響應(yīng)面法優(yōu)化禾谷鐮刀菌產(chǎn)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其衍生物的液體培養(yǎng)條件

趙秀英， 黃晴雯， 曹浩杰， 王杰， 李瑞姣，聶冬霞， 韓錚， 趙志輝*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，上海 201403）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）又稱嘔吐毒素，主要是由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）和黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum）產(chǎn)生的次級有毒代謝產(chǎn)物[1?2]。DON 具有細(xì)胞毒性、遺傳毒性、免疫毒性等多種毒性，是世界各地谷類作物的常見污染物[3-5]，已被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）和世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）確定為較危險(xiǎn)的自然發(fā)生食品污染物之一[6-8]。鑒于其較高的毒性和普遍污染的特性，世界各國組織都規(guī)定了谷物和谷物制品中DON 的最大容許限度，歐洲共同體委員會（European Community ，EC）確定了未加工谷物（硬粒小麥、燕麥和玉米除外）中DON 的限量為1 250 μg·kg?1，未加工的硬粒小麥和燕麥為1 750 μg·kg?1[9]。我國規(guī)定小麥、面粉、玉米和玉米粉等谷物及其制品中DON 含量均不得高于1 000 μg·kg?1[10]。

鐮刀菌在適宜條件下不僅會產(chǎn)生原型DON，也會生成其乙?；苌?，DON 的乙酰化主要發(fā)生在3’和15’位點(diǎn)，分別為3-乙?；撗跹└牭毒┐迹?-acetyldeoxynivalenol，3-ADON）和15-乙?；撗跹└牭毒┐迹?5-acetyldeoxyniva?lenol，15-ADON）。不同種的鐮刀菌菌株可以產(chǎn)生不同化學(xué)型的真菌毒素。例如，禾谷鐮刀菌可同時(shí)產(chǎn)生DON 和15-ADON 或者DON 和3-ADON，并且它們的分布隨地理位置和采樣年份會發(fā)生變化[11?12]。DON 及其衍生物在小麥等谷物中普遍存在，繼而對人類和動(dòng)物的安全造成嚴(yán)重威脅，因此，需重視DON 乙?；a(chǎn)物的相關(guān)研究。乙?；疍ON 是DON 生物合成的直接前體，其產(chǎn)生受到菌株自身特性、外界環(huán)境（如營養(yǎng)成分、培養(yǎng)條件等）的共同調(diào)節(jié)。前人關(guān)于DON 及其衍生物發(fā)生規(guī)律的研究主要集中于小麥、玉米、大米等固體培養(yǎng)基中[13-15]。但是，固體培養(yǎng)基中的主要影響因素和條件如培養(yǎng)基的成分、初始pH、菌絲量等難以控制和測量，因此難以精確分析各因素對菌株生長和毒素產(chǎn)生的影響。液體發(fā)酵可以精確調(diào)控相關(guān)影響因素，并且獲得大量菌絲體或代謝產(chǎn)物，且培養(yǎng)周期短，更易于擴(kuò)大培養(yǎng)[16?17]。因此，研究液體基質(zhì)中DON 原型和乙?；疍ON 的產(chǎn)生規(guī)律具有重要意義，可更好地確定產(chǎn)毒的最佳營養(yǎng)和環(huán)境參數(shù)。

本研究采用液體培養(yǎng)法對禾谷鐮刀菌的產(chǎn)毒條件進(jìn)行優(yōu)化，通過響應(yīng)面法分析不同培養(yǎng)基組成（碳源、氮源等的含量）和不同培養(yǎng)條件（培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、初始pH 等）對DON 及其乙?；苌锂a(chǎn)生的影響，欲明確禾谷鐮刀菌產(chǎn)毒的主要影響因素，為農(nóng)產(chǎn)品中DON 及其衍生物的污染防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)試劑：甲醇、乙腈（色譜純）購于美國Merck公司；乙酸銨購于美國CNW公司；葡萄糖、乙酸鈉、硝酸鉀（KNO3）、磷酸二氫銨（NH4H2PO4）、氯化鉀（KCl）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、七水合硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、七水合硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）、七水合硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）（分析純）購于上海源葉生物科技有限公司；DON、3-ADON、15-ADON標(biāo)準(zhǔn)品購于青島普瑞邦生物工程有限公司；PDA培養(yǎng)基購于北京沃凱生物科技有限公司；Milli-Q超純水購于美國Millipore公司。

試驗(yàn)儀器：Heraguard ECO 超凈臺（美國Thermo Fisher 公司）、MJ-300 霉菌培養(yǎng)箱（上海般諾生物科技有限公司）、CL-40L 高壓滅菌鍋（日本ALP 公司）、ST16R 冷凍離心機(jī)(美國Thermo Scientific 公司）、HSC-24B 氮吹儀（上海楚定分析儀器有限公司）、TH-2500 超聲波清洗儀（上海安譜試驗(yàn)科技股份有限公司）、ST3100 pH 計(jì)（奧豪斯儀器（常州）有限公司）、ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）和TRIPLE QUADTM 5500 三重四級桿質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）。

禾谷鐮刀菌株1096 由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢驗(yàn)技術(shù)研究所真菌毒素研究室提供，購自德國微生物菌種保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1菌株的活化 將禾谷鐮刀菌菌株1096 接種在PDA 平板培養(yǎng)基中央，置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，黑暗條件下培養(yǎng)5 d，用于后續(xù)接種。

1.2.2菌株的液體培養(yǎng) 在超凈工作臺內(nèi)用直徑為1 cm的打孔器取1個(gè)活化菌種的外圈菌餅，接種到滅菌后的液體培養(yǎng)基內(nèi)，用無菌封口膜包扎好后放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后過濾分離菌絲和濾液，菌絲于60 ℃干燥，稱重。

1.2.3液體培養(yǎng)基配方優(yōu)化 固定無機(jī)鹽成分和比例（KCl 2 g·L?1，KH2PO40.5 g·L?1，MgSO4·7H2O 0.7 g·L?1，F(xiàn)eSO4·7H2O 15 mg·L?1，ZnSO4·7H2O 20 mg·L?1），以培養(yǎng)基成分中的葡萄糖、乙酸鈉、KNO3、NH4H2PO4的質(zhì)量濃度為單因素自變量[18?19]，考察葡萄糖質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50 g·L?1，乙酸鈉質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0 g·L?1，KNO3質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0 g·L?1，NH4H2PO4質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0 g·L?1時(shí)對毒素含量及菌絲量的影響，28 ℃黑暗培養(yǎng)2周，每組3個(gè)平行，優(yōu)化最佳的培養(yǎng)基成分配比。

1.2.4培養(yǎng)條件優(yōu)化 以培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、初始pH為單因素自變量[20-22]，固定培養(yǎng)基初始pH為6，培養(yǎng)溫度為28 ℃，考察培養(yǎng)時(shí)間分別為5、10、15、20、25 d 時(shí)對毒素含量及菌絲量的影響；固定培養(yǎng)基初始pH為6，培養(yǎng)時(shí)間15 d，培養(yǎng)溫度分別為15、20、25、28、31 ℃時(shí)對毒素含量及菌絲量的影響；固定培養(yǎng)時(shí)間為15 d，培養(yǎng)溫度為28 ℃，初始pH 分別為4、5、6、7、8 時(shí)對毒素含量及菌絲量的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5響應(yīng)面法確定最佳培養(yǎng)條件 綜合以上培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取合適的單因素范圍，以毒素的產(chǎn)出量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken 原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面曲面分析試驗(yàn)，確定最佳培養(yǎng)條件。使用Design Expert 8.0.6 進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)因素和水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Response surface experiment factors and levels

1.2.6樣品處理及分析 樣品處理：培養(yǎng)結(jié)束后，精確吸取5 mL 濾液于50 mL 離心管中，加入20 mL乙腈，超聲提取30 min后，4 500 r·min?1離心10 min，取5 mL 上清液氮吹至近干，采用1 mL 的5 mmol·L?1乙酸銨水溶液/甲醇（體積分?jǐn)?shù)50/50）溶解殘?jiān)?，充分溶解后，適量稀釋，過0.22 μm 濾膜，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-highperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）測定含量。

液相色譜條件：ACQUITY UPLC BEH-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B 為5 mmol·L?1乙酸銨水溶液；梯度洗脫程序：0—1 min，10% A；1—8 min，10 % A~30% A；8—9 min，30% A~90% A；9—9.1 min，90% A~10% A；9.1—11 min，90% A~10% A；流速0.3 mL·min?1；進(jìn)樣量3 μL；柱溫40 ℃。

質(zhì)譜條件：離子化模式為電噴霧電離源（electrospray ionization source, ESI）；質(zhì)譜掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)模式；離子源溫度500.0 ℃；噴霧電壓5 500 V；霧化氣50 Psi；輔助氣50 Psi；碰撞氣8 Psi；噴霧電壓氣簾氣35 Psi。DON、3-ADON 和15-ADON 的母離子、子離子和碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 DON、3-ADON和15-ADON的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS/MS parameters for DON， 3-ADON and 15-ADON

通過測定線性、靈敏度、回收率和精密度驗(yàn)證分析方法。DON、3-ADON 和15-ADON 在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999。以定性離子通道信噪比（signal to noise，S/N）為3 時(shí)的樣品質(zhì)量濃度為目標(biāo)毒素的檢出限（limit of detection，LOD）；定量離子通道信噪比為10 時(shí)的樣品質(zhì)量濃度為目標(biāo)毒素的定量限（limit of quantitation，LOQ）；測定分析方法的靈敏度。DON的LOD為1 μg·L?1，LOQ為2 μg·L?1；3-ADON和15-ADON 的LOD 均為0.5 μg·L?1，LOQ 均為1 μg·L?1。將3種毒素按低、中、高3個(gè)水平（5、50、100 μg·L?1）進(jìn)行空白基質(zhì)加標(biāo)，經(jīng)處理后上機(jī)測定3 種毒素的實(shí)際質(zhì)量濃度，將實(shí)際質(zhì)量濃度與理論值的百分比計(jì)為回收率，以1 d 內(nèi)測定3 次和連續(xù)3 天測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別作為日內(nèi)精密度和日間精密度。DON 的加標(biāo)回收率范圍為81.03%~103.97%，3-ADON 的加標(biāo)回收率范圍為80.18%~86.06%，15-ADON 的加標(biāo)回收率范圍為81.34%~90.72%；該方法的精密度（RSD）范圍在2.80%~11.98%之間（表3）。

表3 液體培養(yǎng)基中DON、3-ADON和15-ADON的回收率和精密度Table 3 Recoveries and precisions of DON， 3-ADON， and 15-ADON in liquid culture （n=3）

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Origin Pro 2019 作圖，使用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 液體培養(yǎng)基配方優(yōu)化結(jié)果分析

2.1.1葡萄糖添加量的影響 受試鐮刀菌株在液體培養(yǎng)中的主要產(chǎn)物是DON 和15-ADON，幾乎無3-ADON，標(biāo)準(zhǔn)品和培養(yǎng)物MRM 圖譜如圖1 所示。隨著葡萄糖添加量的增加，菌絲量和毒素含量都隨之增加，當(dāng)葡萄糖增加到40 g·L?1時(shí)，DON 和15-ADON 的產(chǎn)量增加趨勢趨于平緩（圖2A）。葡萄糖是一種速效碳源，有助于菌體的生長繁殖，且隨著葡萄糖含量的增多，毒素產(chǎn)量也逐漸增高。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液與培養(yǎng)物樣品溶液的TIC圖譜Fig. 1 TIC chromatograms of the standard solution and the sample

圖2 不同培養(yǎng)基條件下菌株的生長及DON和15-ADON產(chǎn)量Fig. 2 Growth of strains and production of DON and 15-ADON under different culture mediums

2.1.2乙酸鈉添加量的影響 乙酸鈉作為大多數(shù)真菌毒素的合成前體，其添加量對DON和15-ADON的產(chǎn)量具有較大影響（圖2B）。一定范圍內(nèi)隨著乙酸鹽添加量的增加，DON 和15-ADON 產(chǎn)量也逐漸增多，其中當(dāng)乙酸鈉為1.5 g·L?1時(shí)，DON 產(chǎn)量最高；當(dāng)其添加量為1 g·L?1時(shí)，15-ADON 產(chǎn)量最高。繼續(xù)增加乙酸鹽，DON 及15-ADON 的產(chǎn)量均逐漸降低，但菌絲量隨著乙酸鈉添加量的增加呈持續(xù)增加趨勢。

2.1.3KNO3添加量的影響 從圖2C 可以看出，隨著硝酸鹽添加量的增大，菌絲量平緩增加，但DON 和15-ADON 的產(chǎn)量呈現(xiàn)下降趨勢，其中不添加硝酸鹽的毒素產(chǎn)量最高。

2.1.4NH4H2PO4添加量的影響 隨著NH4H2PO4添加量的增加，DON 和15-ADON 的產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后降低的現(xiàn)象（圖2D）。當(dāng)銨鹽為1 g·L?1時(shí)，毒素產(chǎn)量最高；添加銨鹽也會影響菌絲的生長，但影響較小。綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，得出受試菌株產(chǎn)DON的各營養(yǎng)元素的最佳質(zhì)量濃度為：葡萄糖50 g·L?1，乙酸鈉1.5 g·L?1，NH4H2PO41 g·L?1；產(chǎn)15-ADON 的最佳質(zhì)量濃度為：葡萄糖50 g·L?1，乙酸鈉1.0 g·L?1，NH4H2PO41 g·L?1。

2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果分析

2.2.1初始pH 的影響 pH 是影響菌株生長和代謝的重要因素，受試菌株在不同酸堿環(huán)境下的生長和產(chǎn)毒情況如圖3A 所示，菌絲量隨著初始pH的升高而增加，說明堿性條件更利于菌株生長；DON 和15-ADON 的產(chǎn)量均隨著pH 的升高先增加后降低，其中最佳產(chǎn)毒初始pH為5。

2.2.2培養(yǎng)溫度的影響 適宜的培養(yǎng)溫度是真菌生長繁殖及代謝產(chǎn)毒的必要條件，溫度過高或過低均會抑制真菌生長代謝，導(dǎo)致菌株產(chǎn)毒能力下降甚至不產(chǎn)毒。由圖3B可知，菌體的最適生長溫度和最佳產(chǎn)毒溫度不一致，其中受試菌株的最適生長溫度為25 ℃；最佳產(chǎn)毒溫度為28 ℃。

A：初始pH；B：培養(yǎng)溫度；C：培養(yǎng)時(shí)間A： Initial pH； B： Incubation temperature； C： Incubation time

2.2.3培養(yǎng)時(shí)間的影響 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌絲量不斷增多，DON 產(chǎn)量在培養(yǎng)第20天達(dá)到最大，此后產(chǎn)量相對于菌絲量不斷減少，而15-ADON 的產(chǎn)量在培養(yǎng)第15 天達(dá)到最高，此后產(chǎn)量不斷降低（圖3C）。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化液體培養(yǎng)條件

2.3.1DON 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇培養(yǎng)時(shí)間（A）、培養(yǎng)溫度（B）和培養(yǎng)初始pH（C）作為自變量，以DON的產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。使用Design-Expert 8.0.6 軟件對表4 的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，擬合方程為如下。

表4 DON 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results for response surface experiments of DON

該回歸模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.979 4，調(diào)整R2為0.952 9，表明此回歸模型可以解釋95.29% 響應(yīng)值的變化。整體模型達(dá)到顯著水平（P<0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.846 6），表明該模型的擬合度較好，準(zhǔn)確度高，試驗(yàn)誤差小。因此可以用該模型對影響DON產(chǎn)量的培養(yǎng)條件進(jìn)行預(yù)測和分析。方差分析結(jié)果表明，A、C、A2、B2、C2對DON的產(chǎn)量影響極顯著（P<0.01），B、AC對DON的產(chǎn)量影響顯著，其他均不顯著（P>0.05）(表5)。

表5 DON響應(yīng)面模型方差分析Table 5 Analysis of variance for quadratic regression equation of DON

通過Design-Expert 8.0 6軟件對各因素及因素間的交互作用進(jìn)行分析，得到相應(yīng)的響應(yīng)面和等高線圖（圖4）。培養(yǎng)時(shí)間的變化曲面弧度較培養(yǎng)溫度的變化趨勢更陡，說明培養(yǎng)時(shí)間對DON 產(chǎn)量的影響較培養(yǎng)溫度更顯著；培養(yǎng)基初始pH的變化曲面弧度較培養(yǎng)溫度的變化趨勢更陡，說明培養(yǎng)基初始pH對DON產(chǎn)量的影響較培養(yǎng)溫度更顯著。在因素間交互項(xiàng)作用對DON 產(chǎn)量的影響中，培養(yǎng)時(shí)間與初始pH 的等高線圖呈橢圓形，說明2 因素間交互作用顯著影響DON 產(chǎn)量，且該結(jié)果與影響DON產(chǎn)量的各因素顯著性分析結(jié)果（表5）一致。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度和初始pH交互結(jié)果對DON的產(chǎn)量的響應(yīng)面及等高線圖Fig. 4 Response surface and contour map of the interactive effects of incubation time， incubation temperature and initial pH value on the production of DON

通過模型得出液體培養(yǎng)產(chǎn)DON 的最佳條件為：培養(yǎng)時(shí)間21.79 d，培養(yǎng)溫度26.26 ℃，初始pH 6.35；在此培養(yǎng)條件下，理論預(yù)測的DON 產(chǎn)量為5 860.35 μg·L?1?？紤]到實(shí)際的可操作性，將液體培養(yǎng)產(chǎn)DON 的最佳條件矯正為：培養(yǎng)時(shí)間22 d，培養(yǎng)溫度26.3 ℃，初始pH 6.35，實(shí)際培養(yǎng)后DON 的產(chǎn)量為5 739.69 μg·L?1，與理論預(yù)測值的相對誤差為2.1%。

2.3.215-ADON 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的因素及范圍，選擇培養(yǎng)時(shí)間（A）、培養(yǎng)溫度（B）和初始pH（C）作為自變量，以15-ADON 的產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行3 因素3 水平的Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果如表6 所示。使用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析，15-ADON的擬合方程如下。

表6 15-ADON響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results for response surface experiments of 15-ADON

模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.970 5，調(diào)整R2為0.932 5，表明自變量選擇合適，模型能較好的描述試驗(yàn)結(jié)果。整體模型達(dá)到顯著水平（P<0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.748 7），表明該模型的擬合度較好，準(zhǔn)確度高。方差分析結(jié)果（表7）表明，A、A2、B2、C2對15-ADON 產(chǎn)量影響極顯著（P<0.01），B、C、AB對15-ADON 產(chǎn)量影響顯著（P<0.05），其他不顯著。

表7 15-ADON響應(yīng)面模型方差分析Table 7 Analysis of variance for quadratic regression equation of 15-ADON

通過Design-Expert 8.0 6 軟件對影響15-ADON 產(chǎn)量的各因素及因素間的交互作用進(jìn)行分析，得到不同因素交互作用的響應(yīng)面圖及等高線圖（圖5）。培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度間形成了較明顯的曲面，說明15-ADON 的產(chǎn)量對培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度敏感；等高線呈橢圓形，表明2 因素間交互作用對15-ADON 產(chǎn)量影響顯著；培養(yǎng)時(shí)間的變化曲面弧度較培養(yǎng)溫度更為陡峭，說明培養(yǎng)時(shí)間對15-ADON 產(chǎn)量的影響較培養(yǎng)溫度更顯著。培養(yǎng)時(shí)間變化曲面弧度較初始pH更陡峭，說明培養(yǎng)時(shí)間對15-ADON 產(chǎn)量的影響較初始pH 更顯著。溫度與初始pH 的等高線圖中2 因素形成的曲線斜率相近，表明交互作用較弱。以上結(jié)果與各影響因素對15-ADON 產(chǎn)量影響的顯著程度分析結(jié)果（表7）一致。

圖5 培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度和初始pH交互結(jié)果對15-ADON的產(chǎn)量的響應(yīng)面及等高線圖Fig. 5 Response surface and contour map of the interactive effect of incubation time， incubation temperature and initial pH value on the yield of 15-ADON

通過模型得出液體培養(yǎng)產(chǎn)15-ADON 的最佳條件為：培養(yǎng)時(shí)間21 d，培養(yǎng)溫度25.26 ℃，初始pH 5.58，在此培養(yǎng)條件下，理論預(yù)測的15-ADON產(chǎn)量為10 163.8 μg·L?1?？紤]到實(shí)際的可操作性，將最佳培養(yǎng)條件調(diào)整為：培養(yǎng)時(shí)間21 d，培養(yǎng)溫度26.3 ℃，初始pH 5.58，此條件實(shí)際培養(yǎng)后15-ADON 的產(chǎn)量為10 453.41 μg·L?1，與理論預(yù)測值的相對誤差為2.80%。

3 討論

真菌代謝產(chǎn)物的生成效率與菌株自身特性有關(guān)，同時(shí)也受到培養(yǎng)條件的影響，因此培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分及培養(yǎng)條件對禾谷鐮刀菌產(chǎn)毒是非常重要的。

在培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分中，對菌體生長和代謝影響最大是碳源和氮源的組成和比例。本研究使用葡萄糖作為碳源，研究其不同質(zhì)量濃度對受試菌株生長和代謝的影響。葡萄糖是速效碳源，有助于菌體的生長繁殖，且隨著葡萄糖添加量的增加，菌株的毒素產(chǎn)量增多，與甄玉萍等[23]的研究結(jié)果一致。乙酸鹽是很多真菌代謝產(chǎn)物的合成前體，其添加量對DON和15-ADON的產(chǎn)量有顯著影響。本研究結(jié)果表明，添加乙酸鹽會影響毒素的產(chǎn)率，但具體是因?yàn)橐宜猁}的直接作用還是因?yàn)樘砑右宜猁}導(dǎo)致pH變化的影響，還需要做進(jìn)一步研究。氮素是微生物生長必不可少的營養(yǎng)元素，Gardiner 等[24]研究表明，硝酸鹽的存在會抑制DON 的合成，而銨鹽能刺激DON 的合成，與本研究結(jié)果一致。

培養(yǎng)條件（時(shí)間、溫度和初始pH）對菌株產(chǎn)毒的影響較大，低初始pH 雖然能誘導(dǎo)DON 及乙?；疍ON 的積累，但不適合真菌的生長發(fā)育[25]。本研究表明，受試菌株最佳產(chǎn)毒的初始pH 為5；環(huán)境溫度過高或過低都可能導(dǎo)致代謝通路的改變、酶活力的喪失，從而影響關(guān)鍵基因的表達(dá)[26]，菌體的最適生長溫度和最佳產(chǎn)毒溫度不一致。師雯等[27]報(bào)道，禾谷鐮刀菌的最適生長溫度為25 ℃，最佳產(chǎn)毒溫度為30 ℃。本研究中受試菌株的最適生長溫度為25 ℃，最佳產(chǎn)毒溫度為28 ℃，這種差異可能是由菌株和培養(yǎng)基不同造成。本研究表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，DON 和15-ADON 的產(chǎn)量均先增加后降低，與徐華等[28]的研究結(jié)果一致。培養(yǎng)時(shí)間過長造成DON和15-ADON產(chǎn)量下降，推測是由于后期培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，細(xì)菌可能將毒素作為營養(yǎng)物質(zhì)，將其分解利用，參與其他代謝途徑以保護(hù)菌體自身安全[29]，其機(jī)理還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

響應(yīng)面法能夠同時(shí)評估多個(gè)因素的影響，以及它們之間的相互作用。近年，Wu等[30]采用響應(yīng)面法評估了初始pH、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度對DON和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）產(chǎn)量的影響，表明3個(gè)因素對2種毒素的產(chǎn)量均有顯著影響，其影響大小表現(xiàn)為初始pH>培養(yǎng)時(shí)間>培養(yǎng)溫度，且3 個(gè)影響因素間均存在交互作用。本研究結(jié)果證明，培養(yǎng)時(shí)間和初始pH 間的交互作用對DON產(chǎn)量影響顯著，其他交互作用不顯著，這種差異可能是由于菌株或培養(yǎng)基的差異造成。對于15-ADON，培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度間的交互作用對其產(chǎn)量有顯著影響。本研究利用響應(yīng)面法優(yōu)化出產(chǎn)DON的最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)時(shí)間22 d，培養(yǎng)溫度26.3 ℃，初始pH 6.35，此條件培養(yǎng)后DON 產(chǎn)量達(dá)5 739.69 μg·L?1；產(chǎn)15-ADON 的最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)時(shí)間21 d，培養(yǎng)溫度26.3 ℃，初始pH 5.58，此條件培養(yǎng)后的15-ADON 產(chǎn)量達(dá)10 453.41 μg·L?1；實(shí)際培養(yǎng)結(jié)果均與理論預(yù)測值相近。

本研究針對目前關(guān)于DON 及衍生物的研究聚焦于復(fù)雜固體基質(zhì)，難以測量菌絲生長情況、控制營養(yǎng)成分比例和環(huán)境酸堿度等問題，采用液體培養(yǎng)基通過單因素和響應(yīng)面法系統(tǒng)研究了禾谷鐮刀菌產(chǎn)DON和DON衍生物的主要影響因素，結(jié)果表明，培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分（碳源和氮源：葡萄糖、乙酸鹽、KNO3、NH4H2PO4）和培養(yǎng)條件（溫度、pH 和培養(yǎng)時(shí)間）對禾谷鐮刀菌生長和DON 及其衍生物的產(chǎn)生均有不同程度的影響，且不同因素之間具有顯著的交互作用，研究結(jié)果可為DON 類真菌毒素的防控提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。