持局部炎癥反應(yīng),進(jìn)而導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定[2-3]。細(xì)胞焦亡是一種與炎癥相關(guān)的新型程序性細(xì)胞死亡,最初發(fā)現(xiàn)于巨噬細(xì)胞,其發(fā)生機(jī)制主要分為依賴于半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(cystein-containing aspartate-specific protease,Caspase)-1的經(jīng)典途徑和依賴于Caspase-4/5/11的非經(jīng)典途徑[4]。研究[5]表明,細(xì)胞焦亡在AS的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。目前,臨床上用于調(diào)脂、穩(wěn)定斑塊的抗AS藥物主要是他汀類藥物,其不良反應(yīng)多,規(guī)律用藥后仍難以有效終止AS的進(jìn)展。研究[6]已證實(shí),達(dá)格列凈(dapagliflozin,DAPA)可減輕AS、減少巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn),并增強(qiáng)斑塊的穩(wěn)定性,但其作用機(jī)制不明。該研究擬通過(guò)ox-LDL誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞構(gòu)建THP-1源性泡沫細(xì)胞焦亡模型,探討DAPA對(duì)THP-1源性泡沫細(xì)胞焦亡的調(diào)控作用,為DAPA用于防治AS及其相關(guān)疾病提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人急性單核白血病細(xì)胞系THP-1細(xì)胞購(gòu)于江蘇齊氏生物科技有限公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)主要試劑和儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基 (產(chǎn)品代碼:L210KJ )、胎牛血清 (貨號(hào):S660JY )購(gòu)于上海源培生物科技股份有限公司;人源氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL,批號(hào):YB-002)購(gòu)于廣州奕元公司;佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA,批號(hào):P8139)、達(dá)格列凈(dapagliflozin,DAPA,產(chǎn)品編號(hào):SML2804)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)法-8(CCK-8) 試劑盒購(gòu)于上海東仁化學(xué)科技有限公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO,貨號(hào):D8371)、Hoechst 33342/碘化丙啶(ropidium iodide,PI)、油紅O試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所;Millex-HV 0.45 μm PVDF膜購(gòu)于美國(guó)Millipore有限公司;核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nod-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(cystein-containing aspartate-specific protease-1,Cleaved caspase-1)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)、消皮素D(gasdermin-D,GSDMD)氮端片段(GSDMD-N)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-18、IL-1β抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司;GAPDH抗體購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司;山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor? 488)購(gòu)于美國(guó)Abcam公司;NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD、IL-1β、IL-18引物由通用生物(安徽)股份有限公司設(shè)計(jì)并合成;TRIzol RNA提取試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒購(gòu)自南京(諾唯贊)生物科技有限公司;倒置生物顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司;多功能酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) THP-1為懸浮細(xì)胞,將其置于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),待細(xì)胞密度為2×108/L ～2×109/L時(shí)進(jìn)行傳代,傳代至第3代后進(jìn)行鋪板,并進(jìn)行后續(xù)藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2THP-1源性巨噬細(xì)胞的制備 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1細(xì)胞加入含160 nmol/L PMA、10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h誘導(dǎo)分化為THP-1源性巨噬細(xì)胞。

1.2.3THP-1源性泡沫細(xì)胞焦亡模型的構(gòu)建 將獲得的THP-1源性巨噬細(xì)胞更換新鮮的含有160 nmol/L PMA、10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液,加入終濃度為100 μg/ml的ox-LDL,共同孵育24 h,即可成功構(gòu)建THP-1源性泡沫細(xì)胞焦亡模型用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4藥物干預(yù)和實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞密度調(diào)整為4×106/L鋪于6孔板之后,使用ox-LDL或(和)DAPA對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞進(jìn)行處理,并分為以下3組:① 空白對(duì)照(NC)組,正常THP-1細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)THP-1源性巨噬細(xì)胞24 h;② ox-LDL組,采用終濃度為100 μg/ml的ox-LDL處理THP-1源性巨噬細(xì)胞24 h;③ 藥物干預(yù)(ox-LDL+DAPA)組,根據(jù)1.2.6項(xiàng)中THP-1源性巨噬細(xì)胞活性最好的DAPA濃度進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn),用該濃度DAPA預(yù)處理THP-1源性巨噬細(xì)胞2 h,再加入ox-LDL(100 μg/ml)后培養(yǎng)細(xì)胞24 h。

1.2.5以油紅O法檢測(cè)THP-1源性巨噬細(xì)胞泡沫化水平 泡沫細(xì)胞建模結(jié)束后,移除細(xì)胞培養(yǎng)基,用PBS洗2次,加油紅O固定液固定30 min;棄去固定液,用PBS冼2次;加入60%異丙醇浸冼30 s;棄去60%異丙醇后加入新配制好的油紅O染色液,浸染20 min;棄去染色液,60%異丙醇漂冼30 s,PBS洗5次;加入Mayer蘇木精染色液,復(fù)染核2 min;棄去染液后PBS洗5次;加入油紅O緩沖液1 min后, 棄去油紅O緩沖液;加入PBS液覆蓋細(xì)胞并在顯微鏡下觀察,細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)為紅色,胞核為藍(lán)色。

1.2.6CCK-8法檢測(cè)DAPA對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞活力的影響 將DAPA溶于DMSO,THP-1源性巨噬細(xì)胞調(diào)整濃度為細(xì)胞4×105個(gè)/ml懸液,接種于96孔板中每孔100 μl,設(shè)5個(gè)復(fù)孔;分別加入0.2% DMSO和不同濃度的DAPA( 0、1、5、10、50、100、500 μmol/L)預(yù)處理2 h,加入100 μg/ml ox-LDL共孵育24 h。每孔加入CCK-8溶液10 μl培養(yǎng)1～4 h,用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)各組的吸光度(absorbance,A)值,計(jì)算細(xì)胞活力CV。CV=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白孔)/(A對(duì)照組-A空白孔) ×100%。將濃度為0 μmol/L DAPA組對(duì)應(yīng)的A值設(shè)置設(shè)為100%,其余各組結(jié)果均以此為參考,用百分比表示,以未對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯毒性的最大濃度作為最佳濃度進(jìn)行下一步的干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.7Hoechst 33342/PI雙染檢測(cè)THP-1源性泡沫細(xì)胞焦亡 選擇6孔板中生長(zhǎng)密度為80%～90% THP-1源性泡沫細(xì)胞焦亡模型,使用PBS潤(rùn)洗后,依據(jù)Hoechst 33342/PI雙染試劑盒說(shuō)明書(shū)先后加入1 ml細(xì)胞染色緩沖液、5 μl Hoechst 33342染色液、5 μl PI染色液,混勻后冰上孵育30 min,再用PBS洗滌1次,置于倒置熒光顯微鏡下檢測(cè)熒光,Hoechst 33342為藍(lán)色,PI為紅色。

1.2.8THP-1源性泡沫細(xì)胞免疫熒光雙染 DAPI(藍(lán)色)和Caspase-1(綠色)雙染用于評(píng)估DAPA對(duì)THP-1源性泡沫細(xì)胞焦亡中焦亡關(guān)鍵因子Caspase-1表達(dá)的影響。首先將THP-1細(xì)胞以4×106/L密度鋪于6孔板中,將其誘導(dǎo)為THP-1源性巨噬細(xì)胞,在焦亡誘導(dǎo)處理之后,用PBS輕輕潤(rùn)洗3次,每次5 min;向每個(gè)孔中加入適量的4%多聚甲醛溶液,室溫下固定15 min;去掉固定液,加入PBS清洗3次,每次5 min;每個(gè)樣本浸于0.5%Triton X-100破膜液中,室溫孵育15 min進(jìn)行通透處理;其次予10%山羊血清封閉30 min后,吸凈封閉液后,每孔加入適量的Caspase-1一抗4 ℃孵育過(guò)夜,次日滴加二抗,37 ℃避光孵育90 min,取出各組細(xì)胞爬片,然后用DAPI復(fù)染細(xì)胞核,避光室溫孵育10 min,最后封片和成像。

1.2.9采用LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LDH活性 LDH活性能夠有效地反映細(xì)胞膜的完整性與否,常用來(lái)評(píng)估細(xì)胞受損程度。根據(jù)LDH活性檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)制備細(xì)胞樣本、標(biāo)準(zhǔn)品,并將制備的標(biāo)本轉(zhuǎn)移至96孔板中,使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔A值并計(jì)算細(xì)胞中LDH的活性:LDH活性(%)=(A樣品-A對(duì)照孔)/(A標(biāo)準(zhǔn)品-A對(duì)照孔)×100%。

1.2.10Western blot檢測(cè)NLRP3、Cleaved caspase-1、ASC、GSDMD-N、IL-18、IL-1β蛋白表達(dá) 收集培養(yǎng)的各組細(xì)胞,經(jīng)PBS潤(rùn)洗后,加入RIPA裂解液,冰上裂解30 min,將裂解物轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管,于4 ℃,12 000 r/min高速離心10 min,取上清液,加入4倍體積的5×Loading buffer,100 ℃條件下加熱10 min,后采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白上樣,經(jīng)SDS-PAGE電泳分離,轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上后,采用5%脫脂牛奶室溫下封閉目的條帶2 h,其次用TBST洗膜3次,10 min/次;然后分別加入NLRP3、Cleaved caspase-1、ASC、GSDMD-N、IL-18、IL-1β單克隆抗體(1 ∶1 000)或GAPDH一抗(1 ∶10 000),4 ℃冰箱搖床孵育過(guò)夜,第2天用TBST洗膜3次,10 min/次,之后加入羊抗兔IgG(1 ∶10 000) 室溫?fù)u床孵育2 h,TBST洗膜3次,10 min/次,洗膜后ECL顯影用凝膠圖像處理器分析圖像,GAPDH作為內(nèi)參照,目的蛋白與其灰度比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.11qRT-PCR檢測(cè)NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD、IL-18、IL-1βmRNA表達(dá) 用TRIzol試劑從細(xì)胞樣本中提取總RNA,并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR qPCR Master Mix試劑盒檢測(cè)qRT-PCR,檢測(cè)前述焦亡功能因子和內(nèi)參GAPDHmRNA的表達(dá)。以GAPDH為內(nèi)參,使用2-ΔΔCt法分析mRNA表達(dá)的相對(duì)倍數(shù)變化。每個(gè)樣品的分析重復(fù)3次。本實(shí)驗(yàn)所用實(shí)時(shí)定量PCR目的基因引物序列如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR目的基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 THP-1巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)、分化未經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化的THP-1單核細(xì)胞呈透亮圓形或類圓形狀態(tài),懸浮狀生長(zhǎng),細(xì)胞表面光滑,無(wú)偽足(圖1A)。加入PMA誘導(dǎo)分化24 h后則分化為人巨噬細(xì)胞,細(xì)胞由懸浮狀態(tài)變?yōu)橘N壁狀態(tài),細(xì)胞伸出偽足,呈不規(guī)則、貼壁狀生長(zhǎng)(圖1B)。

圖1 THP-1分化為巨噬細(xì)胞 ×200A:THP-1單核細(xì)胞;B:THP-1源性巨噬細(xì)胞

2.2 CCK-8篩選DAPA的最佳干預(yù)濃度THP-1源性巨噬細(xì)胞經(jīng)不同濃度的DAPA干預(yù)24 h后,結(jié)果如圖2所示,與0 μmol/L組相比,溶劑DMSO (0.2%DMSO)組細(xì)胞活性無(wú)顯著變化;除DAPA濃度為10 μmol/L時(shí)THP-1源性巨噬細(xì)胞活性無(wú)顯著性變化,其余組隨著DAPA濃度升高,細(xì)胞活性出現(xiàn)下降趨勢(shì);其中,濃度為50、100和500 μmol/L時(shí),細(xì)胞活性減低(F=31.67,P<0.05)。因此,10 μmol/L DAPA是不影響THP-1源性巨噬細(xì)胞活性的最大濃度,可作為DAPA的最佳干預(yù)濃度。

圖2 CCK-8檢測(cè)DAPA干預(yù)對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞活性的影響與0 μmol/L DAPA組比較:*P<0.05

2.3 油紅O染色檢測(cè)THP-1源性泡沫細(xì)胞焦亡模型的構(gòu)建及DAPA(10 μmol/L)對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)形成的泡沫細(xì)胞泡沫化水平的影響油紅O染色結(jié)果顯示,在NC組中,THP-1源性巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)幾乎沒(méi)有或僅有少量脂質(zhì)沉積,見(jiàn)圖3A;與NC組比較,ox-LDL組中THP-1源性巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有顯著增多、變大的亮紅色脂滴呈典型泡沫細(xì)胞形態(tài),說(shuō)明THP-1源性泡沫細(xì)胞焦亡模型的構(gòu)建成功,見(jiàn)圖3B;與ox-LDL組比較,ox-LDL+DAPA(10 μmol/L)組中THP-1源性巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)紅色脂滴顯著減少、變小,提示泡沫細(xì)胞生成的數(shù)量明顯減少,見(jiàn)圖3C。說(shuō)明10 μmol/L的DAPA可有效抑制由ox-LDL誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞的形成。

圖3 油紅O染色檢測(cè)泡沫細(xì)胞焦亡模型的構(gòu)建及DAPA對(duì)泡沫細(xì)胞泡沫化水平的影響 ×400A:NC組;B:ox-LDL組;C:ox-LDL+DAPA組

2.4 DAPA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)形成的THP-1源性泡沫細(xì)胞焦亡的影響

2.4.1qRT-PCR檢測(cè)DAPA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)形成的泡沫細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD、IL-18和IL-1βmRNA的表達(dá)水平的影響 與NC組相比,ox-LDL組ox-LDL誘導(dǎo)形成的泡沫細(xì)胞中焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD、IL-18和IL-1βmRNA的表達(dá)水平均升高(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與ox-LDL組相比,ox-LDL+DAPA組DAPA處理后上述指標(biāo)水平均降低(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4。

圖4 DAPA對(duì)各組中NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD、IL-18、IL-1β mRNA表達(dá)水平的影響A:ASC;B:Caspase-1;C:GSDMD;D:IL-1β;E:IL-18;F:NLRP3;與NC組比較:*P<0.05 (n=3);與ox-LDL組比較:#P<0.05(n=3)

2.4.2Western blot檢測(cè)DAPA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)形成的泡沫細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Cleaved caspase-1、ASC、GSDMD-N、IL-18和IL-1β蛋白表達(dá)水平的影響 與NC組相比,ox-LDL組ox-LDL誘導(dǎo)形成的泡沫細(xì)胞中焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Cleaved caspase-1、ASC、GSDMD-N、IL-18和IL-1β 蛋白的表達(dá)水平均升高(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與ox-LDL組相比,ox-LDL+DAPA組DAPA處理后上述指標(biāo)水平均降低(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖5。

圖5 Western blot檢測(cè)DAPA對(duì)各組中NLRP3、Cleaved caspase-1、ASC、GSDMD-N、IL-18、IL-1β蛋白表達(dá)水平的影響A:灰?guī)D;B:ASC;C:Cleaved caspase-1;D:GSDMD-N;E:IL-1β;F:IL-18;G:NLRP3;與NC組比較:*P<0.05(n=3);與ox-LDL組比較:#P<0.05(n=3)

2.4.3Hoechst 33342/PI雙染和LDH釋放試驗(yàn)評(píng)估DAPA對(duì)THP-1源性泡沫細(xì)胞焦亡的影響 Hoechst 33342/PI雙染結(jié)果及LDH釋放試驗(yàn)顯示,與NC組相比,ox-LDL組中THP-1源性泡沫細(xì)胞PI陽(yáng)性細(xì)胞比例升高且LDH活性升高(P<0.05);與ox-LDL組相比,ox-LDL+DAPA組THP-1源性泡沫細(xì)胞PI陽(yáng)性細(xì)胞比例降低(P<0.05)且LDH活性降低。見(jiàn)圖6。

圖6 Hoechst 33342/PI雙染和LDH釋放試驗(yàn)評(píng)估DAPA對(duì)THP-1源性泡沫細(xì)胞焦亡的影響A:Hoechst 33342/PI雙染 ×100;B:各組PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例;C:各組LDH活性比較;與NC組比較:*P<0.05(n=3);與ox-LDL組比較:#P<0.05(n=3)

2.4.4細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)DAPA對(duì)泡沫細(xì)胞焦亡模型中焦亡關(guān)鍵蛋白Caspase-1表達(dá)的影響 與NC組相比,ox-LDL組ox-LDL誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞焦亡模型中Caspase-1熒光強(qiáng)度(綠色)明顯增強(qiáng)(P<0.05);與ox-LDL組相比,ox-LDL+DAPA組DAPA處理后Caspase-1熒光強(qiáng)度減弱(P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明DAPA可抑制泡沫細(xì)胞焦亡模型中焦亡關(guān)鍵蛋白Caspase-1的表達(dá)。見(jiàn)圖7。

圖7 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)DAPA對(duì)泡沫細(xì)胞焦亡模型中Caspase-1表達(dá)的影響A:Caspase-1細(xì)胞免疫熒光雙染 ×100;B:各組Caspase-1熒光強(qiáng)度;與NC組比較:*P<0.05 (n=3);與ox-LDL組比較:#P<0.05(n=3)

3 討論

AS是一種進(jìn)行性病變,是大多數(shù)心血管疾病的重要病理基礎(chǔ),脂質(zhì)代謝不平衡和不適宜的炎癥反應(yīng)共同參與了AS病變的進(jìn)展,其特征是大動(dòng)脈中脂質(zhì)和纖維成分的積聚。巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和脂質(zhì)沉積是粥樣斑塊形成的關(guān)鍵步驟,泡沫細(xì)胞的形成,被廣泛認(rèn)為是AS的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素[3]。ox-LDL是巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程中膽固醇的主要來(lái)源,血管內(nèi)膜下的巨噬細(xì)胞吞噬大量ox-LDL轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞,促進(jìn)AS斑塊形成[3]。在本研究中,THP-1源性的巨噬細(xì)胞用ox-LDL處理后,經(jīng)油紅O染色,結(jié)果如圖3B所示,細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有大量紅色脂滴蓄積,細(xì)胞體積增大,符合泡沫細(xì)胞形態(tài),表明THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

DAPA是鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抑制劑(sodium-glucose cotransporter 2 inhibitors,SGLT2i)成員之一,其通過(guò)選擇性地抑制SGLT2來(lái)減少腎小管對(duì)葡萄糖的重吸收和增加尿糖排出而降低血糖[7]。有研究[8]表明,SGLT2i可通過(guò)降低血糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的“毒性”而發(fā)揮抗炎癥和抗氧化潛能進(jìn)而延緩AS。Terasaki et al[9]發(fā)現(xiàn)SGLT2i可抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成,從而發(fā)揮抗AS的作用;在本研究中,以DAPA干預(yù)ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1源性的巨噬細(xì)胞后得到了類似的結(jié)果:油紅O染色結(jié)果顯示,與ox-LDL組相比,DAPA組巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的紅色脂滴明顯減少,細(xì)胞體積減小。以上研究說(shuō)明DAPA能夠抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞形成。

巨噬細(xì)胞在AS病變中扮演著重要的角色,巨噬細(xì)胞中紊亂的脂質(zhì)代謝是泡沫細(xì)胞產(chǎn)生的主要原因,這些脂質(zhì)不能清除時(shí),其可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡。細(xì)胞焦亡的主要特征之一為由Caspase-1下游的GSDMD家族蛋白介導(dǎo)細(xì)胞膜膜孔形成,造成細(xì)胞膜的完整性喪失、細(xì)胞腫脹、細(xì)胞溶解、細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)容物和促炎細(xì)胞因子如LDH、IL-18和IL-1β釋放到細(xì)胞外。因此,檢測(cè)上清液中的LDH活性可反應(yīng)細(xì)胞的活性情況,檢測(cè)細(xì)胞IL-18和IL-1β的蛋白表達(dá)情況可反應(yīng)炎癥情況。既往多項(xiàng)研究[10-11]表明,ox-LDL和膽固醇晶體均能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體的形成并激活Caspase-1,刺激IL-Iβ和IL-18的表達(dá)。Xu et al[12]研究表明,在晚期的AS斑塊中,巨噬細(xì)胞焦亡促進(jìn)壞死核心的形成和斑塊的不穩(wěn)定,進(jìn)而誘發(fā)急性心血管事件發(fā)生。在冠狀A(yù)S斑塊中,NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-Iβ和IL-18表達(dá)明顯增高[13]。NLRP3抑制劑可抑制AS小鼠中巨噬細(xì)胞焦亡,下調(diào)AS小鼠中巨噬細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的表達(dá)[14]。因此,通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞焦亡可能延緩AS的發(fā)生和發(fā)展。DAPA是國(guó)內(nèi)第一個(gè)上市的SGLT2i降糖藥,研究[15]表明,DAPA能抑制糖尿病ApoE-/-小鼠中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18的表達(dá)。Liu et al[6]研究中提到,SGLT2i可通過(guò)抑制血管炎癥、減輕氧化應(yīng)激和減少泡沫細(xì)胞形成等機(jī)制改善AS的進(jìn)展。在本研究中,通過(guò)ox-LDL刺激巨噬細(xì)胞后顯示,THP-1源性泡沫細(xì)胞中NLRP3、Cleavedcaspase-1、ASC、GSDMD-N、IL-18、IL-1βmRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高,PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及LDH活性明顯增加,予以DAPA干預(yù)后,上述焦亡相關(guān)蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)水平、PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及LDH活性均被明顯抑制;細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示,ox-LDL刺激巨噬細(xì)胞后,Caspase-1的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),予以DAPA干預(yù)后,熒光強(qiáng)度明顯減弱。這些結(jié)果說(shuō)明了DAPA抑制了THP-1源性泡沫細(xì)胞焦亡。

綜上所述,DAPA能有效抑制NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD、IL-18、IL-1β的表達(dá),進(jìn)而抑制了THP-1源性泡沫細(xì)胞焦亡,并能抑制泡沫細(xì)胞的形成。該研究?jī)H從細(xì)胞層面驗(yàn)證了DAPA抑制泡沫細(xì)胞焦亡的作用,下一步擬進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究,為DAPA用于防治AS提供更多的理論依據(jù)。