基于隸屬函數(shù)法對甘藍型油菜種質(zhì)苗期耐低氮脅迫能力的綜合評價

陳敬東　余憶　魯金春子　戴希剛　沈金雄　傅廷棟　伍曉明　曾長立　萬何平

摘要：油菜作為我國重要的油料作物，其生長發(fā)育過程中對氮素營養(yǎng)需求量較大，但氮肥利用率卻較低，在很大程度上制約了油菜的正常生長。探究苗期甘藍型油菜耐低氮脅迫能力的評價方法，篩選耐低氮脅迫能力強的種質(zhì)，可以減少氮肥施用量，保護生態(tài)環(huán)境。以49份甘藍型油菜種質(zhì)材料通過水培試驗，考察低氮水平（0.3 mmol/L）和正常氮水平（6.0 mmol/L）的地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、地下部干質(zhì)量、葉片數(shù)、株高、總根長、根平均直徑、側(cè)根數(shù)等性狀，以各性狀的耐低氮系數(shù)為衡量油菜耐低氮脅迫能力的指標，利用隸屬函數(shù)法對不同基因型油菜進行耐低氮脅迫能力的綜合評價，篩選出低氮脅迫耐受型材料8個，低氮脅迫敏感型材料14個，低氮脅迫中間型材料27個。D值與地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、地下部干質(zhì)量、葉片數(shù)、株高、總根長和側(cè)根數(shù)呈顯著正相關，可作為油菜苗期耐低氮脅迫能力鑒定的輔助指標，對探究油菜耐低氮脅迫遺傳機制，選育耐低氮脅迫油菜新種質(zhì)具有重要意義。

關鍵詞：甘藍型油菜；耐低氮脅迫能力；隸屬函數(shù)法；苗期；氮肥利用率

中圖分類號：S634.301文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）14-0124-10

甘藍型油菜（Brassica napus L.）因產(chǎn)量較高、適應能力較強，在我國油菜種植面積中占比達到80%左右［1］。2017年我國自產(chǎn)植物油占植物油消費總量的30.8%，國產(chǎn)油料難以滿足國民生產(chǎn)消費需求，供需不平衡的現(xiàn)象與日俱增［2］。因此，選育優(yōu)質(zhì)油菜種質(zhì)，提高油料自給率，對保證我國油料安全具有重要意義。在油菜生長發(fā)育過程中，氮（N）作為大量元素，對于其產(chǎn)量、品質(zhì)具有重要影響［3］。油菜處于苗期時，充足的氮素營養(yǎng)保證了其正常的生長發(fā)育，但在生產(chǎn)實踐過程中，成熟期卻常常因過量施用氮肥，導致油菜大量吸收氮素營養(yǎng)，造成其體內(nèi)營養(yǎng)元素平衡性被破壞，反而抑制了油菜的正常生長［4］。與其他作物相比，油菜對氮素營養(yǎng)需求量相對較大，然而其氮肥利用效率卻相對較低，生產(chǎn)者需要大量施用氮肥以保證其產(chǎn)量［5］。同時，過量施用氮肥會使盈余的氮素營養(yǎng)通過多種途徑流失，從而可能導致一系列的環(huán)境問題［6］。除作為油料作物外，油菜已開發(fā)出飼用、菜用、觀賞等多種用途。江西婺源、山西漢中等地以油菜花海為依托，打造了一批享譽全國的農(nóng)業(yè)觀光旅游景區(qū)，為推動當?shù)亟?jīng)濟社會發(fā)展提供了新動力［7］。因此，須要篩選出一批耐低氮脅迫能力強、適應性廣的油菜品種（品系），以節(jié)約成本、保護生態(tài)環(huán)境。

作物的耐低氮脅迫能力是一個復雜的數(shù)量遺傳性狀，可能受到多種功能基因的共同調(diào)控，且對環(huán)境因子的變化十分敏感，難以直接評價［8］。目前，關于油菜低氮脅迫耐受種質(zhì)和耐低氮脅迫機理研究已經(jīng)取得了一些進展。研究者們通過選擇低氮耐受的種質(zhì)進一步改良油菜氮效率（NUE）。Miersch等研究結(jié)果表明，半矮稈雜交種在多種條件下都表現(xiàn)出更高的氮收獲指數(shù)和氮利用效率，且通過試驗確定其在低氮條件下為氮高效基因型［9］。鄒小云等通過對抽薹期不同氮效率油菜的各性狀進行分析，發(fā)現(xiàn)油菜抽薹期氮素吸收效率由根平均直徑、最大葉長和葉寬的乘積、葉片的蒸騰速率以及油菜根系硝酸還原酶的活性共同決定［10］。Wang等發(fā)現(xiàn)在高氮和低氮2種條件下，根系形態(tài)（RM）良好或氮吸收效率（NupE）較高的種質(zhì)，其NUE也相對較高，且RM對NUE的影響比NupE對NUE的影響更加明顯［11］。上述研究通常比較多個農(nóng)藝性狀，并從中篩選出某項效應最大的單一指標從而評價油菜種質(zhì)耐低氮脅迫能力，然而油菜的耐低氮脅迫能力是一個復雜的性狀，不同低氮耐受型材料的耐性機制也不盡相同，利用單一指標篩選耐受材料的方法具有一定的局限性，其鑒定結(jié)果的有效性尚需進一步試驗驗證。而主成分分析法可以準確地計算多個指標所占權重，并從多個具有一定相關性的指標中計算出新的綜合變量，具有較好的準確性。本研究在前人基礎上，利用正常氮（6.0 mmol/L）和低氮（0.3 mmol/L）2種氮素營養(yǎng)水平，通過對49份油菜材料9個指標的耐低氮脅迫能力的綜合評價，分析比較了綜合指標與油菜苗期生物量之間的關系，以驗證低氮耐受指標的準確性，并對各指標進行評價，確定了油菜耐低氮能力評價的適宜指標，篩選獲得了一批低氮耐受材料，以期為油菜耐低氮品種選育提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甘藍型油菜自交系材料共49份（表1），均由華中農(nóng)業(yè)大學國家油菜工程技術研究中心提供，49份油菜資源主要來自于湖北、湖南、四川、重慶等省（市），前期研究結(jié)果表明，該群體材料具有廣泛的遺傳變異［12］。供試材料在2020年10月11日播種于湖北省武漢市蔡甸區(qū)江漢大學油菜種質(zhì)資源試驗區(qū)內(nèi)。

1.2 試驗設計與處理

為了探索能維持油菜最低生長要求的氮素營養(yǎng)水平，隨機挑選5個油菜材料，利用油菜水培方法培養(yǎng)至4葉期進行不同濃度氮營養(yǎng)處理（N濃度：0.1、0.3、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mmol/L）。根據(jù)結(jié)果，選取0.3 mmol/L濃度為低氮脅迫濃度，6.0 mmol/L濃度為正常氮營養(yǎng)水平。為精確考察49份油菜資源的耐低氮能力，Zeng等前期建立了一套大規(guī)模油菜水培系統(tǒng)［13］，可以同時培養(yǎng)超過 6 000 株油菜幼苗。在49份油菜自交系中每個基因型選出30粒種子進行發(fā)芽處理，再從中選出10株長勢相似的健康幼苗，移入水培系統(tǒng)中培養(yǎng)4周［12］。每周更換1次培養(yǎng)液，4周培養(yǎng)液分別為0.25×霍格蘭溶液、0.5×霍格蘭溶液、1×霍格蘭溶液和1×霍格蘭溶液。從第5周開始，將同種基因型10株幼苗均分為2組，分別以正常氮（H）水平（6.0 mmol/L）和低氮（L）水平（0.3 mmol/L）對油菜進行處理，營養(yǎng)液配方見表2。配方中，調(diào)節(jié)KNO3和 Ca（NO3）2 濃度控制正常氮營養(yǎng)液和低氮營養(yǎng)液的氮含量，因KNO3和Ca（NO3）2濃度導致的K+和Ca2+含量的改變則利用KCl和CaCl2補足。以后每7 d為2種條件更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)6周后收獲并進行表型精準鑒定。本次利用無重復隨機區(qū)組設計試驗。

1.3 表型鑒定

材料收獲后分成地上部（S）、地下部（R），考察其葉片數(shù)（LN）、株高（SL）、鮮質(zhì)量（SW、RW）。取地下部根系，去除表面雜質(zhì)后用去離子水多次沖洗，用愛普生掃描儀（Perfection V850 Pro）對甘藍型油菜根系進行掃描，通過根系形態(tài)分析軟件（WinRHIZO）分析獲得總根長（RL）、根平均直徑（RAD）、側(cè)根數(shù)（RT）等油菜根系形態(tài)指標。地上部干質(zhì)量（DSW）和地下部干質(zhì)量（DRW）采用 105 ℃ 殺青30 min后，80 ℃烘干至恒質(zhì)量測定其數(shù)值。

1.4 指標計算及數(shù)據(jù)分析

低氮脅迫耐受指數(shù)：為了排除因基因型背景差異而對試驗結(jié)果可能造成的影響，選擇計算油菜9個表型性狀的低氮脅迫耐受指數(shù)（ LNT-SW、LNT-RW、LNT-DSW、LNT-DRW、LNT-LN、LNT-SL、LNT-RL、LNT-RAD和LNT-RT，LNT為低氮條件下的表型性狀數(shù)值與正常氮條件下表型性狀數(shù)值之間的比值）［12］。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜幼苗在不同濃度氮營養(yǎng)水平下的表現(xiàn)

由圖1可知，不同氮營養(yǎng)水平下油菜幼苗的長勢呈現(xiàn)明顯的變化。其中高氮水平下，油菜生長正常，葉片顏色呈綠色，而隨著氮濃度的降低，油菜生長會因為氮素營養(yǎng)的逐漸缺乏，而受到不同程度的抑制，具體表現(xiàn)為葉片變小、顏色變黃，出現(xiàn)紫色葉片。在低氮濃度下，油菜幼苗生長極其緩慢。低氮水平對不同油菜品種的抑制效果存在一定的差異，說明不同基因型油菜的耐低氮能力不同。綜合考慮，選取0.3 mmol/L濃度為低氮脅迫濃度，6.0 mmol/L 濃度為正常氮營養(yǎng)水平。

2.2 不同氮水平條件下49份甘藍型油菜材料表型分析及相關性分析

由表3可知，在正常氮條件下，甘藍型油菜植株的SW平均值為21.45 g，變動范圍為7.36～41.97 g，變異系數(shù)（CV）為31.80%；RW的平均值為3.19 g，變動范圍為0.70～9.53 g，CV為45.98%；DSW的平均值為1.492 g，變動范圍為0.483～2.797 g，CV為34.68%；DRW的平均值為0.256 g，變動范圍為0.057～1.275 g，CV為71.07%；LN的平均值為8張，變動范圍為6～17張，CV為23.85%；SL的平均值為38.8 cm，變動范圍為 23.0～53.5 cm，CV為14.08%；RL的平均值為 1 205.31 cm，變動范圍為690.25～2 011.97 cm，CV為24.75%；RAD的平均值為0.360 mm，變動范圍為0.247～0.469 mm，CV為15.79%；RT的平均值為1 799條，變動范圍為911～3 456條，CV為36.33%。在低氮條件下，甘藍型油菜植株的SW平均值為6.52 g，變動范圍為2.63～14.10 g，CV為37.64%；RW的平均值為1.64 g，變動范圍為 0.49～3.23 g，CV為36.71%；DSW的平均值為0.814 g，變動范圍為0.314～1.780 g，CV為 35.13%；DRW的平均值為0.147 g，變動范圍為0.040～0.286 g，CV為37.11%；LN的平均值為5張，變動范圍為3～8張，CV為17.94%；SL的平均值為19.3 cm，變動范圍為13.7～25.0 cm，CV為16.00%；RL的平均值為1 532.95 cm，變動范圍為779.80～2 406.58 cm，CV為23.48%；RAD的平均值為0.263 mm，變動范圍為0.206～0.378 mm，CV為12.92%；RT的平均值為2 946條，變動范圍為 1 423～5 763條，CV為37.59%。SW、RW、DSW、DRW、LN、SL和RAD在低氮條件下的表型數(shù)值都極顯著低于正常氮條件下的表型數(shù)值，而RL和RT在低氮條件下的表型數(shù)值都極顯著高于正常氮條件下的表型數(shù)值。在6.0 mmol/L和0.3 mmol/L 2種氮濃度下，9個農(nóng)藝性狀都呈現(xiàn)出正態(tài)分布的趨勢（圖2），表明這些性狀可能均為數(shù)量性狀。

9個低氮脅迫耐受指數(shù)（LNT）均表現(xiàn)出較大的遺傳變異，LNT-SW的平均值為0.314，變動范圍為0.180～0.587，CV為31.80%；LNT-RW的平均值為0.559，變動范圍為0.205～0.963，CV為30.62%；LNT-DSW的平均值為0.561，變動范圍為0.283～0.963，CV為25.58%；LNT-DRW的平均值為0.645，變動范圍為0.215～0.981，CV為27.91%；LNT-LN的平均值為0.694，變動范圍為0.456～0.882，CV為12.11%；LNT-SL的平均值為0.503，變動范圍為0.365～0.703，CV為15.38%；LNT-RL的平均值為1.295，變動范圍為1.008～1.864，CV為18.15%；LNT-RAD的平均值為0.746，變動范圍為0.538～0.998，CV為18.23%；LNT-RT的平均值為1.704，變動范圍為1.008～3.470，CV為31.56%。結(jié)果表明，低氮脅迫條件對不同基因型油菜的SW、RW、DSW、DRW、LN、SL和RAD存在顯著的抑制效果，其中SW受影響最大。同時，低氮脅迫條件也會顯著促進RL和RT。此外，9個低氮脅迫耐受指數(shù)都有正態(tài)分布的特點（圖2）。

相關性分析結(jié)果（圖3）顯示，各性狀的低氮脅迫耐受指數(shù)之間還存在著一定的關聯(lián)性，這導致各指標所蘊含的信息可能存在交叉重復，且各性狀在油菜低氮脅迫耐受能力中發(fā)揮的作用也不完全一致，因此，直接以低氮脅迫耐受指數(shù)評價油菜品種耐低氮脅迫能力的方法是不準確的。

2.3 主成分分析

利用SPSS 24軟件對9個低氮脅迫耐受指數(shù)進行主成分分析（表4），前4個主成分（綜合指標CI1、CI2、CI3、CI4）的貢獻率分別達到了34.46%、16.30%、13.88%、10.57%，累計貢獻率合計為75.21%，其他可忽略。這樣就將原本9個低氮脅迫耐受指數(shù)轉(zhuǎn)化為了4個相互獨立的綜合指標。決定第1綜合指標大小的低氮脅迫耐受指數(shù)主要是SW、DSW、RW、RAD和DRW，可描述為生物量因子、根系形態(tài)因子；決定第2綜合指標大小的主要是RL和RT，可描述為根系形態(tài)因子；決定第3綜合指標大小的主要是SL和RAD，可描述為植株形態(tài)因子、根系形態(tài)因子；決定第4綜合指標大小的主要是LN，可描述為植株形態(tài)因子。

2.4 油菜耐低氮脅迫能力的綜合評價和聚類分析

利用公式計算不同基因型油菜所有綜合指標的隸屬函數(shù)、權重和耐低氮脅迫能力綜合評價D值（表5）。以D值作為衡量不同基因型油菜耐低氮脅迫能力的強弱，其中材料30（Jia931）和23（Huayou3）的D值較大，具有較強的耐低氮脅迫能力。

采用歐氏距離（euclidean metric）和最大距離法（max distance）對D值進行聚類分析（圖4），將49個基因型根據(jù)耐低氮脅迫能力分為3類，以綜合衡量不同甘藍型油菜種質(zhì)的耐低氮脅迫能力。其中8份材料被劃分為低氮脅迫耐受型種質(zhì)（表6），其D值均大于0.6；14份材料被劃分為低氮脅迫敏感型種質(zhì)，其D值均小于0.4；其他27份材料則被劃分為低氮脅迫中間型種質(zhì)，其D值處于0.4～0.6之間。

2.5 線性回歸預測油菜耐低氮脅迫能力

主成分分析結(jié)果表明，生物量因子和根系形態(tài)因子中RAD的貢獻率相對較高。因此以LNT-SW、LNT-RW、LNT-DSW、LNT-DRW和LNT-RAD作為自變量，以D值作為因變量，建立回歸方程：D=0.103+0.277x1+0.136x2+0.485x3+0.064x4-0.155x5（F=21.483**，R2=0.714）。該方程展示出5個低氮脅迫耐受指數(shù)和D值之間的顯著線性關系，簡化了性狀鑒定工作。與基于單一性狀的評價方法相比，該方法準確性高、篩選效率好。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

作物的耐低氮脅迫能力被廣泛認為是受多基因調(diào)控的數(shù)量性狀，每個相關的功能基因所發(fā)揮的作用可能相對微??；且功能基因與環(huán)境因子的互作會直接影響作物耐低氮脅迫能力的表現(xiàn)，這使得耐低氮脅迫能力性狀不穩(wěn)定，可能受到各種因素的影響［15］。因此，選擇正確的耐低氮脅迫能力評價方法是最終準確衡量作物耐低氮脅迫能力的關鍵。對于評價油菜耐低氮脅迫能力的指標，目前較為常用的有產(chǎn)量、生物量和根系形態(tài)等［10，16-17］?；蚨嗷蛏俅嬖谥嚓P性的多個性狀所提供的低氮耐受信息相互交叉重疊，展現(xiàn)出數(shù)量性狀的特點。因此，利用常規(guī)鑒定方法通過單一指標來評價油菜的耐低氮脅迫能力，可能因基因型差異而造成植株對低氮脅迫的反應不盡相同，使得結(jié)果較為片面；且某個單一指標也可能與其他指標存在相互作用，使得結(jié)果準確性差，難以準確而全面地反映不同基因型耐低氮脅迫能力的強弱。需要通過測定多種指標去綜合評價油菜的耐低氮脅迫能力，使得試驗結(jié)果更加真實可靠。利用多元統(tǒng)計分析方法，即主成分分析法和隸屬函數(shù)法，能夠?qū)⒉煌男誀钪笜?，轉(zhuǎn)化成新的綜合指標，其數(shù)目更少、相對獨立性更強，可以較為全面地表現(xiàn)作物不同性狀指標的全部信息，利用統(tǒng)計學方法計算出材料間的低氮耐受綜合指標值和D值，從而準確且全面地反映出作物的耐低氮脅迫能力。

隨著人們對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實際中過量施用氮肥可能造成的環(huán)境問題的逐漸關注，如何在保證作物產(chǎn)量的前提下減少氮肥的使用越來越成為科研人員的研究熱點。在低氮脅迫條件下選育氮高效即耐低氮脅迫能力強的品種（系），是解決這一問題的關鍵因素之一。目前，對水稻、小麥、玉米、大豆、高粱等作物在低氮脅迫條件下的氮高效遺傳機制及種質(zhì)篩選方法已經(jīng)有了大量的研究［18-22］。甘藍型油菜不同基因型間耐低氮脅迫能力差異顯著，具有廣泛的遺傳變異［23］。因此，選育耐低氮脅迫能力強的油菜種質(zhì)以減少氮肥施用具有廣闊的研究前景。鄒小云等利用NupE差異較大的甘藍型油菜種質(zhì)湘油15和R210為親本，以雜交和回交方法構建了6個世代，通過主基因配合多基因混合遺傳模型，發(fā)現(xiàn)不同的氮素營養(yǎng)效率鑒定指標對應著不同的遺傳模型，因而對種質(zhì)氮素營養(yǎng)效率的改良也應該按照領域和目的的不同，選擇最佳的氮素營養(yǎng)效率類別；他們也證明了通過不同氮效率油菜種質(zhì)間的雜交和回交可以選育出氮高效的基因型［24］。張浩等在高氮和低氮2種營養(yǎng)條件下，以不同基因型油菜種質(zhì)為材料，通過2年3點的田間試驗，發(fā)現(xiàn)油菜具有較大的減氮增產(chǎn)增效潛力，且不同的基因型間潛力差異較大，他們還以產(chǎn)量均值為依據(jù)，將供試材料劃分為不同氮效率的4種類型［25］。

利用主成分分析法和隸屬函數(shù)法綜合評價作物耐低氮脅迫能力的研究已經(jīng)在谷子、玉米和小麥等作物中得到了初步應用［26-28］。秦璐等也利用該方法對甘藍型油菜盛花期耐低氮脅迫能力進行了比較分析，但在苗期對甘藍型油菜耐低氮脅迫能力鑒定的研究尚未見報道［29］。本研究以各性狀的低氮脅迫耐受指數(shù)為標準評價油菜單一指標的耐低氮脅迫能力，利用主成分分析法將9個油菜農(nóng)藝性狀簡化為了4個相互獨立的綜合指標。這種方法既能較為全面地反映原性狀指標的信息，且更突顯出了不同基因型油菜的性狀差異。根據(jù)貢獻率計算出各綜合指標相應的隸屬函數(shù)值，加權后即可得到不同基因型油菜耐低氮脅迫能力的綜合評價值，即D值。進一步通過聚類分析，將49份油菜種質(zhì)劃分為3個類型，其中Jia931、Huayou3等8個材料被劃分為低氮脅迫耐受型種質(zhì)，Wanyou20、SWU74等14個材料被劃分為低氮脅迫敏感型種質(zhì)，Enyou73-1-2、B265等27個材料則被劃分為低氮脅迫中間型種質(zhì)。

作物抗逆性種質(zhì)篩選是一項工作量巨大、時間成本較高的工作，如何在種質(zhì)資源鑒定過程中，篩選出操作簡單、結(jié)果可靠的鑒定指標對于作物抗逆育種具有重要意義。目前已經(jīng)有許多與作物耐低氮脅迫能力相關的農(nóng)藝和生理指標被應用于研究，生物量、根系形態(tài)、株高、葉片數(shù)等指標均對低氮脅迫有顯著響應，可作為鑒定油菜耐低氮脅迫能力的指標［10，16-17，30］。本研究根據(jù)主成分分析結(jié)果，推測LNT-SW、LNT-RW、LNT-DSW、LNT-DRW和LNT-RAD這5個低氮脅迫耐受指數(shù)對油菜耐低氮脅迫能力可能具有較大的影響，因此以5個低氮脅迫耐受指數(shù)為自變量，以D值作為因變量進行了多元回歸分析，發(fā)現(xiàn)這5個指標確實與D值之間存在顯著線性關系，在一定程度上可以作為油菜苗期耐低氮脅迫能力的鑒定指標。

3.2 結(jié)論

本研究通過對49份油菜種質(zhì)9個農(nóng)藝性狀的低氮脅迫耐受指數(shù)進行主成分分析，簡化為了4個綜合指標。利用隸屬函數(shù)法計算出各材料的D值，并依據(jù)D值進行聚類，將49份油菜種質(zhì)劃分為3個類型，低氮脅迫耐受型種質(zhì)8個，低氮脅迫敏感型種質(zhì)14個，低氮脅迫中間型種質(zhì)27個。通過多元線性回歸，建立了以LNT-SW、LNT-RW、LNT-DSW、LNT-DRW和LNT-RAD計算不同基因型D值的回歸方程，簡化了油菜耐低氮脅迫能力鑒定的評價指標，使得鑒定過程更為迅速、簡單，為進一步改良現(xiàn)有優(yōu)質(zhì)油菜種質(zhì)的耐低氮脅迫能力提供了理論基礎。本研究重點關注了低氮脅迫對油菜苗期農(nóng)藝性狀的影響，而尚未對生理性狀進行研究。因此，后續(xù)有必要繼續(xù)開展相關研究，篩選到可靠的耐低氮脅迫能力較強的油菜種質(zhì)資源。

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收稿日期：2022-09-21

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（編號：2016YFD0100202-25）；湖北省漢江流域特色生物資源保護開發(fā)與利用工程技術研究中心開放基金（編號：06450003）。

作者簡介：陳敬東（1995—），男，湖北紅安人，碩士，從事作物遺傳育種研究。E-mail：cjd19951226@126.com。

通信作者：曾長立，博士，教授，從事油菜種質(zhì)資源研究，E-mail：zengchangli@jhun.edu.cn；萬何平，博士，講師，從事油菜遺傳研究，E-mail：362057164@ qq.com。