基于BSA-seq結(jié)合連鎖分析發(fā)掘大豆莢粒性狀QTLs及候選基因

孫亞倩， 陳士亮， 褚佳豪， 李喜煥*， 張彩英*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室，華北作物種質(zhì)資源研究與利用教育部重點實驗室，河北 保定 071001；2.承德市農(nóng)林科學(xué)院，河北 承德 067000）

大豆是重要糧油作物，提供了全球50%以上的食用油和25%以上的植物蛋白[1]。然而，大豆單產(chǎn)水平和單位面積經(jīng)濟效益較其他農(nóng)作物而言相對較低，亟需進一步提高以滿足日益增長的需求。豆莢和籽粒是菜用和粒用大豆重要的產(chǎn)量相關(guān)性狀，直接影響單位面積產(chǎn)量和經(jīng)濟效益[2]。莢粒性狀還是菜用和粒用大豆最重要的外觀品質(zhì)性狀，對其商品價值具有重要影響。因此，研究莢粒性狀對提高大豆產(chǎn)量、品質(zhì)、商品價值和經(jīng)濟效益等具有重要意義。

大豆莢粒性狀包括莢長、莢寬、莢重、粒長、粒寬和粒重等，這些性狀屬于數(shù)量性狀，且已獲得少數(shù)控制其遺傳位點及候選基因。Niu等[3]獲得59個粒長、粒寬和粒厚等性狀QTLs，位于20條染色體；Xie 等[4]通過精細(xì)定位6 號染色體籽粒大小QTLs獲得8個候選基因；Dargahi等[5]獲得16個粒長、粒寬和粒厚QTLs，位于9 條染色體，表型貢獻率7.4%~18.4%；Yang 等[6]檢測到60 個籽粒性狀QTLs，位于除5 和19 號以外的18 條染色體；Teng等[7]研究發(fā)現(xiàn)，5 個粒長QTLs 位于7、12、13 和17號染色體，3 個粒厚QTLs 位于9、12 和13 號染色體，5 個粒寬QTLs 位于12、13 和17 號染色體；Cui等[8]獲得30 個籽粒性狀QTLs，位于12 條染色體，包括1 個多環(huán)境下的一因多效QTL；Hina 等[9]認(rèn)為，6、10、13和20號染色體存在籽粒性狀QTLs 熱點區(qū)；Kumawat 等[10]獲得53 個籽粒大小QTLs，位于除3、14和18號以外的17條染色體。

目前，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，混合群體分離測序（bulked segregant analysis sequencing，BSA-Seq）因無需構(gòu)建分子遺傳連鎖圖譜，在重要性狀遺傳位點發(fā)掘中越來越受到重視[11?12]。張之昊等[13]采用BSA-seq 技術(shù)挖掘大豆的多小葉基因，經(jīng)SNPindex 算法獲得11號染色體的3個關(guān)聯(lián)區(qū)域，總長度3.42 Mb，包含701 個基因；曾維英等[14]采用BSA-seq 技術(shù)挖掘大豆抗豆卷葉螟基因，經(jīng)SNPindex 算法獲得329 個基因，位于7、16 和18 號染色體；刁衛(wèi)楠等[15]通過BSA-seq 技術(shù)將控制西瓜黃色果肉的主效QTLs 定位于6 號染色體，并結(jié)合基因注釋和表達分析獲得5 個候選基因；Zhao等[16]利用BSA-seq 方法發(fā)掘到水稻3 號染色體控制粒長的基因熱點區(qū)，并通過基因編輯技術(shù)證實了粒長基因；Zhang 等[17]利用BSA-seq 方法獲得3 個水稻株高QTLs、2 個穗長QTLs 和4 個抽穗期QTLs。

綜上，盡管目前已有關(guān)于大豆莢粒性狀遺傳位點發(fā)掘與相關(guān)基因研究，但多基于二代分子標(biāo)記連鎖定位方法獲得，因圖譜密度和飽和度較低，所得連鎖標(biāo)記及基因數(shù)目少，且很難在育種實踐中應(yīng)用。鑒于此，本研究基于大豆重組自交系群體（recombinant inbred line, RIL）在多種環(huán)境條件下的莢粒性狀（莢長、莢寬、莢重、粒長、粒寬和粒重），篩選極端家系并構(gòu)建2個混池，通過BSA-seq技術(shù)發(fā)掘控制莢粒性狀的遺傳位點，結(jié)合前期通過連鎖定位方法獲得的該群體QTLs[18]，進一步發(fā)掘在多環(huán)境條件下、2種方法同時能檢測到的一因多效遺傳位點；同時結(jié)合RIL群體親本莢粒不同發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選候選基因，為開展大豆莢粒性狀分子遺傳改良和遺傳基礎(chǔ)解析提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試大豆重組自交系群體（C813×KN7，F(xiàn)6:8，193個家系）[18]由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆遺傳育種課題組提供，其親本C813為大莢大粒菜用大豆優(yōu)異種質(zhì)（鮮莢長 5.0 cm、鮮莢寬1.3 cm、鮮莢重2.2 g、鮮粒長1.4 cm、鮮粒寬0.8 cm、鮮粒重0.6 g），KN7 為小莢小粒育成品種（鮮莢長4.2 cm、鮮莢寬1.1 cm、鮮莢重1.4 g、鮮粒長1.2 cm、鮮粒寬0.8 cm、鮮粒重0.4 g）。

1.2 試驗方法

1.2.1大豆重組自交系群體種植 供試大豆重組自交系群體分別于2020、2021 年種植在4 種環(huán)境條件下，即2021 年保定（E1）、2020 年保定（E2）、2020 年石家莊鹿泉（E3）、2020 年廊坊文安（E4），田間試驗采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，行長3 m，行距0.5 m，株距10 cm，3次重復(fù)，田間種植和管理參考Chen等[18]方法。

1.2.2大豆重組自交系群體莢粒性狀鑒定 待大豆重組自交系群體生長至R6~R7 期，取植株中部生長一致的標(biāo)準(zhǔn)二粒莢10 個，測定其莢長（pod length, PL）、莢寬（pod width, PW）和莢重（pod weight, PWT），重復(fù)3 次[18]；隨后剝?nèi)デv皮，將所有籽粒置于SC-G種子自動分析系統(tǒng)（杭州萬深檢測科技有限公司）樣品板上，分析粒長（seed length,SL）、粒寬（seed width, SW）和粒重（seed weight,SWT）[2,18-20]。

1.2.3重組自交系群體莢粒性狀極端家系篩選根據(jù)供試大豆重組自交系群體各家系在不同環(huán)境條件下莢粒性狀的綜合表現(xiàn)，分別選擇莢長>4.5 cm且莢寬>1.2 cm的20個大莢大粒極端家系和莢長<4.5 cm 且莢寬<1.2 cm 的20個小莢小粒極端家系，用于BSA-seq發(fā)掘控制大豆莢粒性狀QTLs。

1.2.4大豆莢粒性狀混池BSA-seq 分別提取上述入選的家系以及RIL群體親本（C813和KN7）基因組DNA，并將其按照性狀分類，等量混合成2個混池——大莢大粒池（large pool，LP）和小莢小粒池（small pool，SP），分別含有20 個家系。將LP、SP、C813 和KN7 的DNA 送廣州基迪奧生物科技有限公司完成BSA-seq 分析，測序深度為30×，參考基因組為Williams82 v2.0，測序質(zhì)量通過Q20（高通量測序中，錯誤率低于1%的堿基百分比）和Q30（高通量測序中，錯誤率低于0.1%的堿基百分比）等進行評估。

另外，為保證結(jié)果可靠性，按照以下標(biāo)準(zhǔn)篩選SNP 和Indel 標(biāo)記：①入選標(biāo)記在親本間存在差異，且符合RIL 群體分離方式；②RIL 群體親本測序深度大于閾值；③標(biāo)記在2 個混池中均不缺失；④每個混池測序深度需大于10×且小于500×；⑤至少1 個混池的SNP 指數(shù)（SNP index，SNPI）在0.3~0.7之間。

1.2.5發(fā)掘莢粒性狀遺傳位點的算法 本研究采用3 種算法進行莢粒性狀遺傳位點發(fā)掘，包括SNP index 算法、歐氏距離（Euclidean distance,ED）算法和G-statistic 算法[13,21]；置信水平分別設(shè)為0.95和0.99，3種算法的計算公式如下。

①SNP index算法。

式中，SNPI為SNP 指數(shù)，ρ 為位點在混池中的深度。

②ED算法。

式中，mut與wt為隱性和顯性混池，A、C、G、T為各等位標(biāo)記位點的覆蓋深度。

③G-statistic算法。

式中，O為等位深度的觀測值，E為等位深度的期望值，ln為自然對數(shù)，i為等位基因數(shù)目。

1.2.6BSA-seq 一致性區(qū)間候選基因篩選 首先，比較供試大豆RIL群體BSA-seq不同算法關(guān)聯(lián)結(jié)果，篩選一致性關(guān)聯(lián)區(qū)間；然后，在一致性區(qū)間內(nèi)尋找候選基因，并結(jié)合基因注釋、基因DNA 水平SNP 等位變異以及RNA 水平表達分析，篩選大豆莢粒性狀相關(guān)基因。候選基因查找及其基因注釋參考大豆測序基因組Williams82（Glyma2.0）（https://www.soybase.org/），基因的RNA 水平表達分析采用供試RIL群體親本C813和KN7的豆莢5個不同發(fā)育時期（Pod-T1~Pod-T5）和籽粒3 個不同發(fā)育時期（Seed-T1~Seed-T3）的基因表達轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[2]。

1.2.7表型數(shù)據(jù)分析 利用Microsoft Excel 2017

統(tǒng)計軟件的成組數(shù)據(jù)t檢驗方法，對供試RIL群體極端家系在單一環(huán)境條件下以及多種環(huán)境條件下的6 個莢粒相關(guān)性狀（莢長、莢寬、莢重、粒長、粒寬和粒重）進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆重組自交系群體BSA-seq 極端家系的遴選

通過分析供試大豆重組自交系群體2 年4 種環(huán)境條件下的莢長、莢寬、莢重、粒長、粒寬和粒重，篩選出40 份極端家系構(gòu)成2 個混池——LP 和SP。分析2 個混池不同環(huán)境條件下的莢粒性狀（表1）發(fā)現(xiàn)，2 個混池在單一環(huán)境條件下的莢長、莢寬、莢重、粒長、粒寬和粒重均存在極顯著差異，并且在多環(huán)境條件下的莢粒性狀亦存在顯著或極顯著差異，為進一步利用BSA-seq 方法發(fā)掘控制其遺傳位點奠定了重要基礎(chǔ)。

表1 大豆RIL群體BSA-seq極端家系不同環(huán)境莢粒性狀遺傳差異Table 1 Genetic variation of extreme RIL lines on pod and seed traits for BSA-seq under different environments

2.2 BSA-seq測序質(zhì)量及SNP與Indel分析

通過分析2 個混池及其親本材料的BSA-seq測序質(zhì)量（表2）發(fā)現(xiàn)，過濾后的有效數(shù)據(jù)量為30 Gb，Q20 在97.2%以上，Q30 在92.5%以上，G和C 堿基含量為36.32%~36.58%，過濾后的總讀段為2 Gb；與參考基因組的平均比對效率在98%以上，且基因組覆蓋度深，4 個樣品的10×基因組覆蓋率均在94%以上，20×基因組平均覆蓋率則在80%以上，說明4 個樣品的BSA-seq 測序數(shù)據(jù)充足且質(zhì)量高，可進行后續(xù)BSA-seq 關(guān)聯(lián)位點分析。

表2 兩個混池及其親本BSA-seq測序質(zhì)量分析Table 2 Quality analysis of BSA-seq of two pools and soybean RIL parents

進一步分析BSA-seq 測序SNP（表3）與Indel（表4），共獲得162萬~241萬個SNP，其中位于外顯子區(qū)的有6.2 萬~9.1 萬個，基因上游的有9.6 萬~14.4萬個，引起非同義突變的有3.5萬~5.1萬個，引起提前終止的有726~1 089個，引起終止密碼子丟失的有144~223個；同時獲得30萬~43萬個Indel，其中位于外顯子區(qū)的有3 823~5 338個，基因上游的有3.0 萬~4.4 萬個，引起移碼缺失的有1 128~1 534個，移碼插入的有987~1 314個，引起提前終止的有69~95 個，引起終止密碼子丟失的有10~18個。

表3 兩個混池及其親本BSA-seq測序SNP數(shù)量與質(zhì)量分析Table 3 SNP number and quality analysis of BSA-seq of two pools and soybean RIL parents

表4 兩個混池及其親本BSA-seq測序Indel數(shù)量與質(zhì)量分析Table 4 Indel number and quality analysis of BSA-seq of two pools and RIL parents

2.3 大豆莢粒性狀BSA-seq遺傳位點發(fā)掘

通過分析篩選后的SNP 和Indel標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，符合入選標(biāo)準(zhǔn)的總標(biāo)記數(shù)量為763 727個，其中包括SNP 標(biāo)記658 186 個、Indel 標(biāo)記105 541 個，并以17、9和3號染色體入選標(biāo)記數(shù)量最多。在此基礎(chǔ)上，利用上述SNP 和Indel 標(biāo)記分別通過SNPindex、ED 和G-statistic 算法發(fā)掘莢粒性狀關(guān)聯(lián)位點。

2.3.1SNP-index 算法發(fā)掘遺傳位點分析 采用SNP-index 算法分析與莢粒性狀關(guān)聯(lián)位點，結(jié)果（圖1A）表明，在置信度為0.95 時，獲得27 個關(guān)聯(lián)區(qū)域，位于15 條染色體（除5、8、10、11 和18 號外），其中7 號染色體包括7 個區(qū)域，16 和20 號染色體各包括3 個區(qū)域。同時發(fā)現(xiàn)，在置信度為0.99 時，獲得5 個關(guān)聯(lián)區(qū)域，分別位于5 條染色體（1、4、7、12和19號）。

圖1 大豆莢粒性狀不同算法關(guān)聯(lián)區(qū)域Fig. 1 Associated regions of soybean pod and seed traits via different methods

2.3.2ED算法發(fā)掘遺傳位點分析 采用ED方法分析與莢粒性狀關(guān)聯(lián)的位點，結(jié)果（圖1B）表明，在置信度0.95 時，獲得41 個關(guān)聯(lián)區(qū)域，分別位于17 條染色體（除5、8 和11 號外），其中7 和20 號染色體各包括5 個區(qū)域，6、10、13、14、16 和20 號染色體均包括3個區(qū)域；在置信度0.99時，獲得15個關(guān)聯(lián)區(qū)域，分別位于9 條染色體（1、3、4、7、12、13、15、19 和20 號），其中7 和20 號染色體包括6 個區(qū)域，4號染色體包括2個區(qū)域。

2.3.3G-statistic 算法發(fā)掘遺傳位點分析 采用G-statistic 方法分析與莢粒性狀關(guān)聯(lián)的位點，結(jié)果（圖1C）表明，在置信度0.95 時，獲得51 個關(guān)聯(lián)區(qū)域，位于18條染色體（除5和18號外），其中7號染色體包括10 個區(qū)域，20 號染色體包括8 個區(qū)域；在置信度0.99時，獲得16個關(guān)聯(lián)區(qū)域，分別位于9條染色體（1、3、6、7、12、15、17、19 和20 號），其中7 號染色體包括6 個區(qū)域，3 和20 號染色體包括2個區(qū)域。

2.3.43 種算法共關(guān)聯(lián)遺傳位點分析 綜合分析上述3 種算法獲得的關(guān)聯(lián)區(qū)域（表5），在置信度0.95 時，獲得27 個一致性關(guān)聯(lián)區(qū)域，位于15 條染色體（除5、8、10、11和18號外）；在置信度0.99時，獲得4 個一致性關(guān)聯(lián)區(qū)域，分別位于4 條染色體（1、7、12 和19 號），其中15 個基因位于1 號染色體，57 個基因位于7 號染色體，82 個基因位于12號染色體，182個基因位于19號染色體。

表5 大豆莢粒性狀不同算法一致性關(guān)聯(lián)位點Table 5 Genetic loci of soybean pod and seed traits via different methods

2.4 BSA-seq與連鎖定位一致性遺傳位點發(fā)掘

綜合分析本研究采用BSA-seq 方法獲得的遺傳位點以及課題組前期采用連鎖定位方法（SoySNP6K 分析）獲得的遺傳位點[18]發(fā)現(xiàn)，在7 號染色體的10.45~11.59 Mb 和12.96~13.54 Mb 區(qū)段，19 號染色體的47.63~48.50 Mb 和49.61~49.91 Mb 區(qū)段以及20 號染色體的35.83~36.24 Mb 區(qū)段存在一致性。并且發(fā)現(xiàn)，20 號染色體SNP 標(biāo)記ss715637629（物理位置為35 836 361），19 號染色體SNP 標(biāo)記ss715635705（物理位置為47 636 564）、ss715635755（物理位置為48 040 350）、ss715635827（ 物理位置為 48 375 196）、ss715635844（ 物理位置為 48 501 612）、ss715635790（ 物理位置為 48 196 242）、ss715635952（物理位置為49 618 939）和ss715635964（物理位置為49 699 850）在連鎖定位和BSA-seq分析中同時被檢測到，一方面證實了本研究結(jié)果的可靠性，另一方面為菜用和粒用大豆莢粒性狀分子遺傳改良提供了新的信息。

2.5 大豆莢粒性狀候選基因篩選

為進一步篩選大豆莢粒性狀候選基因，本研究在上述3 種算法0.99 置信水平共定位的染色體區(qū)段尋找到336 個莢粒性狀候選基因的SNP 等位變異（表6），有40 個基因在DNA 水平存在外顯子非同義突變，暗示其可能與大豆莢粒性狀有關(guān)。

表6 BSA-seq一致性區(qū)間存在外顯子非同義突變的候選基因Table 6 Candidate genes in the consistent regions with non-synonymous mutations in gene exons

在此基礎(chǔ)上，利用供試RIL 群體親本C813 和KN7的豆莢和籽粒不同發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析上述40 個基因，結(jié)果（圖2、圖3）發(fā)現(xiàn)，有15 個基因在豆莢和籽粒中表達量較高，其中包括Glyma.07G108700、Glyma.19G220000、Glyma.19G222200、Glyma.19G222300和Glyma.19G222400等；候選基因Glyma. 19G222200、Glyma. 19G222300和Glyma.19G224400隨豆莢發(fā)育進程表達量呈現(xiàn)增加趨勢。由此可見，上述15個候選基因在DNA水平存在外顯子非同義突變，而且RNA 水平在豆莢中表達量較高，故認(rèn)為其與大豆莢粒性狀形成具有密切關(guān)系，尤其是隨著豆莢發(fā)育進程表達量呈現(xiàn)增加趨勢的候選基因Glyma.19G222200、Glyma.19G222300和Glyma.19G224400，可用于基因克隆以進一步證實其在大豆莢粒發(fā)育過程中的生物學(xué)功能。

圖2 大豆莢粒性狀候選基因在C813中的表達分析Fig. 2 Expressions of candidate genes related to soybean pod and seed traits in C813

圖3 大豆莢粒性狀候選基因在KN7中的表達分析Fig. 3 Expressions of candidate genes for soybean pod and seed traits in KN7

3 討論

3.1 大豆莢粒性狀一致性遺傳位點的發(fā)掘與利用

BSA策略可用于存在遺傳差異的多種群體，且可與傳統(tǒng)定位或關(guān)聯(lián)方法結(jié)合使用[21]。郭微[22]利用BSA-seq結(jié)合連鎖定位方法將水稻耐鹽堿QTLs縮小至2 號染色體的2 個區(qū)段；李君[23]利用BSAseq結(jié)合連鎖定位方法尋找玉米圓斑病遺傳位點；Vogel等[24]結(jié)合BSA-seq與連鎖定位方法獲得南瓜疫霉根腐病和冠腐病QTLs。本研究利用BSA-seq對大豆RIL 群體極端家系構(gòu)建的2 個混池進行分析，經(jīng)綜合3 種算法關(guān)聯(lián)分析，在0.95 置信水平將控制莢粒性狀遺傳位點定位在15 條染色體；同時，本課題組前期曾利用該RIL 群體，通過連鎖定位方法將控制莢粒性狀遺傳位點定位在7 條染色體，表型貢獻率5.28%~17.30%[18]。進一步比較BSA-seq 結(jié)果與連鎖定位結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者在7、19和20 號染色體存在共定位區(qū)間，且19 和20 號染色體的多個SNP 標(biāo)記被2 種策略同時檢測到，充分證實了本研究結(jié)果可靠性和真實性。

關(guān)于20 號染色體控制大豆莢粒性狀遺傳位點，Hina 等[9]曾在該染色體的36.18~38.30 Mb 和35.92~38.14 Mb 區(qū)段檢測到控制粒長與長寬比QTLs；Zhao 等[25]曾在該染色體35.23 Mb 附近檢測到控制粒長QTLs；本課題組前期曾在該染色體35.84~36.23 Mb 區(qū)段檢測到多環(huán)境、多性狀共定位一因多效QTL（ss715637668~ss715637629），可同時控制大豆莢重、粒重、粒長和籽粒面積，解釋8.92%~17.30%表型變異，而且在相應(yīng)性狀BLUP值的連鎖定位中同時也被檢測到，解釋12.07%~16.81%表型變異[18]。本研究通過BSA-seq 技術(shù)，將控制大豆莢粒性狀遺傳位點定位到20 號染色體的34.99~38.10 Mb 區(qū)段，與上述連鎖定位存在一致性區(qū)間。并且，為進一步利用上述一致性SNP標(biāo)記，本課題組將該標(biāo)記轉(zhuǎn)換為PCR標(biāo)記，經(jīng)擴增供試RIL 群體親本C813 和KN7，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，能夠按照預(yù)先設(shè)計擴增出目的條帶（C813 可擴增500 bp 左右目的條帶，而KN7 中沒有該目的條帶），繼續(xù)擴增RIL 群體2 個混池（LP 和SP）的40個家系，發(fā)現(xiàn)LP 混池中有15 個家系可擴增出目的條帶，而SP 混池中僅有4 個家系可擴增出目的條帶，進一步擴增RIL群體其他家系將其劃分為2種基因型，且與預(yù)期結(jié)果基本一致，既證實了本研究結(jié)果的真實性，也為大豆莢粒性狀分子遺傳改良提供了技術(shù)支撐。

3.2 控制大豆莢粒性狀候選基因分析

關(guān)于大豆莢粒性狀候選基因，目前研究報道較少。Wang 等[1]獲得了可同時影響籽粒大小、脂肪和蛋白質(zhì)含量的功能基因GmSWEET10a和GmSWEET10b，超表達2 個基因均可顯著增加百粒重和脂肪含量；而沉默基因后則可顯著降低百粒重和脂肪含量。最近，王明曉等[26]將控制豆科植物種子大小的基因劃分為3 類，即轉(zhuǎn)錄因子類（如WRKY、AP2/ERF 和TIFY 家族等）、植物激素類（生長素、油菜素內(nèi)酯、赤霉素和細(xì)胞分裂素等）和其他因子類（細(xì)胞色素P450 家族、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶抑制因子、肌醇單磷酸酶、ABC 轉(zhuǎn)運蛋白等），但同時也指出，豆科植物種子大小非常復(fù)雜，目前有關(guān)其控制基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍很欠缺。鑒于此，本研究在前述多年、多點鑒定RIL 群體6 個莢粒性狀，并分別通過BSAseq 和連鎖定位方法發(fā)掘遺傳位點的基礎(chǔ)上，進一步尋找控制莢粒性狀候選基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一致性關(guān)聯(lián)區(qū)間內(nèi)有336 個基因，并有40 個基因的外顯子存在非同義突變，其中包括轉(zhuǎn)錄因子基因Glyma. 19G221700、Glyma. 19G222200、Glyma.19G224700和Glyma.19G236900以及其他因子類基因Glyma.19G219500、Glyma.19G224400和Glyma.19G226000等。

在上述候選基因中，Glyma.19G222200編碼蛋白屬于MYB 轉(zhuǎn)錄因子，該基因在供試大豆RIL群體親本和混池間存在2 個非同義突變，且基因表達量隨大豆莢粒發(fā)育而呈現(xiàn)上升趨勢。擬南芥MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因KUODA1參與植物葉片細(xì)胞的擴張，該基因突變后，可使轉(zhuǎn)基因植株的葉片顯著變小，而恢復(fù)植株的葉片與野生型基本相同，且基因超表達植株的葉片面積顯著增大[27]；擬南芥MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因DRMY1參與植物細(xì)胞的擴張過程，該基因突變可引起一系列參與植物細(xì)胞壁生物合成與重塑的基因表達量發(fā)生改變，并使轉(zhuǎn)基因植株的角果顯著變短[28]。因此，本研究推測MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因Glyma.19G222200可能通過影響其下游一系列與大豆莢粒生長發(fā)育相關(guān)基因的表達來控制莢粒發(fā)育，因而具有重要研究價值。

另外，植物體內(nèi)的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白不僅具有運輸亞硝酸鹽的重要功能，而且可運輸生長素、赤霉素、脫落酸和茉莉酸等多種物質(zhì)，因而對植物正常生長發(fā)育至關(guān)重要。魏一鳴[29]通過研究玉米EMS 突變體發(fā)現(xiàn)，硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因ZmNPF7.9發(fā)生單堿基的非同義突變（G/A 突變），可導(dǎo)致玉米籽粒變小，頂部凹陷且粒重下降；進一步分析發(fā)現(xiàn)，該突變體植株參與糖酵解、碳代謝及氨基酸合成的關(guān)鍵基因表達量降低，推測其通過影響籽粒中的營養(yǎng)物質(zhì)運輸和代謝進而導(dǎo)致玉米籽粒變小、粒重下降。在本研究中，候選基因Glyma.19G224400編碼蛋白屬于硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白家族，該基因在供試大豆RIL 群體的2 個親本間以及混池間存在3 個非同義突變，且基因表達量隨大豆莢粒發(fā)育進程呈現(xiàn)上升趨勢，因而推測其可能通過參與大豆莢粒中營養(yǎng)物質(zhì)以及激素類物質(zhì)運輸進而影響莢粒發(fā)育。綜上，本研究認(rèn)為，上述候選基因在DNA 水平存在外顯子SNP 非同義突變，而且隨大豆莢粒生長發(fā)育呈現(xiàn)上調(diào)表達，說明其與莢粒生長發(fā)育密切相關(guān)，為進一步研究基因生物學(xué)功能奠定了重要基礎(chǔ)。