不同種源防風種子的萌發(fā)特性與鑒別

張郡月, 韓 祥, 楊 帆, 王英平, 劉雙利

(吉林農(nóng)業(yè)大學/人參新品種選育與開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心, 長春 130118)

中藥防風來源于傘形科植物防風[Saposhnikoviadivaricata(Turcz.) Schischk]未抽花莖的干燥根,具有解表祛風,勝濕止痛,止痙等功效[1],臨床上主要用于治療風寒感冒、發(fā)熱頭痛、風濕、關節(jié)腫痛等癥。近年來對防風的研究主要集中于栽培技術,化學成分,藥理作用等方面,而關于防風種子鑒別方面的研究鮮有報道。目前市場上防風種子種源混雜、種質混亂,以栽培種子混淆野生種源的現(xiàn)象十分嚴重。顯微鑒別是中藥材鑒定的常用方法之一[2],植物種子的油管、維管束等微形態(tài)結構研究,為植物種子分子系統(tǒng)學研究提供了重要的形態(tài)學支撐[3-6]。

種子萌發(fā)是植物生命的開端,是植物種群延續(xù)的重要環(huán)節(jié),也是植物發(fā)育的重要階段[7]。目前關于防風種子萌發(fā)的研究主要集中于如何利用外源因素打破其休眠[8]以及萌發(fā)期間生理生化的變化[9]方面,而對于防風種子萌發(fā)過程中內(nèi)部形態(tài)結構變化的研究未見報道。因此,為了分析野生及栽培防風種子萌發(fā)過程中種胚的不同變化特征,摸索不同種源防風種胚發(fā)育過程的變化,確定其發(fā)育過程中胚形態(tài)的特征,本實驗采用徒手解剖觀察法,對不同種源萌發(fā)過程中的防風種子進行解剖,并在體式顯微鏡下透光觀測,觀察其種胚的變化。將已發(fā)芽的不同種源的防風種子在體式顯微鏡下進行跟蹤觀測,觀察其胚軸的變化。探明萌發(fā)過程中種子形態(tài)結構的變化,旨在為防風種子萌發(fā)特性研究提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材 料

1.1 材料與試劑

藥材樣品為國內(nèi)防風主產(chǎn)區(qū)實地基地采集(購),具體來源見表1,采集時間為2020年9月—2021年9月,經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學劉雙利副教授鑒定為傘形科植物防風的種子。番紅O-固綠染色液(上海索萊寶,G375),FAA固定液(北京酷萊博,sl16222),無水乙醇(天津鑫鉑特,20201018),二甲苯(天津鑫鉑特,20200616),中性樹膠(上海索萊寶,G8590)。

表1 防風種子采集信息Table 1 Collection information of Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk seeds

1.2 儀 器

體式顯微鏡(德國徠卡,Leica S9D),游標卡尺(哈爾濱量具集團責任有限公司,CD-10AX),電子分析天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司,BSA-224S-CW),恒溫水浴槽(杭州米歐儀器有限公司,WT100-3),研究級正置熒光顯微鏡(德國徠卡,LEICA DM6B),電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司,DHG-9145A)、全密閉自動脫水機(德國徠卡,LEICA ASP300S),組織包埋機(德國徠卡,LEICA HistoCore Arcadia H),全自動輪轉式半薄切片機(德國徠卡,LEICA RM2265),全自動染封工作站(德國徠卡,LEICA CV5030)。

2 方 法

2.1 石蠟切片的制作

2.1.1取材固定

選擇健康飽滿的防風種子,浸泡過夜,種子兩端削去一截后浸于FAA固定液中,滴加10%的甘油,固定時間24 h以上。

2.1.2脫水透明

分別配制35%,50%,70%,85%,95%的乙醇,將防風種子依次在不同濃度乙醇的脫水缸中浸泡2 h,再浸入無水乙醇中2次,每次1 h。配制二甲苯和酒精體積比為1∶3的溶液,將脫水后的樣品在該溶液中浸泡1 h,再在二甲苯和酒精體積比為1∶1的溶液中浸泡1 h,最后放入純二甲苯溶液中2次,每次1 h,直至透明。

2.1.3浸蠟包埋

將透明后的樣品放入二甲苯和石蠟體積比為1∶1的溶液中,放入40 ℃烘箱烘12 h,在純石蠟中浸泡后再放入40 ℃烘箱中烘12 h,重復2次(因種子較硬,可適當延長浸蠟時間)。將包埋機溫度調至65 ℃左右,包埋盒底膜放置工作臺上,注入一層薄蠟,種子樣品直立放入薄蠟中央,再將包埋盒底膜放置冷臺上,當蠟成半凝固狀態(tài)時,在頂部蓋上白色包埋盒,再注入蠟液至其漫過白色包埋盒底部,然后轉移至冷凝臺,充分冷凝后取下蠟塊,備用。

2.1.4切片展片

先將適當蒸餾水加入展片機,加熱至38 ℃并保持恒溫狀態(tài)。將蠟塊整修后固定在樣本夾上進行修片,統(tǒng)一從種子的二分之一處橫切面切片,并不斷調節(jié)搖動轉柄的速度,當出現(xiàn)完整質量較好的切片時,將其放入展片機中。當蠟片完全攤平,用載玻片將蠟片撈出,擦干表面水分,置于38 ℃的烘片機上,烤片12 h以上。

2.1.5脫蠟染色

將烘好的片子放入純二甲苯溶液中10 min,重復2次,然后配制體積比為1∶1的二甲苯和無水乙醇溶液,將片子放入該溶液中5 min,再將其取出依次放入100%,95%,85%,70%,50%的乙醇溶液中,每次5 min。將樣品放入番紅溶液1～2 h后取出,再依次放入70%,85%無水乙醇中,放置5 min。然后將樣品放入固綠溶液中,放置30 s,再將固綠溶液洗凈。接著將樣品依次放入95%,100%,100%,100%乙醇溶液中,每次5 min,再配制體積比為1∶1的二甲苯和無水乙醇溶液,放入該溶液中靜置5 min,再置于二甲苯溶液中5 min,重復2次。最后將在二甲苯溶液中透明完成的載玻片取出,在樣品中央滴入中性樹膠,蓋上蓋玻片,待樹膠凝固后,寫好標簽,完成封片。

2.2 防風種子萌發(fā)過程中油管變化的解剖觀測方法

發(fā)芽試驗用四分法,在每組供檢樣品中抽取50粒大小一致的種子,3次重復。將種子在3%的次氯酸鈉溶液中浸泡20 min進行消毒,然后用蒸餾水沖洗掉殘留的溶液。將蒸餾水、培養(yǎng)皿、濾紙及鑷子等滅菌后使用,再將消毒后的種子在蒸餾水中浸泡24 h。將浸濕后的脫脂棉和濾紙(2 mm)置于培養(yǎng)皿上,并將浸泡后的種子整齊地排列于濾紙上,每個培養(yǎng)皿中放置50粒種子,重復3次。將培養(yǎng)皿編號后,放入25 ℃、12 h光照的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。發(fā)芽過程中每隔1 d取一次樣,最后將種子放入固定液中進行石蠟切片相關實驗,石蠟切片方法同2.1。

2.3 防風種子萌發(fā)過程中種胚變化的解剖觀測方法

防風種子萌發(fā)過程中種胚的觀測方法是將野生、栽培防風種子進行發(fā)芽試驗,發(fā)芽過程中每天取樣,直至種子發(fā)芽。由于防風種子較小,胚與胚乳不易分離,剝離后種胚極易破碎,因此不將種胚進行剝離,而是用手術刀片對種子進行縱切,在體式顯微鏡下進行透光觀察,并拍照記錄。用游標卡尺測量種胚及胚乳的縱長并計算胚率。

胚率/%=(種胚縱長/胚乳縱長)×100%。

2.4 防風種子萌發(fā)過程中胚軸變化的觀測

將發(fā)芽后的種子繼續(xù)培養(yǎng),在體式顯微鏡下拍照并記錄,每天取樣,用數(shù)字游標卡尺測量同一種子胚軸的長度,直至其子葉突破種皮為止。

2.5 數(shù)據(jù)處理

石蠟切片的圖像用LAS X和Photoscape軟件進行處理;油管的面積、周長及飽滿度用ImageJ軟件測量;所有數(shù)據(jù)用SPSS26軟件進行顯著性差異分析。

3 結果與分析

3.1 顯微性狀鑒別結果

防風種子橫切面由外果皮、中果皮、內(nèi)果皮、胚、油管、初生維管束以及種脊維管束構成(圖1)。外果皮為不規(guī)則的橢圓形,且外壁有不規(guī)則凸起。中果皮為較為平坦的橢圓形,其外部有5個果棱,棱內(nèi)有初生維管束,初生維管束旁具有熒光物質的圓狀粗管,每2個間隔棱槽內(nèi)有1個油管稱為背生面油管,接合面兩側有2個合生面油管,多數(shù)防風種子有6個油管。內(nèi)果皮與中果皮形狀相似,內(nèi)果皮與中果皮之間有一稍延長的細胞。內(nèi)果皮內(nèi)為種胚,含有豐富的胚乳細胞。種脊維管束位于接合面中央與內(nèi)果皮相間處,多數(shù)種脊維管束向外凸起。

注:1為外果皮;2為中果皮;3為內(nèi)果皮;4為胚;5為油管;6為初生維管束;7為種脊維管束;①為油管1;②為油管2;③為油管3;④為油管4;⑤為油管5;⑥為油管6。圖1 防風種子顯微性狀特征與橫切面油管分布Fig.1 Microscopic character characteristics of Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk seeds and distribution of tubing in cross section

通過對防風種子的橫切面進行觀察,可知栽培防風種子橫切面呈橢圓形,多數(shù)種子果棱突起不明顯,棱頂部圓滑,初生維管束較大,伴生粗管較小,種脊維管束向外凸起不明顯,合生面有2個油管,背生面有4個油管。野生防風種子橫切面呈近五邊形,果棱突起明顯,棱頂部鈍圓,初生維管束較小,伴生粗管較大,種脊維管束向外凸起明顯,合生面有2個油管,背生面有4個油管。

3.2 防風種子萌發(fā)過程中油管變化的解剖觀測

防風種子萌發(fā)過程中油管的變化情況見圖2。防風種子從培養(yǎng)到萌芽歷經(jīng)7 d,從第1天到第7天,油管內(nèi)的油滴及紅色熒光物質由多變少,油管逐漸變得易破碎,油管管腔變得越來越空洞,油管的面積逐漸變小。

注:a、b、c、d分別為萌發(fā)過程的第1,3,5,7天;1,2,3,4,5,6分別代表油管1～6。圖2 防風種子萌發(fā)過程中油管面積的變化Fig.2 Changes in tubing area during Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk seed germination

根據(jù)防風種子萌發(fā)過程中油管的面積數(shù)據(jù),對油管1、油管2及油管3的數(shù)據(jù)進行分析(表2),培養(yǎng)1 d種子油管的面積均極顯著大于3 d;培養(yǎng)3 d種子的油管面積均極顯著大于5 d;培養(yǎng)5 d種子的油管面積均極顯著大于7 d。從油管4的數(shù)據(jù)來看,培養(yǎng)1 d種子的油管面積極顯著大于其他天數(shù)種子的油管面積;培養(yǎng)7 d的種子也就是發(fā)芽當天種子的油管面積極顯著小于其他天數(shù)種子的油管面積。對油管5的數(shù)據(jù)進行分析可知,種子培養(yǎng)1 d、3 d的油管面積極顯著大于其他天數(shù)種子的油管面積;培養(yǎng)7 d種子的油管面積極顯著小于其他天數(shù)種子的油管面積。分析油管6的數(shù)據(jù)可知,培養(yǎng)3 d種子的油管面積極顯著大于其他天數(shù)的種子油管面積;培養(yǎng)7 d種子的油管面積極顯著小于其他萌發(fā)天數(shù)種子的油管面積。將6個油管面積的平均數(shù)進行比較,可知種子培養(yǎng)1 d的油管面積極顯著大于3 d;培養(yǎng)3 d種子的油管面積極顯著大于5 d;培養(yǎng)5 d種子的油管面積極顯著大于7 d?？傮w分析表明,種子萌發(fā)過程中油管的面積不斷變小。

表2 防風種子萌發(fā)過程中油管的面積變化Table 2 Area changes of tubing during seed germination of Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk

防風種子萌發(fā)過程中油管的周長數(shù)據(jù)見表3,對油管1的數(shù)據(jù)進行分析可知,種子培養(yǎng)1 d、3 d油管的周長極顯著大于其他培養(yǎng)天數(shù)的油管周長;培養(yǎng)7 d種子油管周長極顯著小于其他培養(yǎng)天數(shù)的油管周長。從油管2的數(shù)據(jù)來看,培養(yǎng)1 d種子的油管周長極顯著大于其他天數(shù)的油管周長;培養(yǎng)7 d種子的油管周長極顯著小于其他培養(yǎng)天數(shù)種子的油管周長。分析油管3的數(shù)據(jù)可知,培養(yǎng)7 d種子的周長極顯著小于其他培養(yǎng)天數(shù)種子的油管周長。從油管4的數(shù)據(jù)來看,培養(yǎng)1 d時種子的油管周長極顯著大于其他培養(yǎng)天數(shù)種子的油管周長;培養(yǎng)7 d種子的油管周長極顯著小于其他培養(yǎng)天數(shù)種子的油管周長。分析油管5的數(shù)據(jù)可知,培養(yǎng)1 d、3 d種子的油管周長極顯著大于5 d、7 d種子的油管周長。對油管6的數(shù)據(jù)進行分析可知,培養(yǎng)1 d種子的油管周長極顯著大于其他培養(yǎng)天數(shù)種子的油管周長;培養(yǎng)7 d種子的油管周長極顯著小于除5 d外的其他天數(shù)種子油管周長。將6個油管周長的平均數(shù)進行比較,可知培養(yǎng)1 d種子的油管周長顯著大于其他培養(yǎng)天數(shù)的油管周長,極顯著大于除3 d外的其他培養(yǎng)天數(shù)的種子周長;培養(yǎng)7 d種子的油管周長極顯著小于其他培養(yǎng)天數(shù)種子的油管周長。以上分析表明,種子萌發(fā)過程中油管的周長不斷變小。

表3 防風種子萌發(fā)過程中油管的周長變化Table 3 Changes in tubing perimeter during seed germination of Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk

防風種子萌發(fā)過程中油管的飽滿度數(shù)據(jù)見表4,從油管1的數(shù)據(jù)可知,種子培養(yǎng)1 d和3 d的飽滿度極顯著大于5 d和7 d種子的飽滿度。對油管2的數(shù)據(jù)進行分析可知,種子培養(yǎng)5 d油管的飽滿度顯著小于其他培養(yǎng)天數(shù)種子的飽滿度。從油管3數(shù)據(jù)來看,培養(yǎng)7 d種子的油管飽滿度極顯著大于其他培養(yǎng)天數(shù)種子的油管飽滿度,培養(yǎng)5 d種子的飽滿度極顯著小于其他培養(yǎng)天數(shù)種子的飽滿度。從油管4的數(shù)據(jù)可知,培養(yǎng)7 d種子的飽滿度顯著大于培養(yǎng)3 d種子的油管飽滿度。從油管5數(shù)據(jù)來看,培養(yǎng)7 d種子的油管飽滿度顯著大于其他培養(yǎng)天數(shù)種子的飽滿度。對油管6的數(shù)據(jù)進行分析可知,培養(yǎng)7 d種子的油管飽滿度極顯著小于其他培養(yǎng)天數(shù)。將6個油管飽滿度的平均數(shù)進行比較,可知培養(yǎng)7 d種子的油管飽滿度極顯著大于其他培養(yǎng)天數(shù)種子的飽滿度,培養(yǎng)1 d、3 d、5 d種子油管的飽滿度之間無明顯差異,油管飽滿度1 d>3 d>5 d。以上分析表明,除培養(yǎng)7 d油管的飽滿度最大外,種子萌發(fā)前期油管的飽滿度逐漸變小。

表4 防風種子萌發(fā)過程中油管的飽滿度變化Table 4 Changes in tubing fullness during seed germination of Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk

3.3 防風種子萌發(fā)過程中種胚變化的解剖觀測

觀察栽培防風種子萌發(fā)過程中胚形態(tài)的變化(圖3),發(fā)現(xiàn)種子在萌發(fā)過程中1 d處于球形胚階段,2 d、3 d、4 d種胚逐步分化至心形胚階段,隨著子葉原基進一步分化伸展,5 d、6 d種胚過渡到魚雷形胚階段,7～11 d胚柄開始逐漸退化縮短形成子葉胚,12 d種子開始發(fā)芽。

圖3 栽培防風種子萌發(fā)過程中胚形態(tài)的變化Fig.3 Changes in embryo morphology during seed germination of cultivated Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk seeds

觀察野生防風種子萌發(fā)過程中胚形態(tài)的變化(圖4),用數(shù)字游標卡尺測量同一種子胚軸的長度,看到野生防風種子萌發(fā)過程中1 d處于球形胚階段,2 d、3 d、4 d子葉原基伸長處于心形胚階段,隨著子葉原基進一步伸長,5 d、6 d、7 d種胚過渡至魚雷形胚階段,子葉原基的伸長伴隨著胚柄的退化,8～12 d處于子葉胚階段,14 d種子開始發(fā)芽。

圖4 野生防風種子萌發(fā)過程中胚形態(tài)的變化Fig.4 Changes in embryo morphology during seed germination of wild Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk

球形胚時期胚乳幾乎占滿整個種子,種胚很小(表5),栽培防風該時期種胚的長度為0.461 mm,胚率為9.85%;野生防風該時期種胚的長度為0.353 mm,胚率為10.75%;隨著胚的分化逐漸可以看到子葉原基形狀呈心形,處于心形胚階段,該階段栽培防風種子胚的平均長度為0.790 mm,平均胚率為19.10%;野生防風該時期種胚的平均長度為0.670 mm,平均胚率為15.22%;隨著子葉逐漸伸長,種胚發(fā)育到魚雷形胚時期,該時期栽培防風種胚的平均長度為1.027 mm,種胚占胚乳的25.35%;野生防風該時期種胚的平均長度為0.966 mm,平均胚率為24.34%;隨著子葉的進一步伸長以及胚乳的分解,種胚發(fā)育逐漸成熟,胚根開始萌動,種胚的發(fā)育進入子葉胚階段,該階段栽培防風種子的種胚平均長度達1.495 mm,平均胚率為38.42%;野生防風該階段種胚的平均長度為1.301 mm,平均胚率為33.89%;栽培防風種子從培養(yǎng)到萌芽歷經(jīng)12 d,發(fā)芽日種胚長度達3.126 mm,胚率達74.34%;野生防風種子從培養(yǎng)到萌芽歷經(jīng)14 d,發(fā)芽日種胚長度達2.486 mm,胚率達62.07%。以上分析表明,栽培防風種子發(fā)芽速度大于野生防風種子,且栽培防風種子各時期的胚率大于野生防風種子。

表5 野生及栽培防風種子萌發(fā)過程中種胚平均胚長及胚率Table 5 The average length and percentage of seed embryos during germination of wild and cultivated Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk seeds

3.4 防風種子萌發(fā)過程中胚軸變化的觀測

從圖5可以看出,栽培防風種子發(fā)芽后1 d胚軸長度為1.048 mm,2 d胚軸長度為2.244 mm,3 d為4.321 mm,4 d為10.072 mm,5 d為15.879 mm。種子發(fā)芽后歷經(jīng)5 d子葉突破種皮。從圖6可以看出,野生防風種子發(fā)芽后1 d胚軸長度為0.780 mm,2 d胚軸長度為1.921 mm,3 d為2.169 mm,4 d為6.717 mm,5 d、6 d、7 d胚軸長度分別為10.521 mm、14.119 mm和14.494 mm,種子發(fā)芽后歷經(jīng)7 d子葉突破種皮。

圖5 栽培防風種子萌發(fā)過程中胚軸的變化Fig.5 Changes in hypocotyls during seed germination of cultivated Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk

圖6 野生防風種子萌發(fā)過程中胚軸的變化Fig.6 Changes in the hypocotyl during seed germination of wild Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk

經(jīng)分析對比可知,栽培防風種子發(fā)芽后子葉突破種皮用時較短,胚軸長度最長。野生防風種子發(fā)芽后突破種皮用時次之,胚軸長度次之。

4 討 論

顯微鑒別是中藥材鑒定常用的方法[10],通過顯微鑒別對防風種子進行形態(tài)學分析,可為中藥材的鑒定提供科學依據(jù)[11]。相比于現(xiàn)代化學和分子鑒定等方法,顯微性狀鑒別操作簡便且成本較低,實際應用價值相對較高[12]。市場上防風種子種源混淆現(xiàn)象嚴重,其果實特征是傘形科植物分類的重要依據(jù),且油管特征是顯微鑒定傘形科植物的重要依據(jù)[13-14]。本研究對防風種子萌發(fā)過程進行動態(tài)解剖觀測,研究表明,防風種子從培養(yǎng)到萌芽共歷經(jīng)7 d,從第1天到第7天,油管內(nèi)的油滴及紅色熒光物質由多變少,油管逐漸變得易破碎,油管管腔變得越來越空洞,油管的面積逐漸變小,周長也在不斷變小,除培養(yǎng)7 d的油管飽滿度最大外,種子萌發(fā)前期油管的飽滿度也在逐漸變小。傘形科植物芫荽[15]種子在成熟過程中合生面油管也被逐漸壓扁,果壁油管消失轉變成大空腔。七葉一枝花種子[16]在萌發(fā)過程中其種子內(nèi)的有效成分含量逐漸減少,防風種子內(nèi)含有揮發(fā)油[17],由于油管內(nèi)充斥著豐富的油類物質,因此種子萌發(fā)過程中油管面積及周長逐漸變小,推斷可能是種子在萌發(fā)過程中揮發(fā)油的含量減少造成的[18]。但還需展開相關實驗進行驗證。

種子的萌發(fā)是植物生命周期中具有重要農(nóng)藝和生態(tài)意義的關鍵組成部分[19]。本實驗首次對防風種子萌發(fā)過程中種胚的變化進行相關分析,發(fā)現(xiàn)防風種子在萌發(fā)過程中依次經(jīng)歷了球形胚階段、心形胚階段、子葉胚階段。有研究發(fā)現(xiàn),黃連、老山芹等[20-22]種子的種胚也經(jīng)歷了同樣的階段。通過觀察野生及栽培防風種子萌發(fā)過程中種胚的變化,發(fā)現(xiàn)其中栽培防風種子發(fā)芽速度及各時期胚率均大于野生防風種子。觀測野生及栽培防風種子發(fā)芽后胚軸的變化,發(fā)現(xiàn)栽培防風種子發(fā)芽后子葉突破種皮用時較短,胚軸長度最長,均大于野生防風種子。市場上的防風種子種源混雜、種質混亂,以栽培種子冒充野生種源的現(xiàn)象時有發(fā)生,因此本實驗為探明種子萌發(fā)過程中內(nèi)部結構變化的機制提供基礎數(shù)據(jù),并為野生及栽培防風的鑒別以及不同產(chǎn)地防風的鑒別提供技術參考,為篩選優(yōu)良的防風種源及提升道地藥材防風的質量提供保障。