陸地棉MGDG基因家族低磷脅迫下的表達(dá)分析

孟超敏,卿桂霞,耿翡翡,張富厚,李雪林

(河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/河南省旱地作物種質(zhì)資源利用工程研究中心,河南洛陽(yáng) 471000)

單半乳糖甘油二酯(monogalactosyl diacylglycerol,MGDG)和雙半乳糖甘油二酯(digalactosyt diacylglycerol,DGDG)是高等植物光合膜中最主要的半乳糖脂,分別約占葉綠體脂質(zhì)的50%和20%,在葉綠體的類囊體膜中形成必不可少的基質(zhì),參與光合作用的光化學(xué)反應(yīng)和電子傳遞反應(yīng)[1-2]。此外,MGDG和DGDG在質(zhì)體外膜上被發(fā)現(xiàn),包括質(zhì)膜、液泡膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體,說(shuō)明其在高等植物中不具有光合作用[3-4]。單乳糖基二?；视?monolactosyl diacylglycerol,MGDG)是造粉體膜的主要糖脂,約占總糖脂的50%。MGDG生物合成的最后一步發(fā)生在包膜內(nèi),其中MGDG合酶催化二酰基甘油脂(DAG)汞IUDP一半乳糖(UDP—Gal)生成MGDG和UDP[5-6]。根據(jù)MGDG合成酶的酶學(xué)和生理特性,MGDG合成酶可分為A型(MGDl)和B型(MGD2和MGD3)。A型(MGDl)位于質(zhì)體內(nèi)膜,B型(MGD2和MGD3)位于外膜。MGDl在所有植物組織中均有表達(dá),特別是在光合組織中。而MGD2和MGD3主要在非光合組織中表達(dá)[7-8]。

MGDG不僅是光合膜的重要組分,而且對(duì)逆境脅迫具有調(diào)節(jié)作用。當(dāng)植物遭到逆境脅迫時(shí),會(huì)通過(guò)MGDG含量和脂肪酸組成的變化來(lái)適應(yīng)環(huán)境,而這些變化有助于維持和恢復(fù)膜的穩(wěn)定性和完整性,從而增加植物的脅迫耐受性[9]。在低磷脅迫下,膜中的磷脂含量降低,為了維持膜的完整性,會(huì)促進(jìn)MGDG向DGGD的轉(zhuǎn)化,增加膜中的DGDG來(lái)替代缺失的磷脂[10]。低磷條件下,擬南芥中AtMGD1的表達(dá)量并未發(fā)生顯著顯著變化,而AtMGD2和AtMGD3的表達(dá)量顯著上升,這表明低磷條件可以誘導(dǎo)激活type B型MGD的表達(dá)[8]。當(dāng)膜脂成分中的磷脂含量降低時(shí),會(huì)引起葉綠體中DGDG合成量增加,并轉(zhuǎn)移至線粒體膜[11]、質(zhì)膜[12]和液泡膜[13]。在低磷脅迫下,type B型MGD2-3通過(guò)真核型途徑合成了更多的MGDG,而這些MGDG又被用于DGGD的合成,并運(yùn)往非質(zhì)體膜上,進(jìn)一步改變植物體的膜脂組分,以此適應(yīng)低磷環(huán)境[14]。以上研究結(jié)果表明,MGDG基因在低磷脅迫中起著重要的作用。

棉花是全球重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,而缺磷是作物生產(chǎn)力損失的主要原因之一。本研究基于前期棉花根部低磷脅迫基因表達(dá)譜分析結(jié)果,對(duì)候選陸地棉耐磷相關(guān)GhMGD基因家族進(jìn)行生物信息分析,同時(shí)利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)GhMGD基因在低磷脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析,以解析MGDG家族基因在棉花中的進(jìn)化及響應(yīng)低磷脅迫應(yīng)答的能力。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

選取自交留種中籽粒飽滿的‘新陸早19’種子,用70%酒精殺菌30 min,沖洗干凈后泡種24 h至棉花露白,分別播種于室內(nèi)培養(yǎng)箱沙土中和河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)田。在試驗(yàn)田棉花花鈴期取根、莖、葉、花等4個(gè)組織迅速放入液氮中備用。將棉花種子播種于含干凈濕潤(rùn)細(xì)沙的塑料盆內(nèi),28 ℃恒溫培養(yǎng)箱(光照14 h、黑暗10 h)培養(yǎng)至棉苗三葉期,選擇長(zhǎng)勢(shì)良好且一致的幼苗移至水培盆中,用1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)1周后分為2個(gè)處理水平,即適磷處理(SP,1.0 mmol/L)和低磷處理(LP,0.01 mmol/L),磷源采用KH2PO4,為保證K+濃度一致,以1.0 mmol/L為標(biāo)準(zhǔn),低磷營(yíng)養(yǎng)液中以KCl補(bǔ)齊K+,其他營(yíng)養(yǎng)成分含有2 mmol/L Ca(NO3)2·4H2O、2.5 mmol/L KNO3、0.5 mmol/L NH4NO3、1.4 mmol/L MgSO4·7H2O、1×10-3mmol/L ZnSO4·7H2O、1×10-3mmol/L MnSO4·H2O、0.1×10-3mmol/L CuSO4·5H2O、0.01 mmol/L H3BO3、0.05×10-4mmol/L (NH4)6Mo7O24·4H2O、0.1 mmol/L EDTA-FeNa[15]。分別處理0,4,12,24,72 h后,選取3株生長(zhǎng)一致的棉花植株,并混合取其根部組織,然后迅速置于液氮中,-80 ℃保存?zhèn)溆?。每日調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)液pH,使其保持在6.5左右,每3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液。

1.2 方 法

1.2.1 陸地棉MGDG基因家族成員鑒定及序列分析從棉花數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.cottongen.org)和生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/Blast)中檢索提取出所有基因的CDS序列文件。使用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)下載MGDG保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型文件(PF06925)。通過(guò)HMM model在基因組文件中搜尋候選基因家族成員蛋白序列。從Swiss-Prot數(shù)據(jù)資源庫(kù)中分別下載擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)MGDG的基因家族成員,雙向Blast比對(duì)獲取的陸地棉MGDG基因家族成員進(jìn)一步確認(rèn),查看基本特征。

將預(yù)測(cè)的蛋白序列在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)、CD-Search、InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行MGDG蛋白保守結(jié)構(gòu)域的檢查。使用ExPASy對(duì)基因序列進(jìn)行理化性質(zhì)的分析,等電點(diǎn)的確定對(duì)于純化方面有較大的幫助。通過(guò)CELLO v.2.5對(duì)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。利用TBtools從陸地棉的基因組注釋文件中提取MGDG家族基因的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析。

1.2.2 基因家族成員的進(jìn)化分析使用MEGA5.0對(duì)家族成員蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)后在Jalview進(jìn)行可視化。用MEGA5.0篩選出最優(yōu)的模型,采用ML(最大似然法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。使用MEME-Submission form基于Motif分析成員序列保守特性。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Batch CD-Search基于domain分析成員結(jié)構(gòu)域的保守性。

1.2.3 染色體定位利用TBtools從陸地棉的基因組注釋文件中提取MGDG家族基因的染色體位置信息并繪制染色體圖譜。

1.2.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析在SOPMA網(wǎng)站預(yù)測(cè)該基因家族成員的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.5 總RNA提取及cDNA合成按照天根RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取棉株總RNA,然后利用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度,并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其

完整性。若RNA的質(zhì)量符合要求,則根據(jù)HiScript?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)將所提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用Primer 5.0軟件,根據(jù)基因的CDS序列設(shè)計(jì)特異引物,GhActin作為內(nèi)參基因(表1),由生工生物工程股份有限公司

表1 陸地棉MGDG基因家族實(shí)時(shí)熒光定量引物

(上海)合成。反應(yīng)體系按照SYBR?Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit試劑盒說(shuō)明配制,使用熒光定量PCR儀型號(hào)為CFX96,采用2-ΔΔCT計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量,利用Origin 9.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉MGDG基因家族鑒定及其序列特征分析

通過(guò)hmmsearch搜素和數(shù)據(jù)驗(yàn)證,在陸地棉基因組中共鑒定出17個(gè)MGDG基因家族成員GhMGD1～GhMGD17(表2),17個(gè)MGDG基因家族成員編碼的氨基酸數(shù)量在435～888之間,其中GhMGD15所編碼的蛋白序列最短,GhMGD16所編碼的蛋白序列最長(zhǎng)。等電點(diǎn)分布在6.00～9.67之間,僅有GhMGD12與GhMGD15的等電點(diǎn)小于7,其中絕大多數(shù)均為堿性蛋白。相對(duì)分子質(zhì)量介于48 612.78～99 187.20 Da之間,變化相對(duì)較大。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明,陸地棉基因編碼蛋白位于線粒體、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和細(xì)胞膜等細(xì)胞結(jié)構(gòu)。MGDG基因序列基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果如圖1,各家族成員均含有多個(gè)內(nèi)含子與外顯子。該基因家族的各家族成員的外顯子數(shù)目分布在7～9之間,內(nèi)含子的數(shù)目分布在6～8之間,其中僅GhMGD9含有7個(gè)外顯子,其次有GhMGD14和GhMGD16含有9個(gè)外顯子,其余的14個(gè)MGDG成員均含有8個(gè)外顯子。

圖1 陸地棉MGDG基因家族結(jié)構(gòu)分析Fig. 1 Structure analysis of MGDG gene family in G.hirsutum L.

表2 陸地棉MGDG基因家族信息

2.2 陸地棉MGDG基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

由圖2可知,陸地棉MGDG基因家族的17個(gè)成員被劃分為兩大分支。

At.擬南芥;Gh.陸地棉。圖2 陸地棉MGDG基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)At. Arabidopsis thaliana; Gh. Gossypium hirsutum.Fig.2 Phylogenetic analysis of MGDG gene family in G. hirsutum L.

其中GhMGD2、GhMGD6、GhMGD12、GhMGD15 4個(gè)陸地棉MGDG蛋白成員與擬南芥AtMGD2、AtMGD3、AtMGD4、AtMGD5、AtMGD6同屬于B型MGDG合成酶。

另一個(gè)分支中GhMGD8、GhMGD9、GhMGD10、GhMGD3、GhMGD7、GhMGD1、GhMGD4、GhMGD5、GhMGD11、GhMGD13、GhMGD14、GhMGD16、GhMGD17和擬南芥AtMGD1、AtMGD7、AtMGD8親緣關(guān)系較近,屬于A型MGDG合成酶。

對(duì)陸地棉MGDG基因家族成員進(jìn)行蛋白的保守基序分析和蛋白保守結(jié)構(gòu)域的分析可知(圖3),大部分家族成員都具有相似的motif。

圖3 陸地棉MGDG基因家族的保守基序和保守結(jié)構(gòu)域的分析Fig.3 Conserved motif and domain analysis of MGDG gene family in G. hirsutum L.

在陸地棉MGDG基因家族中一共鑒定出了10個(gè)motif(motif代表一段特定的氨基酸序列,即表示氨基酸位置),各亞族之間的motif的數(shù)量和分布基本一致。

蛋白保守結(jié)構(gòu)域的分析表明17個(gè)家族成員均包含MGDG保守結(jié)構(gòu)域,除GhMGD14和GhMGD16含有2個(gè)其他類型的保守結(jié)構(gòu)域之外的15個(gè)成員都僅含有一個(gè)MGDG保守結(jié)構(gòu)域。

2.3 陸地棉MGDG基因家族染色體定位

對(duì)陸地棉MGDG基因家族成員進(jìn)行染色體定位(圖4),陸地棉MGDG基因家族17個(gè)成員分布于A05、A06、A07、A13、D05、D06、D07、D13共7條染色體上,其中A亞組共有12個(gè)GhMGD基因,D亞組共有5個(gè)基因。

圖4 陸地棉MGDG基因家族的染色體定位Fig.4 Chromosomal localization of MGDG gene family in G.hirsutum L.

染色體A05、A13、D05、D07和D13分別含有GhMGD6、GhMGD15、GhMGD2、GhMGD10、GhMGD12,而GhMGD8和GhMGD9主要分布于A07染色體上,GhMGD3和GhMGD7主要分布于D06染色體上,A06染色體上共有8個(gè)成員,這8個(gè)成員表現(xiàn)為成簇分布,較為集中。

2.4 陸地棉MGDG基因家族蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

陸地棉MGDG基因家族成員的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出基本相似的結(jié)果(表3),MGDG基因家族17個(gè)家族成員全部都表現(xiàn)出α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最大,其次是延伸鏈,β-轉(zhuǎn)角所占比例最少。

表3 陸地棉MGDG家族蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

每個(gè)亞族的表現(xiàn)也更為相似,如GhMGD2、GhMGD6、GhMGD12、GhMGD15同屬一個(gè)亞族,均表現(xiàn)出α-螺旋所占比例大于無(wú)規(guī)則卷曲。

2.5 陸地棉MGDG基因家族表達(dá)特性分析

以棉花的GhActin為內(nèi)參基因,利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)陸地棉MGDG基因家族中6個(gè)代表性的基因在根、莖、葉和花等4個(gè)組織中的表達(dá)情況。6個(gè)MGDG基因家族成員在不同組織中均有表達(dá),但相對(duì)表達(dá)量各不相同(圖5)。

其中GhMGD9和GhMGD10在葉片中的表達(dá)量最高,其次是根。

GhMGD2和GhMGD12在根中的表達(dá)量最高,而在葉中幾乎不表達(dá)。GhMGD7基因在根中的表達(dá)量略低于葉,在花中表達(dá)量最低。和GhMGD16在根和葉中的表達(dá)量最高,在莖和花中的表達(dá)量最低。

對(duì)陸地棉幼苗進(jìn)行低磷脅迫,以處理不同時(shí)間的陸地棉根部組織為材料進(jìn)行qRT-PCR分析MGDG基因表達(dá)情況。

如圖6所示,GhMGD2和GhMGD7基因在受到低磷脅迫的刺激下,能夠持續(xù)性響應(yīng)低磷脅迫,GhMGD2基因在低磷脅迫4～72 h其表達(dá)量均比適磷條件下高,且在72 h表達(dá)量約是對(duì)照組的72倍;GhMGD7基因在低磷脅迫4～72 h其表達(dá)量均比適磷條件下高,且在72 h表達(dá)量約是對(duì)照組的67.2倍。GhMGD9基因在低磷處理4～24 h時(shí)其趨勢(shì)為逐漸下降,但表達(dá)量均比正常情況下高,在72 h時(shí)其表達(dá)量又上升,僅比4 h時(shí)表達(dá)量略低;GhMGD10基因在低磷處理4～24 h時(shí)其趨勢(shì)為逐漸下降,但表達(dá)量均比正常情況下高,在72 h時(shí)其表達(dá)量又上升,達(dá)到最高表達(dá)量。從GhMGD9和GhMGD10基因的表達(dá)趨勢(shì)看,該基因在受到低磷脅迫的刺激后,立即會(huì)對(duì)低磷脅迫做出應(yīng)答,且具有持續(xù)性。GhMGD12基因在低磷脅迫0～4 h的表達(dá)量均比適磷條件下低,在12 h雖比適磷條件下略高,但在24 h時(shí)表達(dá)量下調(diào),低于適磷條件下的表達(dá)量,然而,在低磷脅迫72 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高值,是適磷條件下表達(dá)量的1.9倍,說(shuō)明該基因低磷脅迫下雖不穩(wěn)定表達(dá),但對(duì)低磷刺激有應(yīng)答反應(yīng)。GhMGD16基因在低磷處理4 h時(shí)達(dá)到最大值,在4～24 h這個(gè)時(shí)間段該基因呈現(xiàn)表達(dá)量逐漸下調(diào)的趨勢(shì),且低磷脅迫下的表達(dá)量在12,24 h時(shí)都比適磷條件下低,但在72 h該基因表達(dá)上調(diào),且在低磷脅迫下的表達(dá)量高于適磷處理的表達(dá)量,說(shuō)明該基因能夠響應(yīng)低磷脅迫。

*表示與對(duì)照相比存在顯著差異(P<0.05)。圖6 陸地棉MGDG基因在根部低磷脅迫不同時(shí)間的表達(dá)模式* are significant difference in different tissues and low phosphorus stress at 0.05 level.Fig.6 The relative expression analysis of MGDG gene in roots of G. hirsutum L. different time points with low phosphorus treatment

3 討 論

磷素是核酸的重要組成成分之一,在植物體內(nèi)的新陳代謝中起著關(guān)鍵性的作用,低磷脅迫不利于作物生長(zhǎng)發(fā)育[16]。大部分脂質(zhì)由MGDG和DGDG組成,它們占總脂質(zhì)的80%。單半乳糖基二?；视褪巧锘顒?dòng)以及光合活性所需的主要和必需的植物脂質(zhì),這需要富含半乳糖脂的環(huán)境。MGDG也是二半乳糖基二?；视?DGDG)的關(guān)鍵前體,它在磷酸鹽脅迫下轉(zhuǎn)移到質(zhì)體膜外。大部分MGDG是由位于質(zhì)體膜上的MGDG合酶合成的[17]。因此,MGDG的合成對(duì)植物至關(guān)重要。而在植物體內(nèi)合成的磷脂的含量會(huì)受到磷素利用率的影響發(fā)生改變,在低磷脅迫下,磷脂含量會(huì)產(chǎn)生明顯地下降,進(jìn)而影響細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[18]。

雖然MGDG是高等植物中最多的糖脂,但因?yàn)榧?xì)胞中MGD的含量卻非常低,因此想要分離并得到MGD的序列是較為困難的。目前對(duì)棉花中MGDG基因在全基因組水平的鑒定和分析仍未見(jiàn)報(bào)道。棉花屬于異源多倍體,基因組龐大而復(fù)雜,高質(zhì)量版本的基因組成為提升基因家族分析準(zhǔn)確性的必要條件。本研究利用最新的棉花基因組數(shù)據(jù)庫(kù),通過(guò)生物信息學(xué)的方法在陸地棉中鑒定了17個(gè)具有MGDG結(jié)構(gòu)域的GhMGD基因。與擬南芥[8]和水稻[19]等植物相比,陸地棉MGDG基因數(shù)目明顯較多,推測(cè)陸地棉單半乳糖甘油二酯家族成員分化可能早于擬南芥、水稻的物種分化。MGDG家族分成了兩種不同的MGD類型:Type A MGD家族(AtMGD1)和type B MGD家族(AtMGD2和AtMGD3)[8]。由圖2系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析可知陸地棉MGDG基因家族的17個(gè)成員同樣被劃分為兩大亞族,但每個(gè)亞族中的單半乳糖甘油二酯蛋白數(shù)量多于擬南芥,由此推測(cè)陸地棉中單半乳糖甘油二酯蛋白家族基因可能發(fā)生了物種特異性擴(kuò)增[20]。

蛋白質(zhì)處于特定的亞細(xì)胞位置上才能有效發(fā)揮其功能,因此了解亞細(xì)胞定位對(duì)研究蛋白質(zhì)功能具有一定的幫助,本研究亞細(xì)胞定位分布位置較多,包括線粒體、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和細(xì)胞膜等細(xì)胞結(jié)構(gòu),這可能與基因功能分化的多樣性有關(guān)。通過(guò)保守基序和功能結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn),陸地棉GhMGD基因結(jié)構(gòu)相似且都包含MGDG保守結(jié)構(gòu)域,亞族中的motif的數(shù)量和分布幾乎相同,亞族間有一定差異,這可能和功能的發(fā)揮有至關(guān)重要的聯(lián)系。染色體定位發(fā)現(xiàn)17個(gè)基因中,12個(gè)基因分布于A基因組,5個(gè)基因分布于D基因組,其中有8個(gè)基因成簇分布于A基因組的一條染色體上,基因數(shù)量的不同以及成簇的分布可能于植物在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生的基因復(fù)制、基因組重排、基因丟失等有關(guān)系,對(duì)此有待進(jìn)一步研究[21]。

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析陸地棉MGDG基因組織表達(dá)特異性和低磷脅迫下的抗性,各個(gè)MGDG基因在陸地棉根、莖、葉和花4個(gè)不同組織中表達(dá)量的差異,表明MGDG基因家族在棉花中可能功能分化有所不同。分析的6個(gè)GhMGD基因在根部具有不同程度的表達(dá),其中GhMGD2、GhMGD12和GhMGD16在根部的表達(dá)量均最高。根部低磷脅迫相對(duì)表達(dá)量分析表明,這6個(gè)GhMGD基因均能響應(yīng)低磷脅迫,其中GhMGD2基因在低磷脅迫72 h表達(dá)量約是適磷處理的72倍。在低磷環(huán)境脅迫下,植物會(huì)在分子機(jī)制、生理生化和形態(tài)結(jié)構(gòu)等多環(huán)節(jié)的調(diào)整來(lái)增加自身的適應(yīng)性,而根系作為植物吸收礦質(zhì)元素的主要器官對(duì)植物適應(yīng)磷饑餓具有重要作用[22-23]。GhMGD基因會(huì)持續(xù)性地對(duì)低磷脅迫作出應(yīng)答,表明其在棉花磷素信號(hào)調(diào)控中起到一定的作用。

綜上所述,本研究從陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中共獲得17個(gè)GhMGD基因,首先進(jìn)行生物學(xué)分析,然后利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)進(jìn)行分析,陸地棉MGDG家族GhMGD2、GhMGD7、GhMGD9、GhMGD10、GhMGD12和GhMGD16基因?qū)Φ土酌{迫均有不同程度的響應(yīng)。本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究陸地棉MGDG基因家族在低磷脅迫下的功能鑒定提供了一定理論依據(jù)。