內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激預(yù)適應(yīng)對LPS誘導(dǎo)的山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)的保護(hù)作用

郜康康,扆妍妍,趙一騰,林鵬飛,陳華濤*,靳亞平*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,楊凌 712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生物技術(shù)重點實驗室,楊凌 712100)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)是真核細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、折疊和運輸?shù)募?xì)胞器。當(dāng)細(xì)胞受到各種不良刺激時,ER的蛋白質(zhì)組裝功能被擾亂,ER腔中出現(xiàn)大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)激活,從而引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)[1]。UPR主要通過肌醇需求激酶1(inositol-requiring kinase 1,IRE1)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor,ATF6)和蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase-like ER kinase,PERK)3條通路使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)恢復(fù)穩(wěn)態(tài)[2]。UPR是一種保守性的細(xì)胞自我保護(hù)措施,早期的UPR能及時有效的逆轉(zhuǎn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,增強(qiáng)細(xì)胞的存活能力,是細(xì)胞應(yīng)對適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時啟動的防御性反應(yīng)[3]。當(dāng)出現(xiàn)過度的ERS之后,則會引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)(endoplasmic reticulum-overload response,EOR),EOR主要通過激活NF-κB信號通路,誘導(dǎo)白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、單核細(xì)胞趨化因子等炎性因子的表達(dá),進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡、細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞分化等相關(guān)信號途徑[4]。有研究表明,在非酒精性脂肪肝形成過程中,UPR可導(dǎo)致炎性小體激活,當(dāng)出現(xiàn)過度的ERS之后,甚至出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象[5]。此外,在神經(jīng)炎癥和腸道炎癥過程中也伴隨著ERS的發(fā)生,越來越多的研究者將ERS作為炎癥的一個新的研究靶點[6]。

反芻動物分娩后子宮出現(xiàn)細(xì)菌感染和組織損傷,是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎發(fā)生的主要原因,給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失;而子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞是抵御細(xì)菌入侵的第一道防線,它們是對抗病原體的物理屏障,通過觸發(fā)先天免疫反應(yīng)在防御大多數(shù)炎癥性疾病過程中扮演著關(guān)鍵角色[7]。反芻動物子宮被革蘭陰性菌(如大腸桿菌)感染后,導(dǎo)致的反芻動物子宮內(nèi)膜炎通常是由脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)介導(dǎo)的[8]。大腸桿菌LPS可通過啟動子宮內(nèi)膜細(xì)胞的免疫反應(yīng)引起子宮內(nèi)膜炎癥[9]。LPS可被細(xì)胞表面表達(dá)的Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)識別,觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián),導(dǎo)致核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和含NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎性小體通路的激活,誘導(dǎo)IL-6和TNF-α等炎癥介質(zhì)的分泌[10-12]。本課題組的前期研究表明,ERS參與LPS刺激誘導(dǎo)的山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。有趣的是,在內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)中,抑制ERS和NF-κB信號通路也能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[14]。此外,在LPS刺激誘導(dǎo)的小鼠子宮內(nèi)膜炎模型中,單磷酸腺苷活化蛋白激酶的激活能夠抑制ERS相關(guān)的TXNIP/NLRP3炎癥小體活化[15]。

大量的研究證實,ERS作為多種應(yīng)激源的共同通路,通過UPR與細(xì)胞內(nèi)炎性反應(yīng)相偶聯(lián),參與機(jī)體多種炎癥性疾病的病理過程,但目前關(guān)于ERS在反芻動物子宮內(nèi)膜炎癥反應(yīng)調(diào)控中的作用機(jī)制仍未被完全闡明。因此,本研究以山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(goat endometrial epithelial cells,gEECs)為試驗材料,使用LPS處理構(gòu)建體外細(xì)胞炎性反應(yīng)模型,探究ERS在LPS誘導(dǎo)的gEECs炎性反應(yīng)中的作用,為深入解析反芻動物子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

衣霉素(tunicamycin,TM,ab120296)購自英國Abcam公司;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,L2630)和4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA,1821-12-1)購自美國Sigma公司;DMEM/F-12細(xì)胞培養(yǎng)液(SH30 023.01B)購自美國Hyclone公司;胎牛血清(Z7186FBS-500)購自美國ZETA LIFE公司;RNA Trizol試劑(9109)購自日本TaKaRa公司;ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Q311-02)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AG11711)購自湖南艾科瑞生物工程有限公司;全蛋白提取試劑盒(KGP2100)和BCA蛋白含量檢測試劑盒(KGP902)購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;Anti-β-actin抗體(23660-1-AP)和Anti-NLRP3抗體(19771-1-AP)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;Anti-Phospho-NF-κB P65抗體(3033 T)和Anti-NF-κB P65抗體(8242)購自美國CST公司;Anti-TLR4抗體(sc-293072)購自美國Santa Cruz生物技術(shù)公司;HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(PB001)和HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(PB002)購自陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司;蛋白Marker(M221-01)和ECL發(fā)光液(DE2002)購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

永生化gEECs細(xì)胞系為本實驗室前期構(gòu)建并鑒定保存[16]。將本實驗室保存的30代左右的gEECs置于培養(yǎng)條件為37 ℃,含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,用含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞長至匯合度達(dá)80%～90%時進(jìn)行傳代。

1.3 體外細(xì)胞模型構(gòu)建

按照本實驗室前期已經(jīng)驗證對細(xì)胞活性無影響的試驗方法,構(gòu)建不同的體外細(xì)胞模型[17-19]。即將gEECs按照2×105個·孔-1接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞長至匯合度80%左右時,1)使用LPS(5 μg·mL-1)、TM(0.5 μmol·L-1)和4-PBA(1 mmol·L-1)分別單獨處理6 h后收集細(xì)胞樣品。2)使用TM(0.5 μmol·L-1)和4-PBA(1 mmol·L-1)分別預(yù)處理2 h,再用LPS(5 μg·mL-1)處理6 h,收集細(xì)胞樣品,進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.4 實時熒光定量PCR

取“1.3”中收集的各組細(xì)胞樣品,用Trizol進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取,并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。根據(jù)ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書在無RNA酶且全程避光的條件下利用Bio-Rad CFX96 PCR儀進(jìn)行RT-qPCR檢測。試驗所需引物見表1。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,循環(huán)39次。采用2-ΔΔCt方法計算試驗結(jié)果,以GAPDH為內(nèi)參基因。

表1 目的基因片段引物序列

1.5 Western blot

取“1.3”中收集的各組細(xì)胞樣品,使用細(xì)胞蛋白裂解Buffer按照細(xì)胞全蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞全蛋白,利用BCA蛋白含量檢測試劑盒測定蛋白濃度,然后加入5×Loading Buffer,充分混勻煮沸15 min。蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳,電泳結(jié)束后,將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,置于含10%脫脂奶粉的TBST中封閉2 h。經(jīng)TBST洗滌后,分別置于Phospho-NF-κB P65(1∶1 000),NF-κB P65(1∶1 000),TLR4(1∶200),NLRP3(1∶1 000)和β-actin(1∶5 000)一抗中4 ℃孵育過夜;TBST洗滌后,置于HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG或HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG中室溫孵育1 h;TBST洗滌后,置于ECL發(fā)光液中孵育30 s后,使用凝膠成像系統(tǒng)(GBox-Chem-XRQ)拍攝并保存。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié) 果

2.1 TM處理條件篩選

如圖1所示,與對照組相比,TM處理3 h后即可顯著促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路關(guān)鍵基因GRP78和XBP1 mRNA的表達(dá)(P<0.001),但對ATF6 的mRNA表達(dá)無顯著影響(P>0.05)。隨著TM處理時間的增加,當(dāng)TM處理6 h后可以觀察到GRP78、XBP1和ATF6的mRNA表達(dá)量均顯著增加,且XBP1的mRNA表達(dá)量達(dá)到最高(P<0.001)。因此,后續(xù)試驗將TM處理條件選擇為終濃度0.5 μmol·L-1、處理6 h。

RT-qPCR檢測GRP78、XBP1和AFT6 mRNA表達(dá)變化(ns.無顯著性差異;*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001。下同)

2.2 TM處理對gEECs炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響

以本實驗室前期構(gòu)建的體外細(xì)胞炎性反應(yīng)模型(5 μg·mL-1LPS處理gEECs 6 h)為陽性對照,檢測TM對gEECs炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響。與對照組相比,TM處理組gEECs炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α 的mRNA表達(dá)量顯著降低,同時顯著低于LPS處理組炎性細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)量(P<0.01)(圖2)。此外,如圖2所示,TM處理使經(jīng)典炎癥通路關(guān)鍵基因TLR4、NF-κBP65和NLRP3 的mRNA表達(dá)量顯著低于對照組及LPS處理組(P<0.01)。同時,Western blot結(jié)果進(jìn)一步顯示,TM處理顯著抑制了NF-κB P65蛋白的磷酸化和NLRP3蛋白的表達(dá)(P<0.05)(圖3)。

RT-qPCR檢測IL-6、TNF-α、TLR4、NF-κB P65和NLRP3的mRNA表達(dá)水平

圖3 Western blot檢測TM處理后NF-κB P65蛋白磷酸化和NLRP3蛋白表達(dá)水平

2.3 4-PBA處理對gEECs炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響

添加終濃度為1 mmol·L-1的4-PBA處理gEECs 6 h后,檢測炎癥相關(guān)基因的表達(dá)變化[16]。如圖4所示,與對照組相比,4-PBA處理組gEECs炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)量顯著升高,但其表達(dá)量仍顯著低于LPS處理組(P<0.01或P<0.001)。接著,對經(jīng)典炎癥通路關(guān)鍵基因進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖4所示,4-PBA處理組TLR4和NLRP3 的mRNA表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.01),而NF-κBP65 的mRNA表達(dá)量與對照組相比無顯著性差異(P>0.05);同時,對照組和4-PBA處理組炎癥通路相關(guān)基因表達(dá)量均顯著低于LPS處理組(P<0.01)。Western blot顯示出相似的結(jié)果,如圖5所示,4-PBA處理顯著促進(jìn)了NF-κB P65蛋白的磷酸化和NLRP3蛋白的表達(dá),但均顯著低于LPS處理組(P<0.05)。

RT-qPCR檢測IL-6、TNF-α、TLR4、NF-κB P65和NLRP3的mRNA表達(dá)水平

圖5 Western blot檢測4-PBA處理后NF-κB P65蛋白磷酸化和NLRP3蛋白表達(dá)水平

2.4 ERS對LPS誘導(dǎo)的gEECs炎性反應(yīng)的影響

TM或4-PBA預(yù)處理2 h后,再使用LPS刺激,檢測ERS對LPS誘導(dǎo)的gEECs炎性反應(yīng)的影響。如圖6A所示,與LPS單獨處理組相比,TM預(yù)處理顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的gEECs炎性細(xì)胞因子IL-6 mRNA的表達(dá),而4-PBA預(yù)處理則顯著促進(jìn)了LPS誘導(dǎo)的IL-6 mRNA的表達(dá),且3種不同處理組IL-6 mRNA表達(dá)量均顯著高于對照組(P<0.05)。接著,檢測了經(jīng)典炎癥通路關(guān)鍵基因的表達(dá)。如圖6B～D所示,TM預(yù)處理顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的gEECs炎性反應(yīng)中TLR4、NF-κBP65和NLRP3 mRNA的表達(dá)(P<0.05);而4-PBA預(yù)處理則顯著促進(jìn)了TLR4、NF-κBP65和NLRP3 mRNA的表達(dá)(P<0.05)。Western blot結(jié)果進(jìn)一步顯示,TM預(yù)處理顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的NF-κB P65蛋白的磷酸化以及TLR4和NLRP3蛋白的表達(dá)(P<0.05);而4-PBA預(yù)處理則顯著促進(jìn)了NF-κB P65蛋白的磷酸化以及TLR4和NLRP3蛋白的表達(dá)(P<0.05)(圖6E～I(xiàn))。

A～D.RT-qPCR檢測IL-6、TLR4、NF-κB P65和NLRP3的mRNA表達(dá)水平;E～I(xiàn).Western blot檢測磷酸化NF-κB P65蛋白以及TLR4和NLRP3蛋白表達(dá)水平

3 討 論

動物子宮是一個具有復(fù)雜免疫功能的器官,需要在半同種異體胎兒的發(fā)育過程中維持免疫耐受環(huán)境,同時保持其監(jiān)測和響應(yīng)感染因子的能力[20]。然而,分娩后子宮處于一種開放性狀態(tài),細(xì)菌感染和組織損傷等可引起子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生,給養(yǎng)殖業(yè)帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失[21]。目前大量研究證實子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞是抵御病原體入侵的第一道防線,子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的Toll樣受體(toll-like receptors,TLRs)能夠檢測到LPS等病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP),激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路等炎癥通路對其產(chǎn)生應(yīng)答,對機(jī)體起保護(hù)作用[22]。此外,NOD樣受體(NOD-like Receptors,NLRs)也存在于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中,參與子宮抵抗病原微生物入侵的反應(yīng)[23]。因此,更深入地了解子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞在炎性反應(yīng)中的功能,對反芻動物子宮內(nèi)膜炎的防治來說至關(guān)重要。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)ERS通過多種機(jī)制與炎癥信號通路相偶聯(lián),包括NF-κB通路和JNK通路等,但ERS在反芻動物子宮內(nèi)膜炎中的作用仍未被完全闡明[24]。本研究發(fā)現(xiàn),TM誘導(dǎo)的ERS能夠抑制gEECs中炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá);而用4-PBA處理后則促進(jìn)了IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)。同時,在TM誘導(dǎo)的ERS中,NF-κB P65蛋白的磷酸化和NLRP3蛋白的表達(dá)同樣受到抑制;而4-PBA則促進(jìn)了gEECs中經(jīng)典炎癥通路關(guān)鍵基因的表達(dá)。這些結(jié)果表明,TM誘導(dǎo)的ERS能夠抑制gEECs中炎癥相關(guān)基因的表達(dá),而使用4-PBA處理抑制生理條件下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的程度可能發(fā)揮促炎作用,提示ERS可能參與調(diào)節(jié)山羊子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生和發(fā)展。與本研究結(jié)果一致,ERS也可減輕游離脂肪酸誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥,抑制NF-κB P65的磷酸化和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[25]。

ERS發(fā)生后激活UPR對外界的細(xì)胞不良應(yīng)激進(jìn)行應(yīng)答,UPR信號通路能夠通過對細(xì)胞轉(zhuǎn)錄以及翻譯過程的改變來緩解ERS,以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),促進(jìn)細(xì)胞存活[26]。最近的研究發(fā)現(xiàn),UPR通過ERS誘導(dǎo)的信號通路與免疫反應(yīng)之間的直接串?dāng)_發(fā)揮免疫作用[27]。此外,也有研究發(fā)現(xiàn),TLR4-Myd88信號通路與PERK/eIF2α/CHOP通路的相互作用在壞死性小腸結(jié)腸炎的炎癥發(fā)生中發(fā)揮著重要作用[28]。值得一提的是,作為適應(yīng)性UPR的效應(yīng)器,XBP1s可直接與細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的啟動子結(jié)合調(diào)節(jié)其表達(dá)[29]。在本研究中,作者首先確定了TM處理條件為終濃度0.5 μmol·L-1、處理6 h,此時,發(fā)現(xiàn)XBP1的表達(dá)量最高,同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路關(guān)鍵基因GRP78和ATF6 mRNA的表達(dá)量也顯著升高但并非處于最大值,因此,推測TM可能誘導(dǎo)了適應(yīng)性UPR的發(fā)生。有研究表明,一定程度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能激活適應(yīng)性UPR的發(fā)生,從而激活機(jī)體保護(hù)機(jī)制發(fā)揮保護(hù)作用[30]。此外,Ishikawa等[31]在Sec63和XBP1s失活的基礎(chǔ)上開發(fā)出了腎小管間質(zhì)性腎病的遺傳小鼠模型,該模型呈現(xiàn)間質(zhì)炎癥和進(jìn)行性腎功能不全的癥狀,同時,XBP1s的異位表達(dá)可以減少由Sec63缺失引起的腎間質(zhì)炎癥,顯示出ERS對機(jī)體局部炎癥的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn),TM預(yù)處理顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的gEECs中IL-6 mRNA的表達(dá),同時顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的NF-κB P65蛋白的磷酸化和NLRP3蛋白的表達(dá);而4-PBA預(yù)處理則促進(jìn)了炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。提示TM誘導(dǎo)的ERS預(yù)適應(yīng)激活了適應(yīng)性UPR,從而減輕LPS誘導(dǎo)的gEECs炎性反應(yīng),其可能是通過抑制NF-κB通路和NLRP3炎性小體通路的激活來實現(xiàn)的。這與先前的研究一致,ERS激活UPR對其產(chǎn)生應(yīng)答,能夠抑制炎癥和氧化應(yīng)激,保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受損傷[32]。此外,Ferrè等[33]也發(fā)現(xiàn)ERS能夠促進(jìn)腎炎和膿毒癥等腎病的發(fā)生發(fā)展,導(dǎo)致腎損傷。總之,上述研究證據(jù)提示,ERS在炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中具有雙重作用,它既可以抑制炎癥,也可以促進(jìn)炎癥,造成這一現(xiàn)象的背后的原因仍待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

TM誘導(dǎo)的ERS通過抑制NF-κB通路和NLRP3炎性小體通路的激活抑制LPS誘導(dǎo)的gEECs炎性反應(yīng);4-PBA處理抑制ERS能夠促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的gEECs炎性反應(yīng)。本試驗結(jié)果為揭示ERS在山羊子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生發(fā)展中的作用提供了前期理論基礎(chǔ)。