桑樹(shù)磷脂酶MaPLA1-2D亞型4個(gè)基因的克隆與脅迫應(yīng)答分析

郝博文,李瑞卿,夏 宇,尚姝婷,李文強(qiáng),張敏娟*

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,陜西楊凌 712100;2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,陜西楊凌 712100)

磷脂酶(phospholipases)是一類(lèi)能夠水解磷脂的酶類(lèi),根據(jù)其水解磷脂位點(diǎn)的不同可將其分為磷脂酶A1(phospholipases A1,PLAl)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD),它們特異地作用于磷脂分子內(nèi)部的各個(gè)酯鍵,形成不同的產(chǎn)物[1]。

磷脂酶A2大量存在于動(dòng)物胰臟和植物組織中,催化水解磷脂的sn-2位?；?磷脂酶A1廣泛分布在動(dòng)物細(xì)胞的溶酶體內(nèi),此外蛇毒及某些微生物中亦有,催化水解膜磷脂sn-1?；?二者催化磷脂水解產(chǎn)生游離脂肪酸和溶血磷脂[2]。大量研究表明,PLC和PLD在植物生長(zhǎng)發(fā)育、生物脅迫及非生物脅迫中起重要的調(diào)控作用[3-4]。

截至目前,有關(guān)植物磷脂酶A1的研究較為缺乏,已有報(bào)道集中在植物PLA1基因家族的序列分析和表達(dá)分析上,如亞麻芥(Camelinasativa)[5]、玉米(Zeamays)[6]、油菜(Brassicanapus)[7]、百合(Liliumbrownii)[8]、水稻(Oryzasativa)[9]等。

研究表明,植物花藥不開(kāi)裂基因(DAD1,defective in anther dehiscence1)產(chǎn)物具有磷脂酶A1活性,對(duì)其功能的解析相對(duì)深入。擬南芥AtDAD基因通過(guò)參與JA合成調(diào)節(jié)花藥開(kāi)裂[2]。辣椒(Capsicumfrutescens)CaPLA1在擬南芥中促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)[10]。麻瘋樹(shù)(Jatrophacurcas)JcDAD1通過(guò)參與JA合成途徑調(diào)節(jié)花和果實(shí)的發(fā)育[11]。

因此,充分了解各磷脂酶的生化特性、時(shí)空表達(dá)關(guān)系以及脂質(zhì)分子之間的轉(zhuǎn)化關(guān)系將有利于深入解析植物磷脂酶的生物學(xué)功能,并促進(jìn)磷脂酶基因在植物育種中的應(yīng)用。

桑樹(shù)(MorusalbaL.)屬?？粕?自然類(lèi)型多、分布區(qū)域廣泛、在中國(guó)栽培歷史悠久。桑樹(shù)具有抗寒、抗旱、耐水濕特性,其果實(shí)、葉片、根等部分可食用、藥用、飼用、觀賞用,兼具經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)價(jià)值[12-14]。

近年來(lái),桑樹(shù)作為修復(fù)植物已廣泛用于脆弱環(huán)境的生態(tài)治理[15-17]。本研究克隆桑樹(shù)磷脂酶A1-2D亞家族基因,分析其亞細(xì)胞定位、時(shí)空表達(dá)及脅迫誘導(dǎo)表達(dá)模式,以進(jìn)一步深入解析磷脂酶的生物學(xué)功能,促進(jìn)磷脂酶基因在植物育種中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及干旱脅迫處理方法

成齡桑樹(shù)‘紅果2號(hào)’在周至桑樹(shù)種質(zhì)資源圃種植;本氏煙草和桑樹(shù)幼苗在本實(shí)驗(yàn)室種植。

選取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的40 d苗齡桑樹(shù)幼苗,進(jìn)行干旱脅迫實(shí)驗(yàn),每個(gè)處理3株幼苗,干旱處理:桑樹(shù)幼苗澆透水后斷水模擬土壤自然干旱過(guò)程,對(duì)照組正常澆水。用土壤水分測(cè)量?jī)x(TRIME-PICO 64/32 TDR,北京易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司)測(cè)定土壤水分,從而評(píng)估土壤干旱程度。當(dāng)土壤含水量為0時(shí),即視為干旱脅迫第1天,于處理第4天取樣。脫落酸(ABA)處理:以5 mL 0.1 mmol/L ABA溶液噴施幼苗,處理24 h后取樣;高鹽脅迫:采用100 mL 300 mmol/L NaCl溶液澆灌處理盆栽幼苗,處理第3天取樣;低溫脅迫:將幼苗置于4 ℃條件下處理24 h后取樣。以上處理結(jié)束后,采集第三葉位(自上而下)葉片,經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 目的基因RT-PCR擴(kuò)增及克隆

從NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得桑樹(shù)磷脂酶基因序列和氨基酸序列,并用在線(xiàn)軟件Conserved Domain Search Service (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析候選序列的磷脂酶結(jié)構(gòu)域。

以桑樹(shù)‘紅果2號(hào)’葉片為材料,參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA(MiniBEST Universal RNA Extraction Kit,TaKaRa)并反轉(zhuǎn)錄成cDNA(PrimeScriptTMRT reagent Kit,TaKaRa)。以cDNA作為模板擴(kuò)增目的基因,引物序列見(jiàn)表1。

表1 MaPLA1-2D基因克隆所用引物序列

PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性10 min;94 ℃變性30 s;55 ℃退火45 s;72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃反應(yīng)10 min。

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳(130 V,200 mA)檢測(cè),回收目的DNA片段并克隆至pMD18-T載體(TaKaRa,Dalian),轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 生物信息學(xué)分析

蛋白分子量、等電點(diǎn)(pI)等蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)采用ExPasy數(shù)據(jù)庫(kù)(https://web.expasy.org/protparam/);氨基酸序列比對(duì)分析使用在線(xiàn)軟件PRALINE(https://www.ibi.vu.nl/programs/pralinewww/);保守結(jié)構(gòu)域分析使用Conserved Domain Search Service數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi);基因結(jié)構(gòu)分析使用Gene Structure Display Server 2.0軟件(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/);系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建利用軟件MEGA 7.0,采用鄰接法(Neighbor-Joining);啟動(dòng)子分析用Plantcare數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/);蛋白信號(hào)肽和跨膜區(qū)預(yù)測(cè)利用SignalP-5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)和TMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)。

1.4 蛋白亞細(xì)胞定位

回收4個(gè)MaPLA1-2D基因序列的雙酶切目的基因片段和表達(dá)載體p35S-GFP(pCAMIBA1301骨架)進(jìn)行連接后獲得p35S∷MaPLA1-2Ds-GFP融合表達(dá)載體,電擊法轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒至農(nóng)桿菌GV3101后作為蛋白亞細(xì)胞定位載體;分別將含有空載p35S-GFP和p35S∷MaPLA1-2Ds-GFP重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌在YEP培養(yǎng)基中培養(yǎng)至D600為1.0,然后注射本氏煙草葉片(20 d苗齡),每株注射2～3片,3個(gè)重復(fù)。

暗培養(yǎng)1 d后正常光照培養(yǎng)2 d,然后取葉片下表皮在激光共聚焦顯微鏡(ST8,Lecia)下觀察GFP熒光信號(hào)。

1.5 qRT-PCR基因表達(dá)

根據(jù)桑樹(shù)4個(gè)MaPLA1-2D基因序列設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表2),利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)4個(gè)MaPLA1-2D基因在桑樹(shù)不同組織或各種非生物脅迫下的基因表達(dá)量。

表2 qRT-PCR引物序列

熒光定量PCR使用Bio-Rad CFX96 Touch熒光定量PCR儀,qRT-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序按照PrimeScriptTMRT reagent Kit(Takara)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,每個(gè)基因設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù),以桑樹(shù)Actin基因?yàn)閮?nèi)參,采用2-ΔΔCT法分析基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 MaPLA1-2D基因克隆與序列分析

以植物PLA1典型結(jié)構(gòu)域序列搜索桑樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI:txid981085)獲得MaPLA1-2D基因序列,設(shè)計(jì)引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到4個(gè)MaPLA1-2D基因(圖1,A),命名為MaPLA1-2D.1～MaPLA1-2D.4,其編碼蛋白介于399～443個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)分子量介于45～50 kD。MaPLA1-2D.1蛋白等電點(diǎn)為8.81,MaPLA1-2D.2～4等電點(diǎn)分別為5.62、5.95和5.38,均為不穩(wěn)定蛋白和親水蛋白(表3),且4個(gè)MaPLA1-2D蛋白序列中均不含有信號(hào)肽和跨膜區(qū)。

A. 桑樹(shù)MaPLA1-2D.1/2/3/4基因的PCR克隆, M. DL2000;泳道1～4分別為MaPLA1-2D.1/2/3/4基因PCR產(chǎn)物;B. 桑樹(shù)MaPLA1-2D.1/2/3/4基因結(jié)構(gòu)分析;C. MaPLA1-2D.1/2/3/4基因與擬南芥AtDAD1、水稻OsDAD1氨基酸序列比對(duì),以方框標(biāo)示酯酶盒基序GHSLG;D. MaPLA1-2D.1/2/3/4基因進(jìn)化分析。圖1 MaPLA1-2D.1/2/3/4基因克隆及序列分析A. PCR cloning of MaPLA1-2D.1/2/3/4. M. DL2000; Lanes 1-4 are the PCR products of MaPLA1-2D.1/2/3/4, respectively; B. Gene structure analysis of MaPLA1-2D.1/2/3/4 genes; C. Alignment of amino acid sequences of MaPLA1-2D.1/2/3/4 and AtDAD1 and OsDAD1, box indicate motif GHSLG; D. Phylogenetic analysis of MaPLA1-2D.1/2/3/4.Fig.1 MaPLA1-2D.1/2/3/4 gene cloning and sequence analysis

表3 桑樹(shù)MaPLA1-2D蛋白理化性質(zhì)

基因結(jié)構(gòu)分析顯示,MaPLA1-2D.3基因序列有2個(gè)內(nèi)含子,其余3個(gè)成員基因序列中均沒(méi)有內(nèi)含子序列(圖1,B)。蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析表明MaPLA1-2D 4個(gè)成員蛋白質(zhì)序列都含有三酰甘油脂酶結(jié)構(gòu)域(PLN02454)。蛋白質(zhì)多序列比對(duì)結(jié)果表明,MaPLA1-2D 4個(gè)成員與擬南芥AtDAD1和水稻OsDAD1具有相似性,且均含有酯酶盒GHSLG結(jié)構(gòu)域(圖1,C)。

序列進(jìn)化分析表明,MaPLA1-2D 4個(gè)成員明顯聚類(lèi)在一起(圖1D),表明其進(jìn)化關(guān)系非常密切;MaPLA1-2D與擬南芥AtpPLA1-2D和AtDAD1以及水稻OsDAD1位于不同分支(圖1,D),表明木本植物桑樹(shù)和擬南芥、水稻的磷脂酶A1在序列上有明顯的分化。

2.2 MaPLA1-2D基因啟動(dòng)子區(qū)功能元件分析

以MaPLA1-2D基因4個(gè)成員的核酸序列搜索桑樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù),找到每個(gè)基因編碼區(qū)所在的川?；蚪M序列疊連群contig,獲取起始密碼子上游2 500 bp的核酸序列用于下一步元件分析。經(jīng)Plantcare數(shù)據(jù)庫(kù)分析MaPLA1-2D基因上游2 500 bp DNA序列,結(jié)果表明MaPLA1-2D基因4個(gè)成員的啟動(dòng)子區(qū)含有多種生物脅迫和非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)順式作用元件,如低溫響應(yīng)元件LTR、防御及脅迫響應(yīng)元件(TC-rich repeats)、厭氧誘導(dǎo)元件ARE等(表4)。

表4 MaPLA1-2D基因啟動(dòng)子區(qū)序列順式作用元件分布

如表4所示,除MaPLA1-2D.3外,另外幾個(gè)成員的基因啟動(dòng)子區(qū)均含有干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件(MBS);各成員的啟動(dòng)子區(qū)均含有激素響應(yīng)元件,如脫落酸響應(yīng)元件(ABA responsive element)、水楊酸應(yīng)答元件(SA responsive element)、茉莉酸響應(yīng)元件(MeJA responsive element);MaPLA1-2D.2和MaPLA1-2D.4基因啟動(dòng)子還含有赤霉素應(yīng)答元件(GA responsive element),MaPLA1-2D.1/3基因啟動(dòng)子還含有乙烯應(yīng)答元件(Ethylene responsive element, ERE),MaPLA1-2D.1基因啟動(dòng)子含有生長(zhǎng)素應(yīng)答元件TGA-element。

2.3 MaPLA1-2D蛋白的亞細(xì)胞定位

為了分析MaPLA1-2D.1～ MaPLA1-2D.4蛋白亞細(xì)胞定位,構(gòu)建了p35S∷MaPLA1-2Ds-GFP融合表達(dá)載體,農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化煙草后觀察綠色熒光信號(hào)。

結(jié)果表明,在轉(zhuǎn)化p35S-GFP空載的煙草葉表皮細(xì)胞中,GFP熒光分布于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中(圖2)。

綠色是GFP蛋白激發(fā)的熒光;紅色是葉綠體自發(fā)熒光。圖2 桑樹(shù)PLA1-2D.1/2/3/4亞細(xì)胞定位結(jié)果Green indicates the fluorescence excited by GFP protein; red is the chloroplast autofluorescence.Fig.2 Subcellular localization of mulberry PLA1-2D.1/2/3/4

在分別注射含4個(gè)p35S∷MaPLA1-2Ds-GFP重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌后,煙草葉表皮細(xì)胞中綠色熒光信號(hào)明顯與葉綠體自發(fā)紅色熒光信號(hào)相重疊(圖2),說(shuō)明MaPLA1-2D.1～ MaPLA1-2D.4蛋白均定位于葉綠體。

2.4 MaPLA1-2D基因的組織表達(dá)模式和脅迫應(yīng)答分析

qRT-PCR結(jié)果表明4個(gè)MaPLA1-2D基因在桑樹(shù)冬芽、葉、根、雄花(staminate flower)和雌花(pistillate flower)中均有表達(dá),但在葉和根中表達(dá)水平較高,其中MaPLA1-2D.1在根中表達(dá)水平最高(圖3,A)。進(jìn)一步利用qRT-PCR分析MaPLA1-2D基因4個(gè)成員在干旱、脫落酸(ABA)、高鹽和低溫脅迫處理后基因表達(dá)情況(圖3,B)。結(jié)果顯示,4個(gè)MaPLA1-2D基因的表達(dá)均受干旱、ABA、高鹽和低溫脅迫誘導(dǎo),其中干旱和ABA處理導(dǎo)致4個(gè)MaPLA1-2D基因的表達(dá)均劇烈上調(diào),鹽脅迫處理對(duì)MaPLA1-2D.2基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用相對(duì)明顯。

圖中誤差線(xiàn)表示標(biāo)準(zhǔn)誤,不同字母表示P<0.05水平具有顯著性差異。圖3 桑樹(shù)PLA1-2D基因在5個(gè)不同組織中的表達(dá)模式和非生物脅迫表達(dá)模式Data is mean±standard error (SE) and different letters in a column indicate significant difference at P< 0.05 level.Fig.3 Expression model of MaPLA1-2D genes in 5 tissues and under abiotic stresses

3 討 論

磷脂酶是催化磷脂水解釋放游離脂肪酸的一類(lèi)復(fù)雜而重要的酶,在植物體內(nèi)分布廣泛。磷脂酶幾乎參與植物體所有的生命階段,尤其在響應(yīng)外界環(huán)境刺激中起著重要的作用[1,4]。植物磷脂酶A分為3個(gè)家族,PLA1、PLA2和patatin-related PLA(pPLA),它們分別催化膜甘油磷脂在sn-1、sn-2以及sn-1和sn-2位上的?；?。每個(gè)家族都由結(jié)構(gòu)、催化和生理特性不同的多種磷脂酶亞型組成。與磷脂酶PLC和PLD相比,有關(guān)植物PLA基因功能的研究極為缺乏。

本研究克隆了桑樹(shù)磷脂酶PLA1其中1個(gè)亞型PLA1-2D,該亞型包括4個(gè)基因,分別命名為MaPLA1-2D.1～MaPLA1-2D.4。蛋白序列分析發(fā)現(xiàn),MaPLA1-2D亞型4個(gè)蛋白的分子量介于45～50 kD之間,4個(gè)蛋白均為親水蛋白且不穩(wěn)定。MaPLA1-2D與擬南芥花藥不開(kāi)裂基因(DAD1,defective in anther dehiscence1)的序列具有相似性。同擬南芥DAD1類(lèi)似,MaPLA1-2D各成員均具有酯酶盒GHSLG和PLA1保守結(jié)構(gòu)域(PLN02408),且蛋白定位在葉綠體,推測(cè)MaPLA1-2D與DAD1可能在功能上具有一些相似性[18]。本研究表明,桑樹(shù)MaPLA1-2D成員在冬芽、葉片、根、雌雄花中都有表達(dá),其中葉片和根的表達(dá)量顯著高于其他組織,暗示MaPLA1-2D可能在桑樹(shù)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮功能。

研究表明,植物PLA1基因啟動(dòng)子區(qū)含有多種脅迫應(yīng)答順式元件且受生物或非生物脅迫誘導(dǎo),如油菜(Brassicanapus)[2,7,19]、亞麻芥(Camelinasativa)[5]、玉米(Zeamays)[6]、百合(Liliumbrownii)[8]、水稻(Oryzasativa)[9,20]、大豆(Glycinemax)[21]和茄子(Solanummelongena)[22]等。對(duì)MaPLA1-2D各成員的啟動(dòng)子區(qū)序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),各成員啟動(dòng)子區(qū)含有干旱響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件及ABA、水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)或乙烯(Ethylene)、赤霉素(GA)的響應(yīng)元件等與脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式元件,表明MaPLA1-2D基因可能在桑樹(shù)應(yīng)答非生物脅迫中發(fā)揮廣泛作用。本研究表明,桑樹(shù)MaPLA1-2D各成員基因表達(dá)均在干旱和ABA處理后劇烈上調(diào),MaPLA1-2D.2還受高鹽處理顯著誘導(dǎo),表明MaPLA1-2D基因在這些非生物脅迫中發(fā)揮功能。

磷脂酶A1參與的α-亞麻酸合成過(guò)程是茉莉酸和茉莉酸甲酯合成途徑中的第一步[19,23-25]。擬南芥AtDAD基因通過(guò)參與JA合成調(diào)節(jié)花藥開(kāi)裂。AtDAD基因編碼1個(gè)磷脂酶A1,主要在葉片、根和花藥中表達(dá),AtDAD1的T-DNA插入突變植株表現(xiàn)為雄性不育,其花藥不能正常開(kāi)裂[18]。dad1突變體花蕾內(nèi)茉莉酸(JA)及其甲酯(MeJA)含量只有野生型的22%,外源施用適量JA或JA合成前體亞麻酸可使突變體花粉發(fā)育恢復(fù)正常水平[18]。辣椒(Capsicumfrutescens)CaPLA1基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)后,轉(zhuǎn)基因植株比野生型植物生長(zhǎng)得更快,表現(xiàn)出較長(zhǎng)的根、葉、葉柄和花序[10]。麻瘋樹(shù)(Jatrophacurcas)JcDAD1基因通過(guò)參與JA合成途徑調(diào)節(jié)花和果實(shí)的發(fā)育[11]。有關(guān)植物PLA1或DAD基因在應(yīng)答干旱和其他脅迫中的功能鮮見(jiàn)報(bào)道。由于桑樹(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化非常困難,下一步構(gòu)建MaPLA1-2D異源表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株將有助于進(jìn)一步明確MaPLA1-2D在脅迫應(yīng)答中的功能。此外,ABA、Ethylene、SA和JA被視為脅迫響應(yīng)激素,植物通過(guò)靈活調(diào)節(jié)激素水平和信號(hào)來(lái)適應(yīng)多種生物或非生物脅迫[19,25-26]。植物已經(jīng)進(jìn)化出多種策略來(lái)整合外源脅迫信號(hào)和內(nèi)源發(fā)育信號(hào),從而優(yōu)化生長(zhǎng)和脅迫反應(yīng)之間的平衡,除了在正常條件下調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育,還介導(dǎo)了各種環(huán)境脅迫反應(yīng)的應(yīng)答,從而調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)適應(yīng)性。桑樹(shù)MaPLA1-2D基因啟動(dòng)子區(qū)有多個(gè)ABA響應(yīng)元件、JA響應(yīng)元件和SA響應(yīng)元件,其在激素介導(dǎo)的非生物脅迫適應(yīng)性中的功能還需要進(jìn)一步研究闡明。