不同月齡魯西黑頭羊瘤胃細(xì)菌多樣性比較分析

譚秀文 孟憲鋒 劉昭華 劉興華 朱榮生 王可 崔緒奎 王建英 靳青

摘要：瘤胃是反芻動物重要的消化器官，瘤胃微生物的組成及其多樣性直接關(guān)系到反芻動物對飼料的消化利用。本研究通過測定不同月齡魯西黑頭羊瘤胃液微生物菌群多樣性及組成結(jié)構(gòu)，探索瘤胃微生物發(fā)育規(guī)律，為魯西黑頭羊高技飼養(yǎng)提供理論依據(jù)。結(jié)果表明：（1）Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)各組之間無顯著性差異．ACE指數(shù)和Cha01指數(shù)3月齡顯著低于6月齡和12月齡；（2）擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（FirmicuLes）為優(yōu)勢菌門，普雷沃菌屬（PrevoreDa）為瘤胃優(yōu)勢菌屬，但各類群豐度在不同月齡間存在顯著差異；（3）PCA分析顯示，3月齡魯西黑頭羊瘤胃菌群個(gè)體間差異較小．6月齡與12月齡明顯分離，表明菌群結(jié)構(gòu)差異較大。綜上，魯西黑頭羊瘤胃菌群在3月齡時(shí)相對穩(wěn)定，隨著月齡的增長，群落豐富度有所提高，表明3月齡時(shí)瘤胃功能仍在發(fā)育。

關(guān)鍵詞：魯西黑頭羊；瘤胃；細(xì)菌；多樣性

中圖分類號：S826.9+21 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2023）02-0155-04

瘤胃是反芻動物特有的消化器官，也是反芻動物消化和代謝的重要場所。瘤胃能夠消化飼料中70%-85％的可消化物和50%的粗纖維，在此過程中，瘤胃微生物發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。瘤胃微生物可將飼糧中的養(yǎng)分經(jīng)發(fā)酵轉(zhuǎn)化為可供反芻動物吸收利用的營養(yǎng)物質(zhì)，為維持動物正常生理活動以及生產(chǎn)肉類和奶制品提供所需能量和營養(yǎng)，因此瘤胃微生物充當(dāng)了主要的營養(yǎng)物質(zhì)“轉(zhuǎn)換器”。

反芻動物的瘤胃在斷奶前類似于非反芻哺乳動物的單胃，斷奶后逐漸發(fā)育具備反芻功能，成年后瘤胃占整個(gè)消化系統(tǒng)的60％-80％。幼齡反芻動物瘤胃微生物區(qū)系豐富度相對較低，隨著時(shí)間的延長在數(shù)量和種類上發(fā)生明顯變化，發(fā)育成熟后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，功能也逐漸完善，在反芻動物消化代謝和健康維持過程中發(fā)揮重要作用。

瘤胃及瘤胃微生物的發(fā)育受反芻動物品種、年齡、營養(yǎng)水平等多種因素的影響，充分了解瘤胃微生物區(qū)系的發(fā)育特點(diǎn)，是挖掘生產(chǎn)潛力的重要依據(jù)。魯西黑頭羊是以山東省地方品種小尾寒羊?yàn)槟副?、以南非黑頭杜泊綿羊作父本雜交選育而成的優(yōu)質(zhì)肉羊新品種，關(guān)于其瘤胃微生物的結(jié)構(gòu)及發(fā)育規(guī)律目前尚未展開研究。為此，本試驗(yàn)對不同生長階段魯西黑頭羊公羊瘤胃微生物區(qū)系進(jìn)行比較分析，以期為提高魯西黑頭羊生產(chǎn)性能提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣品采集

以山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所培育的肉羊新品種魯西黑頭羊?yàn)檠芯繉ο螅隰斘骱陬^羊核心育種場隨機(jī)選取3月齡、6月齡、12月齡3個(gè)年齡段的魯西黑頭羊各4只。晨飼6h后通過胃管式瘤胃液采樣器（武漢科立博牧業(yè)科技有限公司）采集瘤胃液，分裝于15 mL離心管，液氮速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存待測。

1.2瘤胃液細(xì)菌測定

瘤胃細(xì)菌16S rDNA測序委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。首先，采用SDS方法對樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和濃度，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/uL。然后，以稀釋的基因組DNA為模板，以細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)引物（515F和806R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用2％瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，合格后進(jìn)行等量混樣并回收；最后，使用TruSeq@ DNA PCR-Free SamplePreparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，利用Illumina Miseq 2500高通量測序平臺進(jìn)行測序。

1.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

測序完成后，使用FLASH（V 1.2.7）對樣本的Reads進(jìn)行拼接，使用fastp軟件對拼接得到的Raw Tags進(jìn)行過濾得到高質(zhì)量的Clean Tags，Uchime algorithm去除其中的嵌合體序列后得到最終的有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）。利用Uparse算法（Uparsev 7.0.1001）對全部Effective Tags進(jìn)行聚類，以97％的一致性（idemity）將序列聚類成為OTUs。用Mothur方法與SILVA138的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋與分析，使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計(jì)算Chao 1、Shannon、Simpson、ACE、Goods-coverage指數(shù)，使用R軟件（Version2.15.3）繪制PCA圖。

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行整理，使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，并采用Duncan's法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1不同月齡魯西黑頭羊瘤胃細(xì)菌OTUs分析

為研究不同月齡魯西黑頭羊瘤胃細(xì)菌的物種組成，對所有樣本的Effective Tags以97%的一致性進(jìn)行OTUs聚類，共產(chǎn)生5 708個(gè)OTUs（圖1），3月齡、6月齡、12月齡分別有3 559、3 824、3833個(gè)，三組共同擁有的OTUs為2 216個(gè)。這表明不同月齡魯西黑頭羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)具有一定的特異性與相似性。平均序列長度為414 bp，所有樣品測序覆蓋率均在99.6％以上，表明測序深度能夠準(zhǔn)確反映瘤胃細(xì)菌的組成。

2.2不同月齡魯西黑頭羊瘤胃細(xì)菌alpha多樣性

對不同月齡魯西黑頭羊瘤胃細(xì)菌多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果（表1）顯示，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在各月齡間無顯著差異，表明各月齡間瘤胃細(xì)菌群落多樣性相似：Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)在3月齡顯著低于6月齡和12月齡，6月齡和12月齡間無顯著差異，表明6月齡和12月齡的魯西黑頭羊細(xì)菌群落豐富度較3月齡時(shí)顯著升高。

2.3不同月齡魯西黑頭羊瘤胃細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)

對所得有效序列在不同分類水平上進(jìn)行物種注釋和統(tǒng)計(jì)，魯西黑頭羊瘤胃液中共注釋到細(xì)菌界和古生菌界微生物46門99綱272科342屬。對總豐度前10的物種在門水平和屬水平上進(jìn)行分析，結(jié)果（圖2）顯示，在門水平上，擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）為魯西黑頭羊瘤胃中的優(yōu)勢菌門，平均相對豐度分別為54.09％和21.17％：其次為廣古菌門（Euryarchaeota）和變形菌門（Proteobacteria），平均相對豐度分別為4.98%和3.64％，其他菌門相對豐度均低于3%。擬桿菌門的相對豐度隨月齡的增長而升高，12月齡極顯著高于3月齡和6月齡（P<0.01）：3月齡厚壁菌門相對豐度顯著高于6月齡和12月齡（P<0.05）。

在屬水平上，普雷沃菌屬（Ptevotella）為瘤胃優(yōu)勢菌屬，相對豐度為19.75%-25.80%，且12月齡顯著高于3月齡（P<0.05）；其次為Rikenellace-ae_RC9_gut_group和Methanobrevibacter，平均相對豐度分別為9.83%和4.98%，各月齡間無顯著差異；瘤胃球菌屬（Runminococcus）在3月齡時(shí)平均相對豐度為3.2%，到12月齡時(shí)顯著降至0.89％（P<0.05）。

2 4不同月齡魯西黑頭羊瘤胃細(xì)菌主成分分析

如圖3所示，第一主成分和第二主成分的貢獻(xiàn)率分別為17.65%和13.31％。3月齡各樣本聚集在一起，表明個(gè)體間差異較?。?月齡組與12月齡組較為分散，表明個(gè)體間有一定的差異。與3月齡組相比，6月齡組群落結(jié)構(gòu)差異不明顯，但表現(xiàn)出分離的趨勢，12月齡組與3月齡組能很好地分離，表明3月齡組和12月齡組間群落結(jié)構(gòu)差異顯著。

3討論與結(jié)論

瘤胃是反芻動物區(qū)別于其他哺乳動物的消化器官，剛出生時(shí)瘤胃微生物的組成相對單一，隨著對母乳及飼糧的采食，瘤胃不斷發(fā)育，瘤胃微生物逐漸定殖并繁殖，最終形成穩(wěn)定微生物區(qū)系，以維持反芻動物正常的生長發(fā)育需求。幼齡階段的瘤胃微生物區(qū)系組成與成熟動物差異明顯，一般情況下，將4周歲以后反芻動物的瘤胃微生物區(qū)系定義為成熟的瘤胃微生物區(qū)系。另有研究認(rèn)為，在2周歲以前反芻動物瘤胃微生物都有可能發(fā)生較大變化。本研究中，魯西黑頭羊在3月齡時(shí)的瘤胃微生物豐富度顯著低于6月齡和12月齡，且個(gè)體間差異較小。這說明此時(shí)瘤胃菌群相對比較均一，仍處于快速發(fā)展時(shí)期，若此時(shí)通過優(yōu)化飼糧組成以及合理使用添加劑等調(diào)控手段對瘤胃微生物進(jìn)行干預(yù)以加強(qiáng)瘤胃的消化代謝功能，仍可取得一定的效果。隨著月齡的增加和瘤胃的發(fā)育，6月齡之后至成年，瘤胃菌群逐漸趨于成熟達(dá)到各自的“穩(wěn)態(tài)”，再對其進(jìn)行調(diào)整，難度增大。

馬健等統(tǒng)計(jì)表明，反芻動物瘤胃微生物區(qū)系在門水平上以變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）細(xì)菌為優(yōu)勢菌，在屬水平上以普雷沃菌屬（Prevotella）細(xì)菌為優(yōu)勢菌，但其在不同年齡段所占比例不同，其中變形菌門的豐度隨動物年齡的增長顯著降低。本研究中，擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）在魯西黑頭羊瘤胃菌群中占絕對優(yōu)勢，且擬桿菌門（Bacteroidetes）豐度隨月齡顯著增長，變形菌門（Proteobacteria）豐度隨月齡的增長顯著降低，與以上研究結(jié)果一致，說明試驗(yàn)羊瘤胃發(fā)育正常，微生物區(qū)系處于動態(tài)平衡，體況較佳；在屬水平上，普雷沃菌屬（Prevotella）相對豐度在20%左右，且12月齡時(shí)較3月齡顯著提高，說明瘤胃降解蛋白、淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)的消化代謝能力有所增強(qiáng)。

綜上，魯西黑頭羊在3月齡之前，瘤胃仍處于快速發(fā)育階段，微生物區(qū)系具有較高的可塑性。在飼養(yǎng)管理過程中，可在3月齡前對其進(jìn)行有效調(diào)控，為后期生產(chǎn)性能的提高奠定基礎(chǔ)。