菜豆黃花葉病毒RPA-LFD技術(shù)快速檢測方法的建立與應(yīng)用

朱宇翔　秦嘉超　季英華　陳新　陳學(xué)好　崔曉艷

摘要：根據(jù)菜豆黃花葉病毒（bean yellow mosaic virus，簡稱BYMV）外殼蛋白基因序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立蠶豆中BYMV的重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，簡稱RPA）檢測方法。同時，將該方法與側(cè)向流動試紙條（LFD）檢測方法相結(jié)合，建立RPA-LFD快速檢測方法，并進(jìn)行特異性和靈敏度驗(yàn)證。結(jié)果表明，該方法可在 37～42 ℃等溫條件下進(jìn)行，30 min即可完成檢測。靈敏度試驗(yàn)表明，采用 RPA-LFD方法檢測BYMV的靈敏性是PCR方法的 100 倍。在特異性試驗(yàn)方面，與同屬于馬鈴薯Y病毒屬親緣關(guān)系較近的大豆花葉病毒（soybean mosaic virus，簡稱SMV）、菜豆普通花葉病毒（bean common mosaic virus，簡稱BCMV）和蕪菁花葉病毒（turnip mosaic virus，簡稱TuMV）無交叉反應(yīng)。因此，本研究建立的菜豆黃花葉病毒RPA-LFD技術(shù)檢測快速、靈敏且高效，有望成為我國菜豆黃花葉病毒田間診斷與防控的實(shí)用性技術(shù)手段。

關(guān)鍵詞：菜豆黃花葉病毒；重組酶聚合酶擴(kuò)增；側(cè)向流動試紙條；病毒檢測

中圖分類號：S436.43 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）14-0070-06

菜豆黃花葉病毒（bean yellow mosaic virus，簡稱BYMV）是馬鈴薯Y病毒屬的成員，屬于正義單鏈RNA病毒，全長9.5 kb，基因組編碼一條多聚蛋白，該多聚蛋白裂解成11個編碼蛋白：P1、HC-Pro、P3、P3N-PIPO、6K1、CI、6K2、NIa、NIb、VPg和CP［1-2］。研究人員常用外殼蛋白（CP）作為株系劃分的一個標(biāo)準(zhǔn)，它作為重要的結(jié)構(gòu)蛋白，主要參與病毒的運(yùn)動和介體傳播［3-9］。BYMV首次在1925年被報道，隨后在世界各個國家廣泛傳播［10］。寄主范圍特別廣泛，主要侵染豌豆和蠶豆［11-12］。通常以種子帶毒和蚜蟲非持久性傳播為主，也可通過汁液摩擦接種的方式傳毒。蠶豆受病的葉片一般會表現(xiàn)出系統(tǒng)花葉、斑駁等癥狀，嚴(yán)重時會造成植株畸形，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量及品質(zhì)［13］。目前菜豆黃花葉病毒已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的流行性植物病毒，造成豆科植物以及其他多種田間作物的大面積減產(chǎn)。關(guān)于菜豆黃花葉病毒的防治方法以選育優(yōu)良的抗病品種為主，田間管理時應(yīng)注意蚜蟲的防治并結(jié)合合理的藥劑防治，防止病毒病相互傳染，加重病情。因此，快速且高效的檢測方法對防控菜豆黃花葉病毒至關(guān)重要。

目前已報道的菜豆黃花葉病毒的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法［14］，包括直接抗原包被ELISA和雙抗體夾心ELISA［15］。然而，該方法檢測靈敏度低，且需要高質(zhì)量的抗體［16］；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）及RT-PCR法包括RT-PCR［17］、一步實(shí)時定量RT-PCR［16］、免疫捕捉RT-PCR［18］。該方法具有較高的靈敏度和特異性，被廣泛使用，但PCR對菜豆黃花葉病毒的檢測需要提取RNA、反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳及成像檢查擴(kuò)增子等［19］。步驟繁瑣、耗時長、需要大型昂貴儀器，不適合野外現(xiàn)場的快速檢測［20］。

重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）作為一種新型的等溫分析法，能夠?qū)χ参锊≡w內(nèi)的DNA或RNA進(jìn)行高度特異和有效的檢測。RPA已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、真菌和病毒的分子檢測。Ghosh等基于柑橘黃龍病病原菌（Candidatus Liberiabacter asiaticus）保守的16S RNA基因設(shè)計(jì)特異性引物對和探針，結(jié)合側(cè)向流動試紙條建立了RPA檢測體系［21］；Lei等利用便攜式實(shí)時熒光檢測儀完成了對甘藍(lán)型油菜莖基潰瘍?。↙ep tosphaeria maculans）的快速檢測［22］；Zhang等首次應(yīng)用 RPA 檢測李痘病毒 （plum pox virus，簡稱PPV）后，RPA逐漸應(yīng)用在植物病毒的檢測上［23］，比如番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，簡稱簡稱TYLCV）［24］、菜豆莢斑駁病毒 （bean pod mottle virus，簡稱BPMV）［25］、櫻桃病毒（cherry virus A，簡稱CVA）［26］、紫云英矮縮病毒（milk vetch dwarf virus，簡稱MVDV）［27］、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，簡稱CMV）［28］，顯示了其可應(yīng)用于檢測菜豆黃花葉病毒的潛力。RPA利用鏈置換聚合酶、重組酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）進(jìn)行DNA變性［29］，通過包括凝膠電泳、基于探針的熒光監(jiān)測或簡單的非儀器“夾心分析”，如側(cè)向流動試紙條等方法進(jìn)行檢測，該方法無需大型昂貴儀器進(jìn)行擴(kuò)增、電泳等繁瑣步驟，恒溫的條件下，短時間內(nèi)即可觀察結(jié)果。該方法簡單、快速、高效，非技術(shù)人員也可直接操作，對現(xiàn)場菜豆黃花葉病毒病株快速檢測具有良好的應(yīng)用潛力。

在本研究中，建立了基于RPA-LFD檢測BYMV的方法，開發(fā)引物和探針，不僅測試了對BYMV的特異性，而且可對RPA-LFD和PCR靈敏度進(jìn)行比較。同時，RPA-LFD檢測技術(shù)可以快速且有效地檢測出田間病樣中的BYMV。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年，從江蘇和云南不同地區(qū)收集9份表現(xiàn)出花葉癥狀的蠶豆病樣。所有樣本均PCR檢測和序列測定后儲存在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱。大豆花葉病毒（SMV）、菜豆普通花葉病毒（BCMV）和蕪菁花葉病毒（TuMV）樣本均儲存在筆者所在課題組實(shí)驗(yàn)室。本試驗(yàn)于2022年3—4月于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所完成。

1.2 RNA提取，cDNA合成

使用天根生化科技（北京）有限公司的植物總RNA提取試劑盒提取蠶豆葉片的總RNA，采用NanoDrop 2000C微體積紫外可見分光光度計(jì)測定RNA提取物的純度和濃度。使用北京擎科生物科技有限公司的Glodenstar RT6cDNA合成試劑盒，利用 1 μg 總RNA以20 μL體積合成第1鏈cDNA。cDNA-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RPA-LFD檢測BYMV

本研究中RPA的引物設(shè)計(jì)是按照制造商的引物設(shè)計(jì)說明（英國劍橋TwistDx）靶向部分菜豆黃花葉病毒CP基因（來自不同NCBI參考序列菌株CP的比對）。RPA使用來自TwistAmpnfo工具包的材料和方案（英國劍橋TwistDx）進(jìn)行。RPA反應(yīng)含有1 μL BYMV感染的蠶豆植株cDNA、29.5 μL Rehydration Buffer、2.1 μL 10 mmol/L正向引物（BYMV-RPA-F：5′-TTATTTGGACTTGATGGCAATGTTGGAACAGAC-3′） 和2.1 μL 10 mmol/L反向引物（BYMV-RPA-R：［5′BIOTIN］ACATAGTATTAAGTAATGTAACGCCAAATTATA-3′）、0.6 μL 10 mmol/L 探針（BYMV--probe：［5′FAM］GCAGGAGATGTCAATCGTGATATGCACACCAT［THF］CTTGGTGTTCGTATTT［3′BLOCK］）、12.2 μL ddH2O和2.5 μL 280 mmol/L醋酸鎂的50 μL反應(yīng)體積， 37 ℃ 擴(kuò)增20 min。對于側(cè)向流動分析，參考試劑盒操作（德國Milenia Genline HybriDetect試紙），將5 μL RPA擴(kuò)增產(chǎn)物與100 μL分析緩沖液（HybriDetect分析緩沖液）在新反應(yīng)管中混合。然后將側(cè)向流動試紙條（LFD）浸入混合物中，并在室溫下培養(yǎng)5 min。在控制區(qū)有1條可見線的條帶被視為陰性，在控制區(qū)和測試區(qū)都有2條可見線的條帶被視為陽性。

1.4 PCR檢測BYMV

PCR反應(yīng)使用10 μL 2×Taq Master Mix ll （with Dye）［天根生化科技（北京）有限公司］，0.5 μmol/L 正向引物 ［BYMV-CP-F：5′-CCAACATTC（T）CGCCAA（G）ATAATGT-3′］和反向引物 （BYMV-CP-R：5′-TAGAGAGAATGATACACATACTG-3′），1 μL cDNA和8 μL ddH2O。所有樣品在95 ℃下預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行35個循環(huán)（95 ℃? 30 s，58 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s），最后72 ℃延伸 10 min。獲得的PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上分離。溴化乙錠染色，Bio-Rad分子成像儀凝膠DOCXR系統(tǒng)（Bio-Rad，Hercules，CA，美國）觀察圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPA-LFD檢測BYMV方法的建立

以2份感染菜豆黃花葉病毒的蠶豆樣品的cDNA作為模板分別進(jìn)行PCR和RPA-LFD的擴(kuò)增，用健康蠶豆植株的cDNA作為陰性對照。PCR擴(kuò)增之后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出400 bp的目標(biāo)條帶，RPA-LFD試驗(yàn)使用特異性引物和探針成功地在感染植株中檢測到菜豆黃花葉病毒（圖1），陰性對照無條帶，表明RPA-LFD可用于菜豆黃花葉病毒的快速檢測。

2.2 RPA-LFD與PCR的靈敏度比較

為評估RPA-LFD的靈敏度，以菜豆黃花葉病毒檢測為陽性的蠶豆葉片總RNA為模板，以 10 倍濃度梯度進(jìn)行稀釋，反轉(zhuǎn)錄之后得到cDNA進(jìn)行 RPA-LFD 和PCR檢測的靈敏度比較。結(jié)果表明，RPA-LFD可以檢測到總RNA稀釋到10-5的樣品，而PCR僅能檢測到總RNA稀釋到10-3的樣品（圖2）。因此，本研究建立RPA-LFD的檢測方法比PCR靈敏100倍。

2.3 RPA-LFD特異性分析

BYMV屬于馬鈴薯Y病毒屬，分別以該屬侵染豆科作物的其他病毒（SMV、BCMV、TuMV）陽性樣品的cDNA和BYMV陽性樣品的cDNA為模板進(jìn)行RPA[CM（19*2/3]擴(kuò)增，同時以PCR進(jìn)行驗(yàn)證，對所建立的RPA-LFD 的方法特異性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，該引物和探針只能從含菜豆黃花葉病毒的cDNA中擴(kuò)增出條帶，大豆花葉病毒、蕪菁花葉病毒和菜豆普通花葉病毒的樣品均未檢測出條帶（圖3）。因此，所建立的RPA-LFD檢測技術(shù)具有良好的特異性，可以有效地檢測菜豆黃花葉病毒。

2.4 RPA-LFD田間樣品的檢測

2020年從江蘇和云南不同地區(qū)采集了9份疑似菜豆黃花葉病毒感染的蠶豆樣品葉片。通過RPA-LFD的方法檢測BYMV，同時用PCR進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果表明，9份樣品中有6個陽性植株，RPA-LFD 檢測結(jié)果與PCR結(jié)果一致（圖4）。因此，所建立的菜豆黃花葉病毒的RPA-LFD檢測技術(shù)可以快速且有效地檢測出田間病樣中的BYMV（表1）。

3 討論

1985年濮祖芹等利用血清學(xué)的方法曾在江蘇菜豆中檢測到菜豆黃花葉病毒［30］，之后在浙江［31］、云南［32］等地均有報道。 筆者所在實(shí)驗(yàn)室在2019—2021這3年間，從江蘇、安徽、云南、廣西、重慶、四川等地收集了200多份蠶豆疑似病樣，經(jīng)PCR檢測出的病毒，菜豆黃花葉病毒的占比接近30%，說明該病毒已經(jīng)對全國各地蠶豆的生產(chǎn)造成了嚴(yán)重威脅。病毒病的準(zhǔn)確檢測和診斷是有效防控作物病害的重要步驟，所以建立一套快捷、高效的檢測方法對有效地防止病害的流行起到至關(guān)重要的作用。

本研究建立的RPA-LFD檢測蠶豆植株中菜豆黃花葉病毒的方法操作簡單，反應(yīng)迅速而且具有較高的特異性。RPA-LFD可在37～42 ℃的常溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增，因?yàn)橐锏耐嘶鸷脱由焓怯擅附閷?dǎo)的，不是靠溫度驅(qū)動，從而不需要昂貴的熱循環(huán)儀，僅需在恒溫的水浴鍋中即可完成，甚至有學(xué)者通過RPA可常溫?cái)U(kuò)增的特點(diǎn)設(shè)計(jì)出了僅用人體體溫就能完成DNA擴(kuò)增的檢測方法［33］。在田間樣品檢測到的陽性病樣均經(jīng)PCR檢測得以驗(yàn)證，RPA-LFD最短可在20 min內(nèi)完成擴(kuò)增，通過側(cè)向流動試紙條5 min即可讀出結(jié)果，相比于PCR擴(kuò)增一般需要90 min左右，而且如果操作不當(dāng)，電泳條帶易不清晰或彌散，本研究建立側(cè)向流動試紙條的檢測方法耗時短，操作更簡易，結(jié)果直觀且易于辨識，非常適合用于野外病樣的快速診斷；同時，RPA-LFD檢測的靈敏度也是其優(yōu)勢之一，本研究中RPA-LFD檢測菜豆黃花葉病毒的靈敏度是PCR的100倍；本試驗(yàn)開發(fā)的引物和探針對菜豆黃花葉病毒具有特異性，而對其他3種馬鈴薯Y病毒屬的病毒無交叉反應(yīng)。

2006年RPA技術(shù)首次被報道，因其檢測快速、靈敏且高效等優(yōu)點(diǎn)，近年來在植物病毒檢測領(lǐng)域被廣泛使用。RPA-LFD技術(shù)可直接以粗提物為模板，操作簡便，避免了樣品制備的繁瑣過程，減少時間成本，可以直接在田間完成檢測［34］。不過，RPA技術(shù)還存在一些不足之處可供完善，比如其檢測成本較高于PCR，缺乏專門的引物和探針設(shè)計(jì)軟件，而且在檢測過程中容易受其他因素的影響，尤其是氣溶膠污染而產(chǎn)生假陽性，所以檢測應(yīng)在無污染且通風(fēng)良好的環(huán)境中進(jìn)行。隨著RPA技術(shù)的不斷完善，該技術(shù)有望成為我國菜豆黃花葉病毒田間診斷與防控的實(shí)用性技術(shù)手段。相比于傳統(tǒng)的分子檢測技術(shù)，RPA技術(shù)在植物快速診斷領(lǐng)域具有更為廣泛的應(yīng)用前景。

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收稿日期：2022-10-08

基金項(xiàng)目：國家食用豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號：CARS-08-G15）；江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（特糧特經(jīng)）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系集成創(chuàng)新中心項(xiàng)目（編號：JATS［2019］399）。

作者簡介：朱宇翔（1996—），男，江蘇南通人，碩士研究生，從事豆類作物病毒病的研究。E-mail：1017980413@qq.com。

通信作者：崔曉艷，博士，研究員，從事大豆花葉病毒及豆類作物抗病遺傳育種研究，E-mail：cxy@jaas.ac.cn；陳學(xué)好，博士，教授，從事黃瓜品質(zhì)性狀和抗逆性狀研究，E-mail：xhchen@yzu.edu.cn。