阿維鏈霉菌中ECF-Sig16對阿維菌素合成的影響

羅帥， 問亞琴， 朱華， 張蓉， 王曉雯， 劉麗麗， 朱建亞*

（1.北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院，北京 100176； 2.北京市農(nóng)林科學院水產(chǎn)科學研究所，北京 100068）

鏈霉菌屬是一類高G+C 含量的革蘭氏陽性絲狀細菌，屬于放線菌目。該屬不僅廣泛分布于有機質(zhì)豐富、含水量適中的中性或偏堿性土壤中[1],還存在于海水等環(huán)境中[2]。鏈霉菌生活周期比較復雜，生長時感應到營養(yǎng)匱乏信號后能發(fā)生明顯形態(tài)分化，而鏈霉菌的次級代謝往往與生長分化相偶聯(lián)，推測這2 種生理過程可能受到相同的蛋白調(diào)控。次級代謝物的合成通常受到簇內(nèi)調(diào)控蛋白和多效調(diào)控蛋白的調(diào)控，對這些調(diào)控蛋白進行遺傳操作可以顯著提高一些重要次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。

ECF (extracytoplasmin function)-Sigma 蛋白主要被細胞膜外信號激活，也可響應胞內(nèi)信號。ECF-Sigma 蛋白調(diào)控的生理功能非常廣泛，在細菌抵抗環(huán)境變化帶來的脅迫以適應生存中發(fā)揮重要作用。在珊瑚小雙孢菌中，ECF-SigMibX 控制臥孔菌素合成[3]。在谷氨酸棒狀桿菌中，ECFSigH 響應溫度脅迫[4]、巰基氧化脅迫[4]和酸脅迫[5]。在結核分枝桿菌中，ECF-SigE 在維持細胞表面完整性方面發(fā)揮重要作用[6]。鏈霉菌的代謝和生存環(huán)境比較復雜，基因組上含有的ECF-Sigma 基因多達幾十個[7]。天藍色鏈霉菌中有約50 個ECFSigma 調(diào)控蛋白，但是只有幾個ECF 因子得到深入研究。其中SigR 響應巰基氧化脅迫[8]和抗生素脅迫[9]；SigT 負調(diào)控氣生菌絲形成[10]，還能響應氮脅迫信號調(diào)控放線紫紅素合成[11]；SigE 在調(diào)控細胞表面壓力脅迫中發(fā)揮關鍵作用[12]；SCO4417 正調(diào)控放線紫紅素、鈣依賴型抗生素、氣生菌絲和孢子產(chǎn)生[13]。在其他鏈霉菌中，有關ECF-Sigma 調(diào)控蛋白的功能研究較少。在白色鏈霉菌中，antA是抑菌霉素合成基因簇內(nèi)的ECF-Sigma 基因，SigAntA 通過控制抑菌霉素前體供應調(diào)控抑菌霉素生成[14]；SigW 負調(diào)控鹽霉素生成及促進細胞生長[15]。在筑波鏈霉菌中，SigG1 調(diào)控形態(tài)分化[16]。在鏈霉菌KCCM 11116P 中，過表達ECF-Sigma 調(diào)控蛋白基因FujE能提高抗生素FK506產(chǎn)量[17]。

阿維菌素是由阿維鏈霉菌產(chǎn)生的較主要的代謝產(chǎn)物之一，具有廣譜、高效、低毒的殺蟲特性[18?19]，在農(nóng)業(yè)與醫(yī)藥領域擁有良好的應用市場。隨著阿維鏈霉菌全基因組測序完成和阿維菌素生物合成途徑的闡明，通過基因工程手段提高阿維菌素的產(chǎn)量取得了一些進展。aveR 是阿維菌素合成基因簇內(nèi)正調(diào)控基因[20]。阿維鏈霉菌中SAV151[21]和SAV576[22]、SAV577[22]3個TetR 家族的調(diào)控蛋白（TetR-family regulator, TFR）均抑制阿維菌素的合成。AvaR2負調(diào)控阿維菌素合成和阿維鏈霉菌生長，但不影響形態(tài)分化[23]。AraC 家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SAV742 抑制阿維菌素合成[24]。BldD 通過直接調(diào)控結構基因aveR 與aveA1、aveD、aveA4、aveF、aveBVⅢ促進阿維菌素合成[25]。ROK家族調(diào)節(jié)子ROK7B7 通過直接調(diào)控aveA1 抑制阿維菌素合成[26]。持家Sigma調(diào)控蛋白HrdB 能結合aveR 啟動子，突變的hrdB 基因?qū)氚⒕S鏈霉菌高產(chǎn)菌能使阿維菌素B1a 產(chǎn)量提高約50%[27]。阿維鏈霉菌基因組預測有60 個Sigma 基因，其中47 個屬于ECF-Sigma 基因，目前僅有關于ECF-Sig6、ECF-Sig25、ECF-Sig5 調(diào)控蛋白功能研究的報道。這3 種ECF-Sigma 因子都能間接地負調(diào)控阿維菌素的合成，且不影響菌株的生長與形態(tài)分化[28-30]，表明ECF-Sigma 蛋白可以參與阿維菌素生物合成調(diào)控。sig16 基因是阿維鏈霉菌高表達基因中唯一的ECF-Sigma 基因[31]，暗示其在阿維鏈霉菌生長發(fā)育中可能發(fā)揮重要作用，但其如何影響阿維菌素產(chǎn)生以及菌株分化尚缺乏深入研究，因此本研究通過構建sig16 缺失和過表達菌株，來考察Sig16對阿維菌素生物合成的影響和調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

本研究所用的菌株和質(zhì)粒詳見表1，引物詳見表2。

表1 試驗菌株和質(zhì)粒Table 1 Plasmids and strains used in the study

表2 試驗用引物Table 2 Primer sequences in this study

1.2 培養(yǎng)基

采用LB (luria bertani)培養(yǎng)基進行大腸桿菌常規(guī)培養(yǎng)，MM 培養(yǎng)基用于形態(tài)觀察[35]，YMS 培養(yǎng)基用于固體產(chǎn)孢培養(yǎng)與觀察[36]，可溶的發(fā)酵培養(yǎng)基FM-Ⅱ用于測定菌株的產(chǎn)量曲線與生長曲線[37], 種子培養(yǎng)基和不可溶發(fā)酵培養(yǎng)基FM-Ⅰ用于發(fā)酵[20]。

1.3 sig16缺失、過表達及回補菌株的構建

以野生型（wild type，WT）菌株總DNA 為模板，通過PCR擴增sig16基因的同源臂后連接到質(zhì)粒pKC1139, 隨后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109。通過驗證得到用于缺失sig16 基因的載體pDsig16，并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ET12567 中進行去甲基化，再轉(zhuǎn)入野生型阿維鏈霉菌獲得突變株。通過PCR方法，以WT和突變株的DNA為模板進行驗證，最終獲得sig16缺失菌株。

以WT 菌株總DNA 為模板，PCR 擴增含有sig16 基因的DNA 片段，將其連接到pJL117 質(zhì)粒中的紅霉素抗性基因啟動子ermEp*下游。將帶有啟動子的sig16 整合片段與質(zhì)粒pSET152 連接，獲得重組質(zhì)粒pSET152-ermp-sig16。去甲基化后的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入sig16 缺失菌株和WT 菌株中，得到sig16回補菌株和sig16過表達菌株。

1.4 阿維菌素的發(fā)酵

將孢子懸液進行梯度稀釋后涂布平板分離出產(chǎn)孢良好的單菌落。再將單菌落孢子轉(zhuǎn)接于YMS 上，28 ℃倒置培養(yǎng)7~10 d，待長出豐富孢子后接種于500 mL 三角瓶中 (YMS 培養(yǎng)基裝量為20%), 28 ℃、230 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h 后,按5%的接種量轉(zhuǎn)接至250 mL 三角瓶中(發(fā)酵培養(yǎng)基裝量為20%), 28 ℃、250 r·min-1搖床培養(yǎng)。

1.5 阿維菌素的產(chǎn)量測定

先取1.0 mL 發(fā)酵液，溶解于4.0 mL 甲醇中，浸泡30 min 以上，每隔10 min 用渦旋振蕩器振蕩1 次，共3 次。6 000 r·min-1離心10 min，取上清液經(jīng)過有機膜過濾后用高效液相色譜（high performance liquid chromatography, HPLC）測定阿維菌素產(chǎn)量。HPLC 分析條件:流動相為甲醇與水的混合溶液，體積比9∶1；流速1.0 mL·min-1;檢測波長246 nm。阿維菌素B1 標準品購自齊魯制藥廠,由質(zhì)量分數(shù)為97%的阿維菌素B1a 和3%的阿維菌素B1b 組成,將該標準品用甲醇溶解配制成200 μg·mL-1的溶液作為對照。

1.6 阿維鏈霉菌生物量測定

將在可溶發(fā)酵培養(yǎng)基FM-Ⅱ中培養(yǎng)的發(fā)酵液吸取1 mL用于產(chǎn)量測定，其余發(fā)酵液6 000 r·min-1離心10 min 收集菌絲體于80 ℃烘干,待菌體質(zhì)量基本不變時稱量細胞干重。

1.7 Sig16蛋白的大量表達及純化

PCR 擴增sig16基因片段，與pET-28a(+)質(zhì)粒相連得到蛋白表達載體pET28-sig16。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β -D thiogalactoside,IPTG）誘導后進行超聲破碎，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamid gel electrophoresis, SDS-PAGE）檢測結果顯示His6-Sig16 蛋白大部分存在于在上清液中。用鎳離親和層析介質(zhì)（Ni-nitrilotriacetic acid, Ni-NTA）進行蛋白純化，定量分裝后置于-80 ℃保存。

1.8 凝膠阻滯試驗

凝膠阻滯試驗(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)按照Roche 公司試劑盒（DIG Gel Shift Kit，2nd Generation）的說明書進行操作。PCR 擴增DNA 后在3’端用地高辛標記得到探針。按照說明書要求配置25 μL 樣品體系，在5%的非變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，蛋白-DNA復合物和游離的DNA 由于遷移率不同從而得到分離。電泳后通過電轉(zhuǎn)印法將探針轉(zhuǎn)移至尼龍膜上,用堿性磷酸酶發(fā)光底物進行檢測，暗室壓X 光片后顯影定影。

2 結果與分析

2.1 sig16及其附近基因的功能預測

sig16全長1 191 bp，編碼一個由396 個氨基酸殘基組成的ECF-Sigma 調(diào)控蛋白，其C-端含有1 個介導蛋白互作的三四氨基酸重復基序（tetratricopeptide repeat，TPR）（圖1A）。 上游SAV1196基因編碼未知功能蛋白。SAV1196與sig16間有1 bp 重疊，暗示這2 個基因共轉(zhuǎn)錄。從間隔區(qū)的距離和基因功能推測，sig16下游基因SAV1190~1194是共轉(zhuǎn)錄的,它們組成了1 個支鏈氨基酸ABC 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)操縱子。其中，SAV1190基因編碼底物結合蛋白，SAV1191編碼通透酶，SAV1192編碼通透酶，SAV1193編碼ATP 結合蛋白，SAV1194編碼ATP 結合蛋白。SAV1189是SAV1190的上游基因，編碼乙酰胺酶調(diào)節(jié)蛋白；SAV1188編碼MarR 家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白（圖1B）。

圖1 Sig16的保守結構域及sig16在野生型阿維鏈霉菌基因組中的位置Fig. 1 Conservative domain of Sig16 and organization of sig16 and its adjacent genes

2.2 Sig16對阿維菌素合成的影響

為研究阿維鏈霉菌中ECF-Sig16 的功能，以WT 菌株作為對照，將sig16基因的缺失菌株和回補菌株在可溶發(fā)酵培養(yǎng)基FM-I 中搖瓶發(fā)酵10 d。經(jīng)HPLC 檢測后發(fā)現(xiàn)，Dsig16 中阿維菌素的產(chǎn)量上升至野生型菌株的1.49 倍；回補株的產(chǎn)量與野生型相比無明顯差別；sig16過表達菌株的產(chǎn)量則顯著降低61%（圖2）。由此表明，Sig16 抑制阿維菌素的合成。

圖2 WT與sig16突變株中的阿維菌素產(chǎn)量Fig. 2 Avermectin production in WT and sig16 mutant strains

為明確ECF-Sig16 是否通過影響生物量抑制阿維菌素合成，將WT 菌株、sig16缺失菌株和回補菌株搖瓶發(fā)酵10 d，測定并繪制產(chǎn)量曲線和生長曲線。結果（圖3）顯示，在液體發(fā)酵期間，各菌株細胞干重無明顯差別，Sig16 不影響阿維鏈霉菌的菌體生長。sig16缺失菌株的阿維菌素產(chǎn)量較野生型明顯提高，說明Sig16 對阿維菌素合成的抑制作用并非通過刺激菌體生長實現(xiàn)。

圖3 WT和sig16突變株的阿維菌素產(chǎn)量曲線和生長曲線Fig. 3 Avermectin yield curve and growth curve of WT and sig16 mutant strains

2.3 Sig16與SAV1190啟動子區(qū)結合

ECF-Sigma 調(diào)控蛋白的功能是在接受信號后起始靶基因的轉(zhuǎn)錄，所以推測Sig16對阿維菌素合成基因簇基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用是間接的。為此，首先用重組His6-Sig16 蛋白與aveR和aveA1啟動子區(qū)探針進行了EMSA 試驗，結果如圖4A 所示?？梢钥闯?，His6-Sig16 不能與探針發(fā)生特異性結合，證實Sig16 對aveR和aveA1的轉(zhuǎn)錄負調(diào)控作用是間接的。

圖4 His6-Sig16與探針aveRp、aveA1p、SAV1188p、SAV1190p和SAV1196p的體外EMSA試驗Fig. 4 EMSA assays of His6-Sig16 with probes aveRp， aveA1p， SAV1188p， SAV1190p and SAV1196p

ECF-Sigma調(diào)控蛋白通常能夠結合自身基因啟動子從而起始轉(zhuǎn)錄[38]，因此利用EMSA 檢測了Sig16 與自身啟動子的結合情況。sig16和上游SAV1196基因有1 bp重疊，推測二者共用啟動子。SAV1196和SAV1197轉(zhuǎn)錄方向相反，推測這2 個基因的啟動子應位于基因間隔區(qū)內(nèi)。PCR 擴增該間隔區(qū)片段并標記為探針SAV1196，結果顯示，His6-Sig16 蛋白不能使探針發(fā)生滯留，表明Sig16不能結合該啟動子起始轉(zhuǎn)錄（圖4）。

推測在SAV1188基因上游區(qū)域可能含有自身基因啟動子。在SAV1189~SAV1190基因間隔區(qū)，可能包含有支鏈氨基酸ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)操縱子的啟動子。因此利用PCR 擴增并標記DNA 片段，命名為探針SAV1188p與探針SAV1190p。EMSA結果顯示，His6-Sig16蛋白不能與探針SAV1188p結合形成滯留條帶，但能夠與探針SAV1190p特異性結合形成滯留條帶（圖4B），暗示Sig16 可以結合在SAV1190基因啟動子區(qū)起始SAV1190操縱子中基因的轉(zhuǎn)錄。

2.4 Sig16對阿維鏈霉菌形態(tài)分化的影響

為研究Sig16 是否影響阿維鏈霉菌的形態(tài)分化，在YMS和MM固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察野生型菌株、sig16缺失菌株和回補菌株的生長及形態(tài)分化，結果如圖5所示。在產(chǎn)孢培養(yǎng)基YMS上，各菌株進行正常形態(tài)分化，產(chǎn)孢能力無明顯差別。在營養(yǎng)物質(zhì)貧乏的基本培養(yǎng)基MM 上，菌株維持較慢生長狀態(tài)，且各菌株間生長情況也無明顯差別。由此表明，Sig16在上述培養(yǎng)條件下不影響阿維鏈霉菌的生長和形態(tài)分化。

圖5 sig16突變株在YMS和MM固體培養(yǎng)基上的形態(tài)觀察Fig. 5 Morphologic observation of sig16 mutant strains incubated on YMS and MM solid medium

3 討論

通過對sig16基因突變株進行搖瓶發(fā)酵和生長曲線的分析，表明Sig16能夠抑制阿維菌素的合成，但不影響阿維鏈霉菌生長。EMSA 結果顯示Sig16 不能直接結合在aveA1和aveR啟動子區(qū)，暗示Sig16 對阿維菌素合成基因簇中的轉(zhuǎn)錄抑制作用是間接的，推測Sig16的靶基因可能直接或間接地負調(diào)控aveR和aveA1的表達。在糖多孢紅霉菌中，支鏈氨基酸是紅霉素合成的前體物質(zhì)，對支鏈氨基酸ABC 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進行遺傳操作能提高紅霉素的產(chǎn)量[39]。Sig16 能特異性地結合在支鏈氨基酸ABC 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)操縱子的啟動子，暗示Sig16 能直接調(diào)控支鏈氨基酸的轉(zhuǎn)運。支鏈氨基酸包含亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，它們不但是蛋白質(zhì)的合成單元，異亮氨酸和纈氨酸還是阿維菌素a 組分和b 組分合成起始單元的前體物質(zhì)[40]，推測Sig16能通過控制胞內(nèi)支鏈氨基酸的含量抑制阿維菌素合成。目前對SAV1190~SAV1194的研究還未見報道，它們是否影響阿維菌素合成還需進一步研究。

ECF-Sigma 調(diào)控蛋白通常是一種多效調(diào)控蛋白，其直接作用的靶基因廣泛分布于基因組中，有些靶基因與ECF-sigma 基因相距較遠。在阿維鏈霉菌中，雖然ECF-Sig6、ECF-Sig25、ECF-Sig5 能影響阿維菌素的合成，但具體機制仍不清楚。目前也沒有研究發(fā)現(xiàn)能夠起始aveR轉(zhuǎn)錄的ECF-Sigma調(diào)控蛋白。深入了解阿維鏈霉菌中包含ECFSigma 蛋白調(diào)控系統(tǒng)在內(nèi)的阿維菌素合成調(diào)控機制有助于改善菌株的基因工程改造效果，選育更加高產(chǎn)的阿維菌素工業(yè)生產(chǎn)菌株。在今后試驗中還可嘗試通過ChIP-seq尋找Sig16的直接靶基因，進而揭示Sig16調(diào)控阿維菌素合成的機制。